病毒美国每41人1人感染

01编者按诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力,是全球急性胃肠炎的散发病例和暴发疫情的主要致病原,疾病负担严重.
2013年以来,我国其他感染性腹泻病暴发多以诺如病毒感染为主,尤其自2014年冬季起,诺如病毒感染暴发疫情大幅增加,显著高于历年水平.
为加强对全国诺如病毒感染暴发疫情调查处置和预防控制工作的技术指导,我中心组织专家编写了《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)》.
该指南可供各级疾病预防控制机构、医疗机构和有关单位在开展诺如病毒感染暴发疫情的发现、报告、调查、处置、预防和感染控制等相关工作时参考使用.
编者按·································································································01防治技术指南··························································································01诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)····················································01中国疾病预防控制中心传染病预防控制处2015年11月17日第3卷第37期InfectiousDiseasesReport,IDR总第61期02传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
17th,2015,Vol.
3,No.
37防治技术指南诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)GuidelinesonOutbreakInvestigation,PreventionandControlofNorovirusInfection(2015)摘要诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力,是全球急性胃肠炎的散发病例和暴发疫情的主要致病原,疾病负担严重.
2014年冬季以来,我国诺如病毒暴发疫情大幅增加,显著高于历年水平,主要发生在学校、托幼机构和医疗机构等人群聚集场所.
为加强对全国诺如病毒感染暴发疫情调查处置和预防控制工作的技术指导,中国疾病预防控制中心组织专家编写了《诺如病毒感染暴发调查和预防控制技术指南(2015版)》,主要内容包括:⑴诺如病毒的病原学、临床特征和流行病学特征;⑵诺如病毒感染的病例定义、聚集性和暴发疫情的判定标准;⑶现场流行病学调查和卫生学调查的要点;⑷病人标本、食品、水及环境标本的采集方法、核酸检测和抗原检测方法;⑸病例管理、手卫生、环境消毒、食品安全、水安全、风险评估和健康教育等预防控制措施.
本指南适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和有关单位开展诺如病毒感染暴发疫情的发现、报告、调查、处置、预防和感染控制等工作.
中国疾病预防控制中心将根据指南执行过程中反馈的问题和学科进展定期对指南进行修订.
AbstractNorovirusesarealeadingcauseofsporadiccasesandoutbreaksofacutegastroenteritisglobally.
Norovirusesarehighlycontagiousandspreadrapidly.
Sincethewinterof2014,norovirusoutbreakshavebeenmorefrequentlyreportedinmainlandChinacomparedtopreviousyears.
Thereportedoutbreakspredominantlyoccurinschools,child‐carecenters,health‐carefacilitiesandothercrowdedsettings.
Tostrengthenthetechnicalguidancefortheinvestigation,control,andpreventionofnorovirusoutbreaksinmainlandChina,theChineseCenterforDiseaseControlandPrevention(ChinaCDC)organizedapanelofexpertstocompilethe"NorovirusOutbreakManagementandDiseasePreventionGuidelines(2015version)".
Themaincontentsinclude:(1)thevirologic,clinical,andepidemiologicalfeatures,(2)standardizedcasedefinitionsandcriteriafornorovirusclustersandoutbreaks,(3)recommendationsforhowtoconductfieldepidemiologicalandenvironmentalinvestigation,(4)specificinstructionsforhowtocollectclinical,food,water,andenvironmentalspecimens,andhowtotestfornorovirusesusingviralnucleicaciddetectionandenzymeimmunoassays,(5)preventionandcontrolstrategiesincludingcasemanagement,handhygiene,environmentaldisinfection,foodandwatersafety,riskassessment,andhealtheducation.
Theguidelinesareintendedforusebystaffatpublichealthagenciesatalllevels,healthcareworkersatmedicalinstitutions,andotherstakeholdersatrelatedinstitutionswhoworkonnorovirusoutbreakdetection,reporting,fieldinvestigation,preventionandinfectioncontrol.
ChinaCDCwillupdatetheguidelinesperiodicallybasedontheinternationalprogressinthisfieldandfeedbackfromusersduringtheimplementationoftheguidelines.
03传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37诺如病毒变异快、环境抵抗力强、感染剂量低,感染后潜伏期短、排毒时间长、免疫保护时间短,且传播途径多样、全人群普遍易感,因此,诺如病毒具有高度传染性和快速传播能力.
诺如病毒感染发病的主要表现为腹泻和/或呕吐,国际上通常称之为急性胃肠炎.
我国一直将其列入丙类传染病中"其他感染性腹泻病(除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病)"进行报告管理,这在一定程度上影响了以呕吐为主要症状的诺如病毒感染病例及其暴发的报告.
诺如病毒是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原,疾病负担严重[1‐2].
2013年以来,我国其他感染性腹泻病暴发多以诺如病毒暴发疫情为主,尤其是2014年冬季以来,诺如病毒暴发疫情大幅增加,显著高于历年水平.
为进一步指导各级疾病预防控制机构、医疗机构和有关单位开展诺如病毒暴发疫情的发现、报告、调查、处置、预防和感染控制等相关工作,中国疾病预防控制中心组织专家制定了本指南,并将根据指南执行过程中反馈的问题和研究进展,定期对指南进行修订、完善.
一、病原学1968年,美国诺瓦克镇一所小学发生急性胃肠炎暴发.
1972年,Kapikian等科学家在此次暴发疫情的患者粪便中发现一种直径约27nm的病毒颗粒,将之命名为诺瓦克病毒(Norwalkvirus)[3].
此后,世界各地陆续从急性胃肠炎患者粪便中分离出多种形态与之相似但抗原性略异的病毒颗粒,统称为诺瓦克样病毒(Norwalk‐likeviruses,NLVs).
由于此病毒呈圆形,无包膜,表面光滑,也称作小圆状结构病毒(smallroundstructuredviruses,SRSVs).
1992年,诺瓦克病毒的全基因组序列被解析.
此后根据基因组结构和系统发生特征,诺瓦克病毒归属于杯状病毒科(Caliciviridaefamily)[4].
2002年8月,第八届国际病毒命名委员会统一将诺瓦克样病毒改称为诺如病毒,并成为杯状病毒科的一个独立属——诺如病毒属(Norovirus).
(一)病毒结构诺如病毒为无包膜单股正链RNA病毒,病毒粒子直径约27‐40nm,基因组全长约7.
5‐7.
7kb,分为三个开放阅读框(OpenReadingFrames,ORFs),两端是5'和3'非翻译区(Untranslatedregion,UTR),3'末端有多聚腺苷酸尾(PolyA)[4].
ORF1编码一个聚蛋白,翻译后被裂解为与复制相关的7个非结构蛋白(Non‐structuralpolyprotein),其中包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp).
ORF2和ORF3分别编码主要结构蛋白(VP1)和次要结构蛋白(VP2)[5].
病毒衣壳由180个VP1和几个VP2分子构成,180个衣壳蛋白首先构成90个二聚体,然后形成二十面体对称的病毒粒子.
根据蛋白在衣壳中的位置,每个衣壳蛋白可分为两个主要区域,分别为壳区(Shelldomain,S区)和突出区(Protrudingdomain,P区),二者之间是由8个氨基酸组成的铰链区(Hinge)连接.
S区由衣壳蛋白的前225个氨基酸组成,形成病毒内壳,围绕病毒RNA.
P区由剩余的氨基酸组成,进一步分为两个亚区P1区和P2区.
P区通过二聚体相互作用增加衣壳稳定性并形成电镜下可见的病毒粒子突出端.
P2区高度变异,包含潜在的抗原中和位点和受体组织血型抗原(histobloodgroupantigens,HBGAs)识别位点.
VP2位于病毒粒子内部,被认为参与衣壳聚集[6].
(二)基因分型诺如病毒目前还不能体外培养,无法进行血清型分型鉴定.
根据基因特征,诺如病毒被分为6个基因群(Genogroup,GI‐GVI),GI和GII是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群,GIV也可感染人,但很少被检出.
GIII、GV和GVI分别感染牛、鼠和狗.
根据衣壳蛋白区系统进化分析,GI和04传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37GII进一步分为9个和22个基因型,除GII.
11、GII.
18和GII.
19基因型外,其他可感染人.
GIV分为两个基因型,GIV.
1感染人,GIV.
2感染猫和狗[7,8].
(三)病毒变异诺如病毒变异速度快,每隔2‐3年即可出现引起全球流行的新变异株.
1995年至今,已有6个GII.
4基因型变异株与全球急性胃肠炎流行相关,包括95/96US株(1996年)、FarmingtonHills株(2002年)、Hunter株(2004年)、DenHaag株(2006年)、NewOrleans株(2009年)以及Sydney2012株(2012年)[9‐12].
我国自2014年冬季以来,GII.
17变异株所致的暴发疫情大幅增加[13‐15].
(四)理化特性诺如病毒在氯化铯(CsCl)密度梯度中的浮力密度为1.
36‐1.
41g/cm3,在0℃‐60℃的温度范围内可存活,且能耐受pH2.
7的环境室温下3小时、20%乙醚4℃18小时、普通饮用水中3.
75‐6.
25mg/L的氯离子浓度(游离氯0.
5‐1.
0mg/L).
但使用10mg/L的高浓度氯离子(处理污水采用的氯离子浓度)可灭活诺如病毒,酒精和免冲洗洗手液没有灭活效果.
(五)免疫保护与宿主易感性一项志愿者人体试验研究表明,诺如病毒的免疫保护力可持续6‐24个月,即使先前感染过诺如病毒,同一个体仍可重复感染同一毒株或不同毒株的诺如病毒[16].
部分人群即使暴露于大剂量诺如病毒仍不会感染,这可能与先天宿主因素和后天获得性免疫有关.
组织血型抗原(HBGAs)包括H型、ABO血型和Lewis抗原被认为是诺如病毒的可能受体.
1,2‐岩藻糖转移酶基因突变导致组织血型抗原缺乏表达者(非分泌型),可能不容易感染诺如病毒[17].
(六)病毒核酸排出规律诺如病毒主要通过病人的粪便排出,也可通过呕吐物排出.
病人在潜伏期即可排出诺如病毒,排毒高峰在发病后2‐5天,持续约2‐3周,最长排毒期有报道超过56天[18‐21],在免疫抑制病人中更长[22].
诺如病毒感染剂量为18‐2800个病毒粒子[23‐24].
二、临床特征(一)潜伏期诺如病毒的潜伏期相对较短,通常12‐48小时.
瑞典曾对一起食源性传播引起的涉及30家托幼机构和学龄儿童托管机构的暴发数据进行分析,潜伏期中位数为34小时(范围:2‐61小时)[25].
一篇系统综述总结了GI和GII基因群诺如病毒的潜伏期,其中位数分别为1.
1天(95%CI:1.
1‐1.
2天)和1.
2天(95%CI:1.
1‐1.
2天),不同基因群的潜伏期没有显著差异[26].
(二)轻症病例临床表现诺如病毒感染发病以轻症为主,最常见症状是腹泻和呕吐,其次为恶心、腹痛、头痛、发热、畏寒和肌肉酸痛等[25,27‐31].
有两项研究对不同年龄组病例的腹泻和呕吐症状进行比较[25,31].
其中一项研究发现成人中腹泻更常见(72%VS52%),而儿童比成人更容易出现呕吐(81%VS64%)[25];而另一项研究显示,9.
0;将流出液倒至离心管中(必要情况下使用2个离心管),4℃,10000g离心30min;上清移至一新管或瓶,用HCl(1M)调节pH至7.
0±0.
5.
(3)样品富集浓缩加入1/4体积的5*PEG/NaCl缓冲液,在4℃条件下,于振荡孵育器孵育60min;4℃,10000g离心30min(必要情况下将液体分装于2只离心管).
弃去上层溶液,4℃,再次10000g离心5min以使颗粒紧凑.
弃去上层溶液,用500μLPBS重悬沉淀.
如果一个样品分两管离心,则用同样体积PBS依次重悬.
将重悬液移至新的EP管中,加入等体积的氯仿/丁醇溶液,涡旋混匀,室温孵育5min.
4℃,10000g离心15min,小心将水相转移至新管待提取RNA.
1.
4.
4生菜和苗芽菜1.
4.
4.
1设备和材料食品均质器(可拆卸、可清洗、可高压灭菌)、电子天平(感量0.
01g)、台式离心机(最高转速15000g)、微型离心机、电热恒温水浴锅(0‐100℃)、涡旋振荡器、实时荧光PCR仪、Roche,LightCycler480.
1.
4.
4.
2样品处理程序及方法(1)同一批次的生菜或苗芽菜样品,随机抽取样品数不少于5件,并用灭菌处理的剪刀剪碎至2.
5cm*2.
5cm*2.
5cm大小的形状,称量25g放入带有滤膜均质袋一侧中,作为待试样品.
另称取200g样品放入50mL离心管中,‐80℃保存,留作备样,并做好标记.
(2)向上述均质袋中加入40mLTGBEbuffer,均质器拍打混匀,尼龙扎带封口后,室温振荡约20min.
(3)将均质袋滤膜一侧液体倾入50mL离心管,4℃条件下10000*g离心30min.
(4)离心结束后,将上清转移至另一50mL离心管,加入1/4倍体积的5*PEG/NaCl溶液,室温条件振荡60min.
(5)振荡完毕,4℃条件下10000*g离心30min.
(6)离心结束,弃上清,继续4℃条件下10000*g离心5min压实沉淀.
(7)向沉淀加入500μLPBS溶液以溶解沉淀.
吸取溶解沉淀后的PBS溶液200μL转移至无菌离心管中,作为试样.
剩余的溶液分装到离心管中标记作为备样,‐80℃冻存.
2核酸提取各类样品经前处理后,每个样品分别取200μL,下面表格中提供的RNA提取试剂盒供参考,按试剂盒说明书操作提取RNA.
35传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37样品种类试剂盒粪便或呕吐物QIAGEN病毒核酸提取试剂盒(QIAampviralRNAminikit)或Geneaid病毒核酸提取试剂盒(ViralNucleicAcidExtractionKitII)水和环境标本NucliSENSLysisBuffer和NucliSENSMagnetic试剂盒(梅里埃公司)食品标本HighPureViralRNAKit(罗氏公司)3诺如病毒核酸检测方法3.
1粪便、呕吐物、肛拭子、水、环境涂抹样3.
1.
1诺如病毒双重Real‐time(TaqMan)RT‐PCR分析3.
1.
1.
1使用范围:ABI7500realtimePCR、Smartcycler(Cepheid),Mx3005P,Mx3000P(Stratagene)和ICycleriQTMReal‐TimePCR检测系统(BioRad)等.
本设计应用QuantiTectMultiplexRT‐PCRKits(Qiagen),引物和探针浓度分别被优化为终浓度400nM和200nM.
每个试剂盒特异的RT最适环境和活化步骤,需要遵循制造说明书使用.
该试验方法来自美国CDC诺如病毒暴发网络(CaliciNetUSA)双重Real‐timeRT‐PCR操作标准,引物设计参考文献[59].
3.
1.
1.
2设备和材料涡流混合器、微量离心机、移液器(量程为P20、P200和P1000)、Real‐timePCR仪可以是ABI7500(ABI)、Smartcycler(Cepheid)、Mx3005PorMx3000P(Strategene)或BioRadiCycleriQTMReal‐TimePCR检测系统(BioRad).
一次性手套、带滤芯枪头、无菌1.
5mL微量离心管、RNA酶去除剂、96‐孔反应板、盖子或薄膜.
3.
1.
1.
3诺如病毒寡核苷酸引物/探针表1多重荧光定量RT‐PCR扩增诺如病毒的引物和探针基因型引物/探针序列(5'‐3')工作浓度nM)GICog1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400Cog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400Ring1AFAM–AGATYGCGATCYCCTGTCCA–BHQ*200Ring1BFAM–AGATCGCGGTCTCCTGTCCA–BHQ*200GIICog2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400Cog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400Ring2JOE–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ**200*GITaqMan探针:5'端用FAM荧光素标记,3'端用BHQ淬灭基团标记;BHQ淬灭基团1更好.
**GIITaqMan探针:5'端用JOE(HEX或VIC等)荧光素标记,3'端用BHQ淬灭基团标记.
3.
1.
1.
4操作方法(1)实验准备用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液器和离心机除去潜在的RNA酶污染.
RealtimePCR仪开机预热15分钟.
(2)试剂准备36传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37①所有试剂冰浴.
②轻弹管壁混合2*QuantiTectMultiplexRT‐PCRMasterMix反应液.
③涡旋所有引物和探针5秒钟.
④QuantiTectMultiplexRTMix、引物、探针置于冰上.
(3)对照设立每一次实验都要包括无模板对照(NC)(第一个和最后一个孔各设一个)和阳性对照(PC)(GI和GII诺如病毒核酸或标准品).
(4)检测注意:请在PCR清洁区准备、配制反应体系(mastermix).
①在1.
5mL离心管中准备mastermix.
②确定每次分析的反应数(N),需要多配反应数来弥补重复移液中的小量丢失:如果样本数(n)(包括NC和VC对照)=1‐14,做n+1个反应的mix.
如果样本数(n)(包括NC和VC对照)>15,做n+2个反应的mix.
③配制Real‐timeRT‐PCR反应混合液22.
5μL(表2)表2诺如病毒双重反应体系配制方案(QuantiTectMultiplexRT‐PCRKits)组成成分体积(μL)终浓度RNase‐freewater4.
25Cog1F(10μM)1400nMCog1R(10μM)1400nMRing1A(10μM)0.
5200nMRing1B(10μM)0.
5200nMCog2F(10μM)1400nMCog2R(10μM)1400nMRing2(10μM)0.
5200nMRNase‐freewater4.
25QuantiTectMultiplexRTMix0.
252*QuantiTectMultiplexRT‐PCRMasterMix12.
51*④吸打混匀MasterMix.
⑤按如下方式排列阴性对照、阳性对照和样品,在每孔中加入22.
5LMasterMix.
37传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37123456789101112ANCS1S2S3S4S5S6S7S8NCPC(GI)PC(GII)BCDEFGH*阴性模板对照(NC)加入第一列,样本加入后面的11列,检查加入样本时可能的交叉污染.
病毒模板对照(PC在所有样本和NC密封后加入到最后.
⑥加入2.
5LDEPC水到第一个NC孔,盖好.
⑦将反应平板转移到核酸处理区域或清洁区外面.
⑧将RNA样本从‐70°C冰箱转移在冰上融化;漩涡振荡5秒钟之后快速离心5秒钟,移液2.
5LRNA样本到标记好的孔.
例如,加样本1(S1)到平板位置A2和B2.
如果样本体积小于2.
5L,加DEPC水至反应管使总反应体积达到25L.
⑨加2.
5L水到最后的NC孔,盖好.
⑩最后,移液GI和GII诺如病毒阳性对照各2.
5L到适当的PC孔,盖好.
小心混合平板.
4℃离心平板500rpm1分钟,以移除孔中可能存在的气泡和液滴.
RT‐PCR扩增条件:按照ABI7500(orotherplatform)的说明书放置好平板.
终反应体积为25μL.
根据QuantiTectMultiplexRT‐PCRKits说明书,RT‐PCR热循环程序为:循环数温度时间150℃20min195℃15min4594℃45S60℃45S3.
1.
1.
5结果解释(1)阴性对照(NC)如果一个或更多NC反应出现假阳性,则可能发生了污染.
这种情况下,检测无效,需重复检测.
(2)阳性对照(PC)阳性对照产生超过阈值的荧光曲线或扩增图像.
(3)检测样本38传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37只有在所有质量控制严格准确时,如果曲线在Ct值为≤40,则认为检测样本为阳性.
3.
1.
2诺如病毒传统RT‐PCR分析3.
1.
2.
1原理人诺如病毒分为5个基因组(Genogroup,G),其中GI、GII和GIV型可感染人.
本方案利用衣壳蛋白的部分区域(regionC)来对诺如病毒进行分型.
本方案由四个引物组成,扩增ORF2的5'末端,编码主要外壳蛋白VP1.
引物G1SKF和G1SKR用于GI的检测,扩增片段330bp.
引物和CoG2F和G2SKR用于GII的监测,扩增片段387bp.
3.
1.
2.
2设备与材料涡流混合器、微量离心机、移液器、PCR仪、微波炉、电泳仪和制胶器.
一次性手套、带滤芯枪头、无菌1.
5‐mL微量离心管、RNA酶去除剂、薄壁PCR管(Rnasefree,0.
5mL)、LoadingBuffer、QiangenOneStepRT‐PCRKit(货号:210212).
3.
2.
2.
3诺如病毒寡核苷酸引物/探针(见表3)表3诺如病毒传统RT‐PCR寡核苷酸引物Region型别引物名称序列(5'‐3')产物(bp)CIG1SKF(+)CTGCCCGAATTYGTAAATGA330G1SKR(+)CCAACCCARCCATTRTACAIICOG2F(+)CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG387G2SKR(‐)CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATY=CorT;H=A,C,orT;R=AorG;I=inosine;S=CorG;N=G,A,T,orC;W=AorT;K=GorT.
3.
2.
2.
4操作方法(1)实验准备用RNA酶去除剂擦拭工作台表面、移液管和离心机以去掉潜在的RNA酶污染.
(2)试剂准备①所有试剂冰浴.
②轻弹管壁混合5X缓冲液.
③离心酶、RNA酶抑制剂和dNTPs后将其放在冰上备用.
④涡旋所有引物5秒钟,离心5秒钟备用.
(3)对照设立每次PCR实验都应设置阴性对照和阳性对照,包括诺如病毒GI和GII,阳性对照为阳性粪便样品.
(4)检测注意:在PCR清洁区配置反应体系.
①用1.
5mL离心管准备反应体系.
②确定每次分析的反应数(N),在操作需配置过量的反应体系来校正重复移液中的小量丢失;见下面的样本:如果样本数(n)(包括NC和VC对照)=1‐14,做n+1个反应的mix.
如果样本数(n)(包括NC和VC对照)>15,做n+2个反应的mix.
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37③将每个引物对按以下计算量添加到反应混合液中(表4和5).
表4诺如病毒RegionC反应体系‐GenogroupI成分体积/反应(μL)最终浓度5XRT‐PCRBuffer51xdNTPmix1Enzymemix1GISKF(50μM)0.
25500nMGISKR(50μM)0.
25500nMRnaseInhibitor(30‐40U/μL)0.
50Rnase‐freewater12反应体系总体积20表5诺如病毒RegionC反应体系‐GenogroupII成分体积/反应(μL)最终浓度5xRT‐PCRBuffer51xdNTPmix1Enzymemix1COG2F(50μM)0.
25500nMGIISKR(50μM)0.
25500nMRnaseInhibitor(30‐40U/μL)0.
50Rnase‐freewater12反应体系总体积20④用移液管上下吹打混合液.
⑤向每个反应管中分装20μL混合液.
⑥设立阴性对照,加5μLDEPC水.
⑦将反应管转移到核酸处理区.
⑧将病毒核酸在冰上融化,漩涡振荡5秒钟之后快速离心5秒钟.
⑨移取5μL的RNA模板到每一个相应的反应管中.
⑩最后加5μL阳性对照.
将所有的反应管放置在PCR仪上,按照下面的条件设置:40传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37循环数时间温度℃130min42115min954030sec9530sec5030sec72110min72准备2%的琼脂糖凝胶,进行核酸电泳.
(5)解释如果阴性对照出现条带,说明可能出现污染,需重复实验.
阳性对照在正确位置出现条带,则判定反应体系工作正常.
3.
2食品诺如病毒荧光定量PCR(RocheLightMixKitNorovirusGGⅠ,GGⅡ,MS2或等效的诺如病毒检测试剂盒)3.
2.
1反应体系及仪器设置反应体系的添加按下表:表6诺如病毒定量PCR体系试剂1个反应10个反应PCR水4.
3μL47μLActivator激活剂1.
3μL14.
3μL引物和探针1μL11μL内对照1μL11μL预混液7.
4μL81.
4μL模板5μL‐总体积20μL165μL具体的仪器设置为检测信号通道FAM通道465nm‐510nm,内参信号ROX通道533nm‐610nm,做分型的LC670通道498nm‐660nm,反应具体参数设置如下:(1)逆转录61℃,3min.
(2)预变性95℃,30s.
41传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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37(3)PCR循环,95℃10s,56℃10s收集信号,72℃5s,45个循环.
(4)溶解曲线,95℃30s,40℃2min,85℃1s收集信号.
3.
2.
2诺如病毒荧光定量PCR结果判读实验结束后,分析结果,具体分析标准按下表进行.
表7诺如病毒结果判读FAM(510nm)Rox(610nm)熔解曲线(660nm)阴性对照结果判读有扩增有无扩增均可无信号无扩增GI型有扩增有无扩增均可熔解峰在50‐60度无扩增GII型无扩增有扩增无信号无扩增阴性无扩增无扩增无信号无扩增PCR抑制有扩增有扩增有无信号均可有扩增污染在食品类的诺如病毒检测方法中,通过诺如病毒质控样的加入作为外部质控以判断RNA的提取过程是否正常;同时在RT‐PCR过程中还含有ROX荧光通道检测内部质控噬菌体pMS2,用以判断在PCR过程中是否含有PCR抑制物质,如含有抑制物质扩增过程为阴性或扩增效率不高,正常则扩增为阳性.
该试剂盒还含有与GII产物结合的探针,用以区分诺如病毒的型别.
如果扩增的结果为GII,则可以检测到探针信号,如果为GI型则无信号.
可以根据上表来对诺如病毒的检测结果进行判断.
4.
诺如病毒ELISA检测方法(粪便、呕吐物)4.
1操作步骤(RIDASCREENNorovirus3rdGeneration):(1)将两滴(100L)阳性质控液Control+,标本稀释液Dilutent‐(阴性质控液)和10%便悬液上清加入为微孔中.
(2)再分别加入2滴(100L)生物素标记抗体标记物1Conjugate1,在充分混匀(轻轻振动微孔板边缘)后,室温(20‐25℃)孵育60分钟.
(3)每孔加入300L洗液,洗5次,在吸水纸上拍干.
(4)微孔中加入2滴(100μL)酶结合物标记物2Conjugate2,室温20‐25℃孵育30分钟.
(5)每孔加入300L洗液,洗5次,在吸水纸上拍干.
(6)在每个孔中加入2滴(100μL)的底物Substrate.
然后微孔板在室温(20‐25℃)下避光孵育15分钟.
在每个微孔中加入1滴(50μL)终止液Stop以终止反应.
轻微混合后(轻拍微孔板的边缘),用酶标仪测定在450nm的光波下测定吸光度.
(7)结果判定:将阴性质控所得吸光度值加上0.
15即为Cut‐off值.
样本吸光度值大于Cut‐off值10%视为阳性.
样本吸光度值处于上述Cut‐off值±10%范围视为可疑,应重复检测.
重复测试新鲜粪便样本,结果仍在此区域,则视为阴性.
样本吸光度值小于上述Cut‐off值+10%视为阴性.
阴性样品还需按本指南"3.
1.
1诺如病毒双重Real‐time(TaqMan)RT‐PCR分析"检测确认.
42传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
17th,2015,Vol.
3,No.
376诺如病毒消毒方法一、病人呕吐物、粪便用一次性吸水材料(如纱布、抹布等)沾取5000mg/L~10000mg/L的含氯消毒液完全覆盖污染物,小心清除干净.
清除过程中避免接触污染物,清理的污染物按医疗废物集中处置,或用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后处理.
厕所马桶或容器内的污染物,可小心倒入足量的5000mg/L~10000mg/L的含氯消毒液,作用30min以上,排入有消毒装置的污水处理系统.
清洁中使用的拖把、抹布等工具,盛放污染物的容器都必须用含有效氯5000mg/L消毒剂溶液浸泡消毒30min后彻底冲洗,才可再次使用.
厕所、卫生间的拖把应专用.
二、地面、墙壁及物体表面用于消毒地面、墙壁及物体表面的消毒液,应含有效氯1000mg/L.
有肉眼可见污染物时应先清除污染物再消毒.
无肉眼可见污染物时,家具和生活设施用消毒液进行浸泡、喷洒或擦拭消毒,作用30分钟后用清水擦拭干净.
墙壁可直接用消毒剂按100mL/m2~300mL/m2用量擦拭或喷洒消毒.
地面消毒先由外向内喷洒一次,喷药量为100mL/m2~300mL/m2,待室内消毒完毕后,再由内向外重复喷洒一次.
消毒作用时间应不少于15分钟.
三、衣物、被褥等织物收拾被污染的衣物、被褥等织物时应避免产生气溶胶.
先将固体污秽物移除后浸在有效氯为500mg/L的含氯消毒剂溶液内30分钟,然后清洗.
也可用流通蒸汽或煮沸消毒30分钟.
若不能即时消毒,应把它们放置在密封的袋内,并尽快处理.
四、食品用具餐(饮)具和食品加工工具清除食物残渣后,煮沸消毒30分钟,也可用有效氯为500mg/L含氯消毒液浸泡或擦拭,作用30分钟后,再用清水洗净.
五、皮肤、粘膜皮肤被污染物污染时,应立即清除污染物,然后用一次性吸水材料沾取0.
5%碘伏消毒液擦拭消毒3分钟以上,使用清水清洗干净;粘膜应用大量生理盐水冲洗或0.
05%碘伏冲洗消毒.
六、医疗废物患者产生的生活垃圾、一次性诊疗用品采用双层医疗废物袋,按医疗废物集中收集处置.
七、生活饮用水和供水设施导致暴发的水及水源,应立即停止使用.
对污染的供水管网、水箱、桶装水机、直饮水机进行消毒处理,应进行彻底清洗消毒,可用有效氯100mg/L消毒液浸泡1小时,或50mg/L消毒液浸泡24小时,然后冲洗管网后使用.
污染的水井需进行彻底消毒清掏后再开放取水.
消毒时需保持余氯量为0.
5mg/L以上,按水井的容量计算所需含氯消毒剂的量,加入井水中充分混匀,保持30分钟以上.
抽出井水,清除淤泥,用清水冲洗井壁、井底,再抽尽污水.
待水井自然渗水到正常水位后,按1立方水加含有效氯25%的漂白粉150g~200g(含有效氯25mg/L~50mg/L)进行消毒,浸泡12~24小时后,抽出井水.
再待自然渗水到正常水位后,按正常消毒方法消毒,即可投入正常使用.
污水按每升加4g漂白粉或2片消毒泡腾片搅匀,作用60分钟再排放.
43传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
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3,No.
37八、室内空气保持室内空气流通.
自然通风或机械通风,也可采用循环风式空气消毒机进行空气消毒,无人的空间也可用紫外线对空气消毒,不可采用喷洒消毒剂的方法对室内空气进行消毒.
44传染病专报2015年11月17日第3卷第37期IDR,Nov.
17th,2015,Vol.
3,No.
37致谢感谢美国疾控中心AronJ.
Hall、吴蜀豫,中国食品药品检定研究院骆海鹏,首都儿科研究所病毒研究室赵林清,北京大学第一医院侯凤琴,中国疾控中心传染病预防控制处常昭瑞、刘凤凤、袁辰、邢薇佳,浙江省疾控中心陈恩富、林君芬、缪梓萍,四川省疾控中心唐雪峰,湖南省疾控中心高立冬、胡世雄,湖北省疾控中心邢学森,北京市疾控中心钱海坤,广东省疾控中心方苓,深圳市疾控中心何雅青,北京市海淀区疾控中心华伟玉、北京市朝阳区疾控中心马建新和深圳市宝安区疾控中心李苑等专家在指南制定和修订过程中提供宝贵的修改建议和意见!
编写人员廖巧红、冉陆、靳淼、崔生辉、袁俊、马会来、班海群、孙立梅、罗莉、刘娜、段招军、余宏杰编写人员单位102206北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制处,传染病监测预警重点实验室(廖巧红、冉陆、罗莉、余宏杰)102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(靳淼、刘娜、段招军)102206北京,中国疾病预防控制中心中国现场流行病学培训项目(马会来)100021北京,中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所(班海群)100050北京,中国食品药品检定研究院(崔生辉)511430广州,广东省疾病预防控制中心(孙立梅)510440广州,广州市疾病预防控制中心(袁俊)主办:中国疾病预防控制中心传染病预防控制处主编:余宏杰副主编:李中杰编辑:王丽萍曾令佳编辑部联系方式:通讯地址:北京市昌平区昌百路155号邮编:102206联系人:王丽萍曾令佳电话:010‐58900546E‐mail:did@chinacdc.
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