蛋白俄病毒研究所爆炸

苹果蠹蛾颗粒体病毒GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位刘向阳1,2,孙修炼3,张忠信3,周琳1,2*1河南农业大学植物保护学院,河南郑州450002;2河南省新型农药创制与应用重点实验室,河南郑州450002;3.
中国科学院武汉病毒研究所,湖北武汉430071*通讯作者,E-mail:zhoulin@henau.
edu.
cn摘要为丰富苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)GP37蛋白的研究内容,探寻该蛋白的增效机制,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将苹CpGVgp37基因和绿色荧光蛋白基因(egfp)以N端或C端融合的方式插入苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)基因组中,获得重组的杆状病毒质粒(Bacmid),转染昆虫细胞Sf9,Westernblot检测到GP37和EGFP融合(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合(vAcGP37、vAcEGFP)蛋白都得到了高效表达;用激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况,结果显示,融合GP37的EGFP主要聚集在细胞质中,没有融合GP37的EGFP遍布整个细胞,说明CpGVGP37蛋白定位于细胞质中.
本研究对CpGVGP37蛋白的真核表达,为该蛋白的后续研究提供了条件;而该蛋白的亚细胞定位研究,不仅为CpGVGP37蛋白增效机制的研究打下了基础,同时丰富了杆状病毒GP37蛋白的相关理论.
关键词苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV),GP37蛋白,Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,真核表达,亚细胞定位ExpressioninBac-to-BacBaculovirusExpressionSystemandLocalizationinInfectedCellsofCydiapomonellagranulovirusGP37LIUXiang-Yang1,2,SUNXiu-Lian3,ZHANGZhong-Xin3,ZhOULin1,2*1.
CollegeofPlantProtection,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China;2.
KeyLaboratoryforCreationandApplicationofNovelPesticidesofHenanProvince,Zhengzhou450002,China;3.
WuhanInstituteofVirology,ChineseAcademyofSciences,Wuhan430071,China*Correspondingauthor,zhoulin@henau.
edu.
cn基金项目:国家自然科学基金项目(31301713);河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A210024)批注[l1]:用星号标注通讯作者;并在单位下方提供通信作者联系方式(页脚提供基金项目信息).
批注[l2]:按"目的,方法,结果,结论"4方面依次书写,但文中不出现上述字眼.
批注[l3]:关键词与关键词间用逗号隔开,且空一格;一般为3~8个实词.
批注[l4]:英文题名单词的首字母大写(介词,连词等虚词除外).
AbstractToenrichtheresearchcontentsofCydiapomonellagranulovirus(CpGV)GP37proteinandexploremechanismofsynergismofnucleopolyheroviruses(NPVs)andBacillusthuringiensis(Bt)bytheGP37protein,aseriesofrecombinantAutographacalifornicamultiplenucleocapsidNPV(AcMNPV)bacmidscontainingegfporCpGVgp37fusedwithegfpwereconstructed.
TheresultingbacmidswerenamedvAcGP37,vAcGP37EGFP,vAcEGFPGP37,andvAcEGFP,respectively.
InvAcGP37EGFPandvAcEGFPGP37,EGFPwasfusedinframewithCterminalandNterminal,respectively.
ThebacmidvAcGP37expressedGP37proteinandvAcEGFPexpressedEGFPonly.
AllrecombinantbacmidswereconfirmedbyPCR.
Sf-9cellsweretransfectedwiththerecombinantbacmids,andsupernatantscontainingbuddedviruswerecollected96hposttransfection.
ExaminationswerecarriedoutforproteinexpressionbyWesternblotanalysisusinganti-GFPandanti-GP37asprimaryantibodyfollowingSDS-PAGEofthecelllysates.
Theanti-GFPantibodyshowedcross-reactionwithcellstransfectedwithvAcGP37EGFP,vAcEGFPGP37,vAcEGFPandanti-GP37antiserumshowedcross-reactionwithcellstransfectedwithvAcGP37,vAcGP37EGFP,andvAcEGFPGP37.
Anabout50kDafusionprotein,whichwasinconsistencewiththesizeofGP37andEGFP,wasdetectedinthecelllycatestransfectedwithvAcGP37EGFPorvAcEGFPGP37.
Bycontrast,anapproximate24kDaproteinwasdetectedinthosetransfectedbyvAcGP37orvAcEGFP,whereGP37andEGFPwereexpressedseparately.
Sf9cells(1*105)in35-mmglassbottomcellculturedisheswereinfectedwithvAcGP37,vAcGP37EGFP,vAcEGFPGP37,andvAcEGFP,respectively.
At24hposttransfection,cellswerewashedwithphosphate-bufferedsaline(PBS,pH7.
4)andfixedwith4%paraformaldehydeinPBSfor15minatroomtemperature.
ThecellswerewashedwithPBSandthenpermeabilizedwith0.
25%TritonX-100for3minatroomtemperature.
FollowingawashwithPBS,thecellswerestainedwithHoechst33258workingreagentfor5minatroomtemperature.
CellswerewashedthreetimeswithPBSandvisualizedwithaLeicaTCSSP2confocallaserscanningmicroscopeforfluorescence,respectively.
IncellsinfectedwithvAcEGFP,EGFPwasexpressedwithoutfusionofGP37andfluorescencewasdisperseduniformlythroughoutthecytoplasmandnucleus.
Incontrast,incellsinfectedwithvAcGP37EGFPandvAcEGFPGP37,EGFPwasexpressedwithfusionofGP37andfluorescencedistributedmainlyinthecytoplasm.
TheseresultssuggestedthatCpGVGP37protein批注[l5]:英文摘要可以提供比中文摘要更详尽的信息.
注意:用过去时态叙述作者的工作,用现在时态叙述作者的结论.
localizesmainlyinthecytoplasm.
TheeukaryoticexpressionofCpGVGP37proteinmayprovideconditionsforfurtherstudyofthisprotein.
ThesubcellularlocalizationofCpGVGP37proteinininfectedcellswouldlayafoundationforthestudyofsynergicmechanismofthisproteinandenrichthetheoryofbaculovirusGP37protein.
KeywordsCydiapomonellagranulovirus(CpGV),GP37,Bac-to-Bacbaculovirusexpressionsystem,Eukaryoticexpression,Subcellularlocalization苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydiapomonellagranulovirus,CpGV)最初从墨西哥感病的苹果蠹蛾(C.
pomonella)幼虫中分离得到,后被发展为微生物杀虫剂,现已成为北美和西欧防治苹果蠹蛾最重要的生物药剂.
在中国,该药剂对苹果蠹蛾田间种群的防效也进入实验阶段(Liuetal.
,2013).
CpGV基因组全长为123500bp,含143个开放阅读框,其中第13个开放阅读框(orf13),命名为CpGVgp37基因(Luqueetal.
,2001).
CpGVgp37基因与杆状病毒gp37和昆虫痘病毒fusolin基因具有较高的氨基酸序列同源性(Salvadoretal.
,2012),昆虫痘病毒fusolin基因编码的纺锤体蛋白能够明显增强核型多角体病毒(Nucleopolyhedravirus,NPV)、昆虫痘病毒和素云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)的杀虫活性(Hukuharaetal.
,2001;Mitsuhashietal.
,2000;Mitsuhashietal.
,2014).
Liu等(2011)通过对CpGVGP37蛋白的研究发现,该蛋白不仅能增强甜菜夜蛾核型多角体病毒(SpodopteraexiguamultiplenucleocapsidNPV,SeMNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AutographacalifornicamultiplenucleocapsidNPV,AcMNPV)的活性,而且能增强Bt的杀虫活力.
但CpGVGP37蛋白的其它一些特性,如该蛋白在被感染细胞中的定位等,没有报道.
本研究通过构建真核表达载体,利用Bac-to-Bac系统在昆虫细胞中对CpGVGP37蛋白进行表达,随后利用激光共聚焦技术对该蛋白在细胞中的分布(亚细胞定位)进行探索,旨在丰富CpGVGP37蛋白的研究内容,为其增效机制的研究提供基础资料.
1材料与方法1.
1病毒和细胞系苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydiapomonellagranulovirus,CpGV)由德国D.
L.
R.
Rheinpfalz研究所提供,在甘肃省农业科学院张掖试验场完成增殖,储存于4°C冰箱中备用.
批注[l6]:与中文关键词一一对应,首字母大写,且词与词之间用逗号隔开,并空一格.
批注[l7]:前言部分主要写研究背景,前人研究进展,本研究研究切入点,拟解决的关键问题及研究意义等.
批注[l8]:正文中参考文献用著者-出版年制.
批注[l9]:按照以下结构组织文章1:材料与方法2:结果与分析3:讨论4:结论草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系Sf9为中国科学院武汉病毒研究所昆虫病毒基因工程学科组保存,于27℃培养,生长培养基为Grace's昆虫细胞培养基(Cat.
No.
11300-043,Invitrogen,美国)添加10%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)(Cat.
No.
16000-044,Invitrogen,美国).
1.
2菌株、载体和试剂大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α(TaKaRa,中国大连)和DH10B(TaKaRa,中国大连)菌株均由中国科学院武汉病毒研究所昆虫病毒基因工程学科组保存;载体pMD18-Tvector(TaKaRa,中国大连)购自宝生物工程(大连)有限公司,pFastBacDual(Invitrogen,美国)和pEGFP-C1(Clontech,美国)为中国科学院武汉病毒研究所昆虫病毒基因工程学科组保存.
荧光染料Hoechst33258购自BIOSHARP(美国);转染试剂lipofectin购自Invitrogen(美国);NonidetP40购自Sigma(美国);PVDF膜购自Millipore(美国);PCR纯化试剂盒购自OMEGA(美国);质粒提取试剂盒购自OMEGA(美国).
1.
3引物合成利用primerpremier5.
0软件,根据CpGVgp37基因(GenBank登录号:NC_002816)核苷酸序列,设计出1条正向引物和2条反向引物;根据pEGFP-C1(GenBank登录号:CVU55763)核苷酸序列,设计出2条正向引物和2条反向引物.
除M13-f和M13-r外,其余引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1).
表1实验所用引物Table1Primersusedinthestudy引物Primer序列(5'~3')Sequence(5'~3')酶切位点RestrictionsiteCp-f1Cp-r1Cp-r2EGFP-f1EGFP-r1EGFP-f2EGFP-r2M13-fM13-rTGCTCTAGAATGCCGTTGGCGAGACAGCGAACTGCAGCTACAAATCACTTTTCGTTTGCTTAACTGCAGCAAATCACTTTTCGTTTGCTTGTCCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGTGCTCTAGACTTGTACAGCTCGTCCATGCAACTGCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGGTTTTCCCAGTCACGACCAGGAAACAGCTATGACXbaIPstIPstIEcoRIXbaIPstIHindⅢ--*斜体部分为保护碱基,下划线部分为酶切位点*Italicssectionsareprotectivebases,andunderlinedsequencesarerestrictionenzymesites批注[l10]:国内购买的试剂注明公司所在城市,进口试剂注明国家批注[l11]:表的要求:1:所有表格一律为三线表.
2:表头,表注,及表中的内容均要求汉英对照.
1.
4目的序列的扩增参照Smith和Crook(1988)所述的方法提取CpGV基因组.
以CpGV基因组为模板,以Cp-f1和Cp-r1分别作为正反向引物进行gp37序列PCR扩增,扩增长度预计为663bp,不含有N端疏水片段(1~93nt);以Cp-f1和Cp-r2分别作为正反向引物扩增进行缺失了N端疏水片段(1~93nt)和终止密码子(TAG)的gp37基因(gp37(delTAG)),预计片段长度为660bp.
PCR反应体系均为:含模板DNA20ng、正反向引物各0.
5pmol、dNTP1mmol/L、TaqDNA聚合酶2.
5U、10*buffer1μL,用灭菌双蒸水补足10μL.
PCR反应条件均为:94℃预变性5min;94℃45s,59℃45s,72℃60s为一个循环,进行29个循环;72℃延伸5min;最后4℃保温10min.
以pEGFP-C1质粒为模板,以EGFP-f2和EGFP-r2分别作为正反向引物,扩增完整的egfp基因序列;以EGFP-f1和EGFP-r1分别作为正反向引物,扩增缺失终止密码子的egfp基因(egfp(delTAA))序列.
PCR反应体系均为:含模板DNA20ng、正反向引物各0.
4pmol、dNTP1mmol/L、TapDNA聚合酶2.
5U、10*buffer1μL,用灭菌双蒸水补足10μL.
PCR反应条件均为:94℃预变性5min;94℃45s,55℃45s,72℃60s为一个循环,进行29个循环;72℃延伸5min;最后4℃保温10min.
PCR反应产物用0.
8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,用PCR纯化试剂盒(OMEGA,美国)纯化和回收.
1.
5重组表达载体的构建将上述胶回收的4个片段连接到pMD18-T载体,连接产物转化E.
coliDH5α,挑取白斑接入5mLLB液体培养基(含氨苄青霉素(Amp),100μg/mL)中振荡培养14h.
用质粒提取试剂盒按照说明书小量提取质粒酶切鉴定阳性克隆子并送到上海英骏生物技术有限公司进行测序,分别命名为pT-gp37、pT-gp37(delTAG)、pT-egfp和pT-egfp(delTAA).
从pT-gp37质粒上用XbaⅠ和PstⅠ酶切gp37基因片段,从pT-gp37(delTAG)质粒上用XbaⅠ和PstⅠ酶切gp37(delTAG)基因片段,从pT-egfp质粒上用HindⅢ和PstⅠ酶切egfp基因片段,从pT-egfp(delTAA)质粒上用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切egfp(delTAA)基因片段,经回收后分别亚克隆到pFastBacTMDual载体,转化E.
coliDH5α,涂布于含有50μg/mLAmp和7μg/mL庆大霉素(Gm)的平板.
挑取阳性菌落,接入5mLLB培养基(100μg/mLAmp,7μg/mLGm)中37℃振荡培养过夜.
依照质粒提取试剂盒说明书中介绍的方法,分别提取质粒,酶切鉴定阳性克隆子,分别命名为pD-egfp、pD-gp37、pD-egfp(delTAA)gp37和pD-gp37(delTAG)egfp.
其中pD-egfp(delTAA)gp37(GP37蛋白批注[l12]:PCR扩增要交代清楚:扩增引物;扩增体系(各成分浓度和用量);扩增条件位于C端)和pD-gp37(delTAG)egfp(GP37蛋白位于N端)用于表达GP37和EGFP的融合蛋白(图1).
图1重组病毒的构建示意图Figure1ConstructionoftherecombinantAcMNPVbacmids苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)gp37和绿色荧光蛋白(egfp)基因首先被克隆到pFastBacDual载体,然后分别转座含有苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)Bacmid(AcBacmid)和helper的DH10B感受态细胞,构建GP37和EGFP融合(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合(vAcGP37、vAcEGFP)的重组病毒Cydiapomonellagranulovirus(CpGV)gp37geneandenhancedgreenfluorecenceproteingene(egfp),wereclonedintothepFastBacDualtogeneratedonorplasmids.
ThedonorplasmidsweretransformedintoEscherichiacolistrainDH10BcellscontainingAutographacalifornicamultiplenucleocapsidNPV(AcMNPV)bacmidandhelperplasmid,andfourrecombinantAcMNPVbacmidswereconstructed,includingvAcGP37,vAcEGFP,vAcEGFPGP37,andvAcGP37EGFP.
InvAcEGFPGP37andvAcGP37EGFP,CpGVgp37fusedwithegfpunderthecontrolofAcMNPVpolyhedrinpromoter(PPH)1.
6重组病毒的获得及PCR检测将pD-egfp、pD-gp37、pD-egfp(delTAA)gp37、pD-gp37(delTAG)egfp和pFastBacTMDual空载体(用作对照)分别转座含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)Bacmid(AcBacmid)和helper的DH10B感受态细胞,之后涂布于LA培养基平带格式的:两端对齐批注[l13]:图表要有自明性,注释中对图的关键信息做简要说明板(含50μg/mL卡那霉素(kanamycin,Kana),7μg/mL庆大霉素(gentamicin,Gm),10μg/mL四环素(tetracycline,Tetra),100μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,X-gal),40μg/mL异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(thiogalactopyranoside,IPTG)),37℃培养24~48h.
检查平板上的蓝白斑,白斑为重组Bacmid的菌落.
将白色菌落重新划线在一个新鲜的LA培养基平板,以确定其为白色菌落.
挑取白色单菌落,接入5mLLB培养基,37℃振荡培养14h,取出1.
5mL于10000*g离心10min;加入300μL溶液Ⅰ(15mmol/LTris/HCl,10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),pH8.
0),然后加入300μL溶液Ⅱ(0.
2mol/LNaOH,1%SDS(十二烷基磺酸钠)),室温静置10min,缓慢加入300μL冰冷的溶液Ⅲ(3mol/L醋酸钾,pH5.
5),混匀,冰浴10min;于4℃14000*g离心10min,上清转入预先加入800μL异丙醇的离心管内,混匀,于-20℃置15~30min;14000*g离心15min,弃上清,加入1mL70%的乙醇,14000*g离心5min,重复2次;倾去乙醇,然后Bacmid沉淀置于室温自然干燥10min,每管加入30~50μL无菌水溶解30min,样品置4℃保存.
以上述提取的Bacmid为模板,以通用引物M13-f和M13-r以及目的片段上两端的引物(表1)进行PCR检测.
PCR反应扩增体系中含10*buffer10μL、模板DNA100ng、正反向引物各0.
4pmol、dNTP1mmol/L、TaqDNA聚合酶2.
5U,用灭菌双蒸水补足100μL;反应条件均为:94℃预变性5min,94℃1min,63~50℃50s,72℃4min为一个循环,进行29个循环,最后72℃延伸10min.
反应产物用0.
8%琼脂糖凝胶电泳鉴定.
鉴定正确的重组病毒依次命名为vAcEGFP、vAcGP37、vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP和vAcDual,于4℃冰箱中保存.
1.
7重组病毒转染昆虫细胞Sf9在35mm的培养皿中接种5*105的Sf9细胞,27℃培养过夜.
在生物安全柜中弃去上层培养基,加入2mL无血清的培养基室温放置1h.
取5μg1.
5中重组病毒DNA以及6μL脂质体(Invitrogen,美国),分别用无血清培养基稀释至100μL,将两者混合,静置15~40min后,往脂质体和DNA的混合液中加入800μL培养基,混匀,移入35mm培养皿中并加入前述脂质体和重组病毒DNA的培养基混合物,培养6h后,移去转染液,添加2mL含10%血清的培养基,混匀,培养72h后倒置荧光显微镜下观察是否有荧光信号,回收上清,即为P1病毒贮液,4℃避光保存.
按照2*106个细胞/孔的量将Sf9细胞转入六孔板中,贴壁生长至少1h,每孔加入适量的上述P1病毒贮液,27℃湿盒孵育72h,收集各孔中的病毒上清液,500*g离心5min取上清,即为P2病毒贮液.
制备了高效价的P2病毒贮液后,按上述方法扩增P3贮液,用于vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP、vAcGP37和vAcEGFP的高效表达.
1.
8Westernblot检测取P3病毒贮液感染Sf9细胞,72h后将细胞吹起,500*g离心5min,取适量细胞沉淀,加50μL的SDS-PAGE上样buffer,在进行SDS-PAGE电泳后转膜,分别以GP37蛋白多克隆抗体和anti-GFP单克隆抗体为一抗,用Westernblot法检测GP37是否高效表达.
1.
9GP37的亚细胞定位用P3病毒贮液感染贴壁生长24h的Sf9细胞(覆盖玻底培养皿50%),27℃培养24h,移除细胞培养基,用PBS(pH7.
4)将细胞洗1遍,加入4%多聚甲醛(过滤除菌)室温静置固定15min,再用PBS(pH7.
4)将细胞洗1遍;加入透化液(0.
25%triton*100),室温静置10min;用PBS(pH7.
4)洗细胞,加荧光染料hoechst33258染核5~10min,然后用PBS洗3遍,再加入1mLPBS.
用激光共聚焦显微镜(TCSSP2,Leica,德国)观察绿色荧光分布情况.
2结果与分析2.
1重组病毒载体构建用0.
8%琼脂糖凝胶电泳检测表明,以pEGFP-C1为模板,以EGFP-f1和EGFP-r1为正反向引物进行PCR,扩增出删除了终止密码子(TAA)的egfp基因片段,命名为egfp(delTAA);以EGFP-f2和EGFP-r2为正反向引物进行PCR,扩增出全长egfp基因,命名为egfp(图2).
分别以Cp-f1和Cp-r1、Cp-f1和Cp-r2为正反向引物,以CpGV基因组为模板进行PCR,扩增产物经0.
8%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增片段大小分别为663bp和660bp,与预计相符,分别命名为gp37和gp37(delTAG)(图2).
图2egfp和gp37基因的PCR产物鉴定Figure2PCRresultsofdifferentfragmentsofegfpandgp37M:DL2000DNA分子标记;1:egfp(delTAA)PCR产物;2:egfpPCR产物;3:gp37PCR产物;4:gp37(delTAG)PCR产物M:DL2000DNAMarker;1:PCRresultofegfp(delTAA);2:PCRresultofegfp;3:PCRresultofgp37;4:PCRresultofgp37(delTAG)将上述PCR产物回收,分别克隆到pMD18-T载体,经酶切和测序双重验证正确后,双酶切目的片段并回收,亚克隆至pFastBacDual载体,构建质粒pD-egfp、pD-gp37、pD-egfp(delTAA)gp37和pD-gp37(delTAG)egfp.
分别用HindⅢ和PstⅠ、XbaⅠ和PstⅠ、EcoRⅠ和PstⅠ、XbaⅠ和HindⅢ双酶切pD-egfp、pD-gp37、pD-egfp(delTAA)gp37和pD-gp37(delTAG)egfp,产生的线性化质粒和目的片段大小与预期相符(图3).
图3重组表达载体的酶切鉴定Figure3RestrictionenzymedigestionoftherecombinantexpressionvectorM:DNA分子标记;1:pD-egfp(delTAA)gp37质粒;2:pD-egfp(delTAA)gp37双酶切片段;3:pD-gp37(delTAG)egfp质粒;4:pD-gp37(delTAG)egfp双酶切片段;5:pD-egfp质粒;6:pD-egfp双酶切片段;7:pD-gp37质粒;8:pD-gp37双酶切片段M:DNAMarker;1:theplasmidpD-egfp(delTAA)gp37;2:restrictionenzymefragmentsofpD-egfp(delTAA)gp37;3:theplasmidpD-gp37(delTAG)egfp;4:restrictionenzymefragmentsofpD-gp37(delTAG)egfp;5:theplasmidpD-egfp;6:restrictionenzymefragmentsofpD-egfp;7:theplasmidpD-gp37;8,批注[l14]:图的要求:1:图题、图注、横坐标、纵坐标、图例、等均需英汉对照.
2.
图中字号以小五或六号为宜,不宜太大或太小;中文用宋体,数字和英文用TimesNewRoman.
3:胶图需注明marker各条带大小,在图注中说明各泳道代表的含义.
4:图表的数据一般要经过统计检验,并标明在0.
01或0.
05水平上的差异显著性.
:restrictionenzymefragmentsofpD-gp37分别将pFastBacTMDual(空载对照)、pD-egfp、pD-gp37、pD-egfp(delTAA)gp37和pD-gp37(delTAG)egfp转座含有AcBacmid和helper质粒的DH10B感受态细胞,经培养后提取BacmidDNA.
为了验证目的基因是否整合到AcBacmid基因组中,以病毒DNA为模板,分别以通用引物M13-f和目的片段上的反向引物进行PCR检测重组病毒,同时以M13-f和M13-r为正反向引物检测不含有目的片段的对照重组病毒.
反应产物经0.
8%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果表明各个重组病毒均构建正确,分别命名为vAcDual、vAcEGFP、vAcGP37、vAcEGFPGP37和vAcGP37EGFP(图4).
图4重组Bacmid的PCR检测结果Figure4PCRresultsofrecombinantBacmidsM:DNA分子标记;1:vAcDualPCR验证结果;2:vAcEGFPPCR验证结果;3:vAcGP37PCR验证结果;4:vAcEGFPGP37PCR验证结果;5:vAcGP37EGFPPCR验证结果M:DNAMarker;1:PCRresultofvAcDual;2:PCRresultofvAcEGFP;3:PCRresultofvAcGP37;4:PCRresultofvAcEGFPGP37;5:PCRresultofvAcGP37EGFP2.
2GP37蛋白的Westernblot检测用2.
1中构建的重组病毒分别转染Sf9细胞,然后分别以anti-GFP单克隆抗体和GP37蛋白多克隆抗体为一抗,用Westernblot法检测GP37和EGFP以及二者的融合蛋白是否高效表达.
用anti-GFP作为一抗的实验中,在vAcEGFP转染的细胞中检测到大小约为30kD的目的条带,而在vAcEGFPGP37和vAcGP37EGFP转染的细胞中检测到大小约为50kD的目的条带(图5A);用GP37多克隆抗体作为一抗的实验中,在vAcGP37转染的细胞中检测到大小约为25kD的目的条带,而在vAcEGFPGP37和vAcGP37EGFP转染的细胞中检测到大小约为50kD的目的条带(图5B);作为对照,vAcDual转染后的细胞样品中没有特异性条带出现(图5A,B).
这些结果表明,无论是EGFP、GP37还是二者的融合蛋白都得到了高效表达.
图5真核表达蛋白的Westernblot检测Figure5WesternblotanalysisofproteinsexpressedininsectcellsA:用anti-GFP作为抗体的Westernblot分析结果.
M:蛋白分子量标记;1:vAcEGFPGP37表达产物;2:vAcDual对照;3:vAcEGFP表达产物;4:vAcGP37对照;5:vAcGP37EGFP表达产物.
B:用GP37抗血清作为抗体的Westernblot分析结果.
M:蛋白分子量标记;1:vAcDual对照;2:vAcGP37EGFP表达产物;3:vAcEGFP对照;4:vAcEGFPGP37表达产物;5:vAcGP37表达产物.
FP:融合蛋白A:DetectedtheexistenceofproteinsbyWesternblotusinganti-GFPantibody.
M:Proteinmarker;1:ProteinexpressedbyvAcEGFPGP37;2:vAcDualcontrol;3,ProteinexpressedbyvAcEGFP;4:vAcGP37control;5:ProteinexpressedbyvAcGP37EGFP.
B:DetectedtheexistenceofproteinsbyWesternblotusinganti-GP37antiserum.
M:Proteinmarker;1:vAcDualcontrol;2:ProteinexpressedbyvAcGP37EGFP;3:vAcEGFPcontrol;4:ProteinexpressedbyvAcEGFPGP37;5:ProteinexpressedbyvAcGP37.
FP:Fusionprotein.
2.
3GP37蛋白的亚细胞定位分别用vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP和vAcEGFP的P3病毒贮液感染贴壁生长24h的Sf9细胞,27°C培养24h,用激光共聚焦显微镜观察荧光在细胞中的分部.
结果显示,在表达EGFP蛋白的vAcEGFP感染的细胞中,绿色荧光均匀地布满了整个细胞;而无论在表达GP37和EGFP融合蛋白的vAcEGFPGP37还是vAcGP37EGFP感染细胞中,绿色荧光基本分布在核外的胞质中(无论GP37蛋白位于N端还是C端)(图6),表明CpGVGP37蛋白主要定位在细胞质中.
图6融合了EGFP的GP37在昆虫细胞中的定位Figure6SubcellularlocalizationofGP37fusedwithEGFPininfectedSf9cells分别用重组病毒vAcEGFP、vAcGP37EGFP和vAcEGFPGP37感染生长在玻底培养皿中的Sf9细胞,培养24h后弃去细胞培养基,用核燃料Hoescht33258染色,然后在激光共聚焦显微镜下观察、拍照.
绿色荧光蛋白在显微镜中呈现绿色(图中EGFP部分),而经染料染色后,细胞核呈现亮蓝色(图中Hoescht33258部分).
如二者叠加,颜色重叠部分则呈青色(图中Merge-vAcEGFP部分).
图中白色箭头所指为聚集在一起的融合蛋白Sf9cellswereinfectedwithvAcEGFP,vAcGP37EGFPandvAcEGFPGP37,respectively.
Grace'sculturemediumwasdiscarded24hp.
i.
andnucleiwerestainedwithHoescht33258.
Thesampleswereobservedunderaconfocallaserscanningmicroscope.
EGFPemittedgreenfluorescencebymicroscope(EGFPpartsinfigure),andthenucleusemittedbrightbluefluorescencebymicroscope(Hoescht33258partsinfigure)whenitwasstainedwithHoescht33258.
Whentwocolorfluorescenceimagesweremergedbytheuseoftheconfocallaserscanningmicroscope,thecyanfluorescencewereobserved(Merge-vAcEGFPpartsinfigure).
Thearrowsshowtheaggregationoffusionproteins3讨论Bac-to-Bac杆状病毒表达系统因具有对外源基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等优点(Possee,1997),现已广泛应用于外源蛋白表达(Chenetal.
,2013)和基因治疗(Hitchmanetal.
,2011;Rivera-Gonzalezetal.
,2011)等多个领域.
作为表达载体,AcMNPV被广泛用来表达各批注[l15]:照片图、电镜图等分辨率需设置在600dpi以上,且在图中注明标尺.
批注[l16]:讨论应该着重写本研究与前人研究相比较有何相同不同之处,突出本研究对前人研究结果有何突破、创新点及研究意义.
种外源蛋白和转运基因(Airenneetal,2000;Hu,2006;Kostetal,2005;López-Vidaletal.
,2013;Summers,2006).
本研究将CpGVgp37基因和egfp基因分别以融合、非融合的方式克隆到pFastBacDual载体上后转座含有AcBacmid和Helper质粒的DH10B感受态细胞,经PCR验证转座成功后,用重组的Bacmid转染昆虫细胞Sf9,以Westernblot分析蛋白的表达情况,确定了GP37蛋白可以在Bac-to-Bac系统中高效表达.
GP37是一类糖蛋白,具有几丁质结合域,该类蛋白在很多杆状病毒中都存在.
不同病毒所编码的GP37蛋白,在氨基酸序列上具有30%~40%的同源性(Chengetal.
,2001).
几种病毒所编码的GP37蛋白的亚细胞定位已经被研究,如黄杉毒蛾核型多角体病毒(OrgyiapseudotsugatamultiplenucleocapsidNPV,OpMNPV)和甘蓝夜蛾核型多角体病毒(MamestrabrassicaemultiplenucleocapsidNPV,MbMNPV)编码的GP37蛋白主要定位在细胞质中(Grossetal.
,1993;Phanisetal.
,1999),而AcMNPV和斜纹夜蛾核多角体病毒(SpodopteralituramultiplenucleocapsidNPV,SpltMNPV)GP37蛋白遍布在被感染细胞的细胞质和细胞核(Lietal.
,2003;Vialardetal.
,1990).
本研究显示,CpGVGP37蛋白的亚细胞定位与OpMNPV、MbMNPVGP37蛋白相似,主要分布在细胞质中.
在感染的细胞中,棉铃虫痘病毒(Heliothisarmigeraentomopoxvirus,HAEV)纺锤体的形成经历了fusolin蛋白在细胞核周围空间和内质网的浓缩、聚集、结晶化的过程(Lai-Fooketal.
,2000).
本研究中,GP37-EGFP融合蛋白在细胞质中也有浓缩、聚集的现象出现(图5,箭头所示),这些结果或许预示着GP37蛋白在宿主细胞中与昆虫痘病毒fusolin具有类似的特性.
杆状病毒基因的转录、基因组的复制、大量结构蛋白的合成和衣壳的组装均在被感染细胞的细胞核内(Federicietal.
,1997).
而在本研究中,CpGVGP37蛋白出现在被感染细胞的细胞质内,或许预示着该蛋白能够自由出入核膜,是一种跨膜蛋白.
杆状病毒被昆虫吞食后,在中肠的碱性环境和蛋白酶的作用下,多角体的蛋白组分被碱解,释放出病毒粒子(Occlusion-bodyderivedvirus,ODV).
ODV通过昆虫围食膜后再与昆虫中肠上皮的微绒毛结合以直接的膜融合方式侵入中肠上皮细胞,释放出核衣壳(Federicietal.
,1997).
在这个过程中,CpGVGP37蛋白是否作为跨膜蛋白辅助ODV与中肠上皮的微绒毛融合从而促进ODV进入中肠上皮细胞还没有得到证实.
作者之前的研究已经表明CpGVGP37蛋白能够增强NPV和Bt的杀虫活性(Liuetal.
,2011),但对其增效机制的研究并不深入.
通过促进ODV与昆虫中肠上皮的微绒毛的融合而增加病毒的感染力,或许就是CpGVGP37蛋白的增效机制之一.
当然,这需要进一步的研究证实.
4结论本研究通过克隆CpGVgp37和egfp基因,借助DH10B感受态细胞,将CpGVgp37和egfp基因以N端或C端融合的方式插入AcMNPV基因组中,构建了GP37和EGFP融合(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合(vAcGP37、vAcEGFP)的重组病毒,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,对融合和非融合的蛋白进行表达.
Westernblot检测到GP37和EGFP融合和非融合蛋白都得到了高效表达,为GP37蛋白后期研究工作提供了保障.
将构建的重组病毒转染并感染S.
frugiperda细胞系Sf9,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光在被感染细胞内的分布情况,证实融合GP37的EGFP主要聚集在细胞质中,而没有融合GP37的EGFP均匀分布在细胞质和细胞核中,表明CpGVGP37蛋白定位于细胞质中.
CpGVGP37蛋白的亚细胞定位研究不仅丰富了杆状病毒GP37蛋白的相关理论,同时也为CpGVGP37蛋白增效机制的研究提供基础资料.
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中文文献英汉对照.
批注[l18]:英文刊名用全称,不用缩写.
BG,pp.
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