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中国生态农业学报2010年9月第18卷第5期ChineseJournalofEco-Agriculture,Sept.
2010,18(5):954958*国家自然科学基金项目(40801097)、福建省科技重点项目(2008N0110)和福建省科技青年人才项目(2007F3018)资助宋亚娜(1973~),女,副研究员,博士,主要从事微生物分子生态学研究.
E-mail:syana@sina.
com收稿日期:2009-12-25接受日期:2010-04-13DOI:10.
3724/SP.
J.
1011.
2010.
00954水稻生育期内红壤稻田氨氧化微生物数量和硝化势的变化*宋亚娜陈在杰林智敏(福建省农业科学院生物技术研究所福州350003)摘要利用荧光定量PCR(Real-timePCR)技术,通过特异引物检测amoA基因拷贝数分析了水稻不同生育期红壤稻田土壤中氨氧化细菌(Ammoniaoxidizingbacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammoniaoxidizingarchaea,AOA)的数量变化,并测定了土壤潜在硝化势.
结果显示:红壤稻田土壤中AOA数量显著高于AOB,二者比例在1.
6~120.
7之间;红壤稻田根层土中AOA数量显著高于表土,随水稻生长根层和表土中AOA数量均逐渐增加,且根层土中增加幅度更大;在水稻生长前期表土中AOB数量较多,孕穗期后根层土中AOB数量显著增加且高于表土.
水稻生长期内土壤潜在硝化势也具有逐渐增加趋势,且根层土潜在硝化势增加幅度更大.
根层土中潜在硝化势与AOB和AOA数量均呈显著正相关,而表土中潜在硝化势只与AOA数量存在显著正相关.
研究表明,红壤稻田土壤中AOA数量更为丰富,且与硝化作用的关联程度更为密切,证实了氨氧化微生物在红壤稻田土壤微生物组成及其生态系统功能中的重要性.
关键词红壤稻田土壤水稻氨氧化细菌氨氧化古菌潜在硝化势荧光定量PCR中图分类号:S154.
3文献标识码:A文章编号:1671-3990(2010)05-0954-05Abundanceofammonia-oxidizerandpotentialnitrificationrateofquaternaryred-claypaddysoilduringricegrowthSONGYa-Na,CHENZai-Jie,LINZhi-Min(InstituteofBiologicalTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China)AbstractTheamountofammonia-oxidizingbacteria(AOB)andammonia-oxidizingarchaea(AOA)inquaternaryred-claypaddysoilsduringricegrowingseasonweredeterminedbyreal-timepolymerasechainreaction(RT-PCR)usingamoAgeneassaycopies.
Thepotentialnitrificationrateofsoilwasinvestigatedtoo.
ResultsshowthatAOAisthedominantammonia-oxidizerinquaternaryred-claypaddysoils,withAOA/AOBamoAgeneratiorangeof1.
6~120.
7.
ThereisahigherabundanceofAOAinroot-zonesoilsthaninsurfacesoils.
TheamountofAOAinsurfaceandroot-zonesoilsincreaseswithgrowthstageofrice,whichismoreevidentinroot-zonesoils.
ThereisahigherabundanceofAOBinsurfacesoilsthaninroot-zonesoilsattheearlygrowthstage,withobviousenhancementofroot-zoneAOBafterbootingstage.
Root-zoneAOBismuchabundantatthelategrowthstageofrice.
Potentialnitri-ficationrategraduallyincreaseswithtimeduringricegrowingseason,especiallyinroot-zonesoils.
Potentialnitrificationratesinroot-zonesoilsexhibitsignificantpositivecorrelationswithAOBandAOAamounts.
However,potentialnitrificationratesinsurfacesoilsareonlysignificantlypositivelycorrelatedwithAOAamount.
ThefindingsofthisstudyindicatethedominanceofAOA,whichismorestronglyrelatedwithquaternaryred-claypaddysoilnitrification.
Theresultsfurtherdemonstratetheimportanceofammo-nia-oxidizersinmicrobialcompositionandecologicalfunctionsofpaddysoils.
KeywordsQuaternaryred-clay,Paddysoil,Rice,Ammonia-oxidizingbacteria,Ammonia-oxidizingarchaea,Potentialnitri-ficationrate,Real-timePCR(ReceivedDec.
25,2009;acceptedApril13,2010)氨氧化微生物在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐,是执行硝化作用速率限制性步骤的关键微生物[1].
氨氧化微生物通过单加氧酶(amoA)活性控制氨氧化成亚硝酸盐的速率.
研究发现自然界第5期宋亚娜等:水稻生育期内红壤稻田氨氧化微生物数量和硝化势的变化955不仅存在氨氧化细菌(Ammoniaoxidizingbacteria,AOB),也存在丰富的含有amoA基因、具有氨氧化功能的氨氧化古菌(Ammoniaoxidizingarchaea,AOA)[23].
且在某些陆地生态系统中氨氧化古菌的数量和分布都比氨氧化细菌更丰富[4].
由此可见氨氧化古菌在氨氧化微生物中占有重要地位.
荧光定量PCR(Real-timePCR,RT-PCR)技术能够在指数扩增期间通过连续检测荧光信号出现的顺序和强弱来即时分析目的基因的拷贝数,与已知量标准品进行比较而实现基因的实时定量[5].
该技术已经开始运用于检测环境样品中特定微生物的数量[5].
水稻根系能够分泌O2,为水稻根表和根际提供充足的氧,足以支持非专一性的好氧微生物过程,而使水稻根际具有显著硝化作用的可能[6].
近年来国内外对稻田土壤中氨氧化微生物的研究逐渐增多.
有研究表明长期种植水稻可使稻田土壤中氨氧化细菌16SrDNA的DGGE(变性梯度凝胶电泳)条带数量增加[7];有研究发现红壤稻田土壤具有丰富的氨氧化细菌和氨氧化古菌基因资源,且水稻品种和土壤层次对稻田土壤中氨氧化细菌和氨氧化古菌群落结构组成都具有一定影响[8];此外,还有研究表明水稻根际中氨氧化古菌占据优势,其数量高于氨氧化细菌[9].
上述研究多集中于对稻田氨氧化微生物群落结构或室内盆栽试验条件下某些水稻根际氨氧化微生物丰富程度的分析,而对田间水稻土壤中氨氧化微生物的丰富程度及其作用的研究很少.
为深入探明常年稻田土壤中氨氧化微生物的丰富程度及其作用,本研究以福建省红壤稻田土壤为供试材料,运用荧光定量PCR技术,研究了水稻生长期内红壤稻田土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的数量变化及其与土壤硝化作用的关联,为进一步深入研究红壤稻田氨氧化微生物基因资源及其功能奠定理论基础.
1材料与方法1.
1供试材料选择位于福州市闽侯县南屿镇常年双季稻的早稻田为采样地.
供试地点属暖湿的亚热带季风气候,无霜期长达326d,年平均气温19.
6℃,平均湿度77%,年均降水量1342.
5mm.
供试土壤基本理化性状为:有机质含量31.
5g·kg1、pH6.
10、全氮1.
96g·kg1、全磷0.
61g·kg1、全钾17.
27g·kg1、碱解氮183.
9mg·kg1、有效磷11.
8mg·kg1、速效钾123.
6mg·kg1.
分别于水稻"汕优016"(OryzasativaL.
)的分蘖期、孕穗期和成熟期采集表土(水稻植株间0~5cm深度土壤)和根层土壤(水稻整株挖起后取10~20cm土层根系周围土壤).
早稻栽培的水肥等田间管理均按当地常规进行.
在约500m2的田块中采用5点法采集土样,将5点采集的土壤去除根系、杂草、土壤动物和石块等杂质后混匀,然后分成3份重复.
每份重复中的一部分土壤装入50mL塑料离心管中20℃冷冻保存用于土壤微生物荧光定量PCR的分析,一部分土壤装入密封塑料袋中于4℃保存用于土壤硝化势测定.
1.
2试验方法1.
2.
1土壤微生物总DNA提取采用FastDNASPINKitForSoil(QBIOgene)试剂盒方法,称取0.
5g20℃保存的土壤样品,按试剂盒的试验步骤进行土壤微生物总DNA的提取,DNA样品20℃冰箱保存待用.
1.
2.
2样品的荧光定量PCR检测氨氧化细菌和氨氧化古菌的荧光定量PCR扩增采用了amoA基因特异引物(表1)[1011],每个样品3次重复.
采用SYBRPremixExTaqTM(宝生物工程公司,TakaRa,大连)试剂盒于ABIPRISM7500Real-TimePCRSystem扩增仪上进行绝对定量PCR分析.
荧光定量PCR反应体系25μL,其中2μL稀释5倍的DNA模板加反应液23μL,反应液包括12.
5μLSYBRPremixExTaqTM(2x),0.
5μLROXReferenceDyeII(50x),前、后引物各1μL(5pmol·μL1,英骏生物工程公司,上海)和8μL超纯水.
1.
2.
3绝对荧光定量PCR标准曲线建立参照He等[12]报道的方法,以各生育期表土和根层土提取的混合DNA为模板进行氨氧化细菌和氨氧化古菌的amoA基因的PCR扩增,扩增条件如表1所示.
将100μLPCR产物用1.
5%琼脂糖凝胶电泳,分别切下含有氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因的491bp和635bp片段的胶块,用E.
Z.
N.
A.
GelExtractionKit(OMEGA,美国)胶回收试剂盒纯化.
按试剂盒方法用pMD18-T载体连接PCR产物,以大肠杆菌DH5α制备的感受态细胞转化连接产物,在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑试验筛选阳性克隆.
取部分阳性转化菌液送上海英骏生物工程有限公司进行测序.
重组质粒测序结果经GenBank的Blast比对,分别与细菌(EU697770.
1)和泉古菌(EU667887.
1)单加氧酶amoA基因同源性达99%.
表明重组质粒可以作为氨氧化微生物进行绝对荧光定量PCR分析的标准DNA.
利用E.
Z.
N.
A.
PlasmidMiniKit(OMEGA,美国)试剂盒提取重组质粒DNA,然后用Nanodrop(美国)测定重组质粒DNA的质量浓度,其中氨氧化细菌amoA基因重组质粒113.
4ng·μL1,氨氧化古菌amoA基因重组质粒241.
2ng·μL1.
根据已知重956中国生态农业学报2010第18卷表1PCR扩增引物及反应条件Tab.
1PrimersandPCRconditionsusedinthestudy项目Item氨氧化细菌AOB氨氧化古菌AOA引物序列Primersequence(5'-3')amoA-1F:GGGGTTTCTACTGGTGGTamoA-2R:CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCArch-amoAF:STAATGGTCTGGCTTAGACGArch-amoAR:GCGGCCATCCATCTGTATGT片段长度Lengthofamplicon491bp635bpPCR反应程序ThermalprofileforPCR95℃予变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环,72℃10min5minat95,followedby℃35cyclesof30sat94,℃45sat58,45℃sat72℃and72℃10min95℃予变性5min,94℃变性30s,53℃退火1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃10min5minat95℃,followedby35cyclesof30sat94℃,1minat53℃,1minat72℃and72℃10min荧光定量PCR反应程序Thermalprofileforreal-timePCR95℃予变性30s,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,40个循环30sat95℃,followedby40cyclesof30sat94℃,45sat58,45℃sat72℃95℃予变性30s,94℃变性30s,53℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环30sat95℃,followedby40cyclesof30sat94℃,1minat53℃,1minat72℃组质粒全序列和阿伏伽德罗常数(6.
02*1023分子数·mol1)分别计算amoA基因拷贝数,其中氨氧化细菌重组质粒为6.
63*1010cells·μL1,氨氧化古菌重组质粒为1.
35*1011cells·μL1.
以10倍梯度分别稀释氨氧化细菌和氨氧化古菌amoA基因重组质粒,每个稀释度进行3次重复,通过荧光定量PCR扩增分别获得氨氧化细菌和氨氧化古菌的amoA基因标准曲线.
其中,氨氧化细菌标准曲线的R2为0.
98,斜率为3.
0,线性范围达到6个数量级(6.
63*102~6.
63*107cells·μL1);氨氧化古菌标准曲线的R2为0.
99,斜率为3.
4,线性范围达到6个数量级(1.
35*104~1.
35*109cells·μL1).
1.
2.
4土壤潜在硝化势测定根据Kurola等[13]的方法,取5g鲜土于50mL离心管中,加20mL含(NH4)2SO4的1mmol·L1磷酸缓冲液(g·L1:NaCl,8.
0;KCl,0.
2;Na2HPO4,0.
2;NaH2PO4,0.
2;pH7.
4),室温黑暗培养24h,加入终浓度为10g·L1氯酸钾抑制亚硝酸盐氧化;培养后加入5mL2mol·L1KCl提取NO2-N,离心后用格里斯试剂比色法测定提取液中NO2-N浓度,以μg(NO2-N)·g1·h1(干土)表示土壤硝化势.
1.
2.
5数据分析利用SPSS13.
0软件进行数据方差分析和相关性分析.
2结果与分析2.
1不同生育期红壤稻田土壤氨氧化微生物数量的变化运用荧光定量PCR检测红壤稻田不同生育期内土壤氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的数量变化.
由图1可知,水稻分蘖期稻田表土中AOB数量明显(Pwww.
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