布鲁氏菌www.amazon.cn

生物工程学报ChinJBiotech2011,May25;27(5):812816journals.
im.
ac.
cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@im.
ac.
cn2011CJB,Allrightsreserved.
Received:January20,2011;Accepted:April8,2010Supportedby:KeyProjectsintheNationalScienceandTechnologyPillarProgramduringtheEleventhFive-YearPlanPeriod(No.
2006BAD06A10).
Correspondingauthor:ZaishiWang.
Tel:+86-10-62103670;Fax:+86-10-62103671;E-mail:wangzaishi@ivdc.
gov.
cn"十一五"国家科技支撑计划(No.
2006BAD06A10)资助.
研究报告牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的研制李翠,关孚时,戴志红,蒋卉,温芳,陆连寿,王在时中国兽医药品监察所,北京100081摘要:为制备标定凝集试验用的牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品,采集4份田间自然感染牛布鲁氏菌病的阳性血清作为候选物,经过筛选后,选择了3#血清用于标准品制备.
对该标准品进行了物理性状、无菌检验、真空度测定、剩余水分检验、均匀性检测和稳定性试验,检测结果均符合要求.
以国际标准品为参比,测定了该标准品的RBT、SAT和CFT效价,结果分别为1∶160"+"、1∶2400"++"、1∶800"++",与协作标定结果完全一致.
该标准品以国际标准品溯源的国际单位含量为4000IU/mL.
关键词:牛布鲁氏菌病,阳性血清,国家标准品,效价测定,均匀性,稳定性Preparationandcharacterizationoffollwingthenationalstandardanti-Brucellaabortusserum,bovineCuiLi,FushiGuan,ZhihongDai,HuiJiang,FangWen,LianshouLu,andZaishiWangChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,ChinaAbstract:Toprepareanti-Brucellaabortusserumusedforcalibratetheagglutinationtestfollwingthenationalstandard,4anti-Brucellaabortusserawereobtainedfrom4cowsinfectedwithBrucellaabortusnaturally.
Bypotencytesting,thethirdserumwasselected.
Sterility,vaccumdegree,residualmoisture,uniformityandstabilityofthisstandardmaterialweretestedandprovedtomeetthenationalstandard.
Referringtotheinternationalstandard,RBT(Rose-Bengalplateagglutinationtest),SAT(standardtubeagglutination)andCFT(complementfixationtest)titersofthisstandardmaterialweremeasuredtobe1:160"+",1:2400"++"and1:800"++",whichareidenticalwiththecollaborativeassayresults.
Internationalunitofthestandardmaterialis4000IU/mL.
Keywords:Brucellaabortus,anti-serum,thenationalstandard,potencystandardization,homogeneity,stability牛布鲁氏菌病通常由牛型布鲁氏菌(前称流产布鲁氏菌)引起,其感染呈全球趋势,给世界上很多国家和地区带来了严重经济损失[1-2].
世界动物卫生组织(OfficeInternationalDesEpizooties,OIE)将李翠等:牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的研制813Journals.
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cn其列为B类动物传染病.
目前,血清学检查是牛布鲁氏菌病诊断的常用方法[3-6],为了促进其诊断试验的国际一体化和抗原标准化,世界卫生组织(Worldhealthorganization,WHO)生物学标准化专家委员会于1952年建立了第一批牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品[7](可从OIE的布鲁氏菌参考实验室即英国卫桥VeterinaryLaboratoriesAgency,VLA获得),该国际标准品得到国际上的普遍认可,广泛用于标化布鲁氏菌病的凝集试验.
因此,以该国际标准品为溯源制备一批国家标准品,对解决我国布鲁氏菌病血清学诊断中的实际问题具有重要意义.
本实验即是以VLA获得的牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品[8]为溯源,建立一批国家级标准品,用于标定牛布鲁氏菌病凝集试验.
1材料与方法1.
1主要试剂和耗材牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品:从英国卫桥VLA-OIE布鲁氏菌病参考实验室获得,批号为N/A,1000IU/mL,标化虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)预期滴度分别为1/47.
5、2/650和2/200;牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验用抗原:购自英国CentralVeterinaryLaboratory(CVL),产品编号为PA0060,批号为270;牛布鲁氏菌病试管凝集试验用抗原:由中国兽医药品监察所制备,产品编号为200801,工作浓度为1∶20;牛布鲁氏菌病补体结合试验用抗原:购自英国CVL,产品编号为0066/03,批号为10,工作浓度1∶10;96孔U型底微量反应板:购自GREINER公司.
1.
2候选物的制备黑龙江省某农场田间自然感染牛布鲁氏菌病的奶牛4头,以颈动脉采血法采血于无菌的大量筒中,置20℃左右4h,待血液凝固后每个盛血量筒无菌操作加压铜.
静置,待血清析出后,取上清,4000r/min离心20min分离血清.
1.
3候选物筛选以英国卫桥(VLA)牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品为参比,按文献方法[9-11]分别测定RBT、SAT和CFT效价.
1.
4分装、冻干、熔封将符合要求的候选物先经0.
4μm无菌滤膜加压过滤,再经0.
22μm无菌滤膜加压过滤;随后用瓶颈分液器(分装精度为±0.
01mL)无菌分装至1mL灭菌长安瓿,按常规方法冻干后抽真空、熔封.
1.
5成品检验1.
5.
1物理性状随机抽取5支样品,观察颜色和形状,再打开安瓿加去离子水(可以低速涡旋或用移液器轻轻吹打),记录溶解情况.
1.
5.
2无菌检验、真空度测定、剩余水分测定随机抽取规定数量的样品,按文献方法[9-10]进行.
1.
5.
3效价测定随机抽取规定数量的样品以英国卫桥(VLA)牛布鲁氏菌病阳性血清国际标准品为参比,按文献方法[9-11]分别测定RBT、SAT和CFT效价.
1.
5.
4均匀性检验随机抽取规定[12]数量的样品,用国际标准品为参比按文献方法[9-11]分别测定RBT、SAT和CFT效价.
1.
5.
5稳定性试验[13]随机选取规定数量的样品分别放56℃、37℃和25℃温箱在规定时间取样品分别进行CFT和SAT试验测定其效价.
1.
5.
6协作标定组织4家协作标定单位按统一的协作标定方案,以国际标准品为参比测定其RBT、SAT和CFT效价,试验完成后统计数据[14],确定待检国家标准品国际单位含量.
814ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechMay25,2011Vol.
27No.
5Journals.
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cn2结果与分析2.
1候选物筛选实验结果表明,4份血清的RBT效价、SAT效价(表1)和CFT效价(表2)均为牛布鲁氏菌病阳性,而且3#血清的效价最高.
所以选择3#血清作为制备牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的原材料.
表1候选物筛选试管凝集效价测定结果Table1SATtitersoftheselectedcandidatesNo.
ofseraPositiveNegativeseraseraDilutionfactorsofmixedsera1:3001:4001:5001:6001:7001#1mL+1.
2mL2#1mL+0.
1mL3#1mL+2.
8mL4#1mL+2.
0mLint.
sera#:completeagglutination;+++:75%agglutination;++:50%agglutination;+:25%agglutination;:incompleteagglutination.
表2候选物筛选补体结合试验效价测定结果Table2CFTtitersoftheselectedcandidatesNo.
ofseraPositiveNegativeseraseraDilutionfactorsofmixedsera1:1201:1601:2001:2401:2801#1mL+2mL2#1mL+0.
5mL3#1mL+5mL4#1mL+4mLint.
sera#:incompletehemolysis;+++:25%hemolysis;++:50%hemolysis;+:75%hemolysis;:completehemolysis.
2.
2成品检验结果2.
2.
1物理性状所有冻干阳性血清为淡黄色疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解,溶解后为淡黄色澄明液体.
2.
2.
2无菌检验、真空度测定和剩余水分测定无菌检验和真空度测定结果均符合规定,剩余水分测定结果分别为2.
8%、2.
9%、2.
4%和2.
4%,均低于4%,符合要求.
2.
2.
3效价测定随机选取5支冻干血清测定其RBT、SAT和CFT效价分别为1∶160"+"、1∶2400"++"、1∶800"++".
2.
2.
4均匀性检验随机选取15支冻干血清测定其RBT、SAT和CFT效价分别为1∶160"+"、1∶2400"++"、1∶800"++",说明该冻干血清的均匀性良好.
2.
2.
5稳定性试验稳定性试验结果见表3,冻干血清56℃温箱保存3周时其CFT和SAT效价开始逐渐下降,37℃温箱保存8周时其CFT和SAT效价开始逐渐下降,25℃温箱保存9周时其CFT和SAT效价开始逐渐下降.
表3成品检验稳定性试验结果Table3ProducttestresultsofstabilitytestTimeofpreserving(weeks)PreservingtemperatureTestmethods12346810CFT1:8001:8001:6001:6001:4001:40056°CSAT1:24001:24001:16001:24001:16001:16001:1200CFT1:8001:8001:8001:60037°CSAT1:24001:24001:24001:16001:24001:1600CFT1:8001:60025°CSAT1:24001:16001:2400:notest.
李翠等:牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的研制815Journals.
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cn2.
2.
6协作标定汇总四家协作标定单位的实验结果表明,以国际标准品为参比测得该牛布鲁氏菌病阳性血清国家标准品的CFT效价均为1∶800"++"、SAT效价均为1∶2400"++"、RBT效价均为1∶160"+",该标定结果与研制该国家标准品时标定的结果一致.
本实验按照WHO的要求[15]和国家一级标准物质技术规范[16]中标准物质的制备程序以国际标准血清为参比研制国家标准品.
为提高产品质量,本实验采取了以下措施:一是对国家标准品的候选物进行筛选,尽量保证候选物的质量;二是以国际标准血清为参比测定冻干血清的RBT、SAT和CFT效价,尽量准确测定血清的效价;三是对冻干血清进行了均匀性检验,保证了冻干血清的均匀性;四是对冻干血清进行稳定性试验,提供了其保存期监测数据;五是组织协作标定,对不同协作标定单位的试验结果进行统计,最终以国际标准品为溯源确定了国家标准品的国际单位为4000IU/mL,保证了其实际使用中的国际统一性.
该国家标准血清可用于以下方式来标化牛布鲁氏菌病凝集试验,即标化抗原:由于该标准血清在当地试验条件下补体结合效价、虎红平板凝集和试管凝集效价均已明确.
随后批次的牛布鲁氏菌病补体结合试验用抗原、虎红平板凝集试验用抗原和试管凝集试验用抗原的最终滴度应当以该国家标准阳性血清来检测;常规试验的对照:为了检测结果可信,试验条件保持不变,每批牛布鲁氏菌病凝集试验都应以该标准品为参比进行滴度测定;结果表达:由于试验体系中各种变量同时影响标准血清和被检血清的效价,所以以国际单位表达结果不依赖于所采用的特殊试验体系.
因此在每个不同实验室进行牛布鲁氏菌病凝集试验获得的结果可以以一种有效的方式进行比较.
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