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第l8卷2期2003年4月中国病毒学VIR0L0GICASⅡIGA18(2):l1l—l14April2003HPV1611基因的克隆及其在真核细胞中的表达吴琦,黄利呜2,卫洪昌f1.
上海中医药大学病理教研室,上海,200032;2.
三峡大学医学院病理教研室,湖北宜昌,443oo0)GeneCloningandEukaryoticExpressionofHPV1611GeneWUQi,HUANGLi—ming料,WEIHong—chang(1.
DepartmentofPathology,Shang—haiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShangHai200032,China2.
DepartmentofPathology,MedicineSchoolofThreeGorgeUniversity,MChang443000,China)Abstract:TocloneandexpressinvitroHumanpapillomavirustype1611(HPV16L1)gene,andprovideagoodbasisforfurtherresearchDNAvaccineagainstHPV16infectionandhumancervicalcancer,theHPV1611genefragmentwasamplifiedfromgenomeofpl6L1BN1byPCRandclonedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.
0.
SequencingshowedtheplasmidpcDNA3一HPV16L1wasconstructedsuccessfully.
ThentherecombinantplasmidpcDNA3一HPV16L1transfected7721humanlivercancercellsusingLipofectamine2000reagent.
Themolecularweightoftheexpressedprotein,was55kDa,analyzingbySDS—PAGE,assameasthemolecularweightofHPV16L1.
TheWesternblottingresultshowthattheexpressedproteincouldbedetectedbyHPV16L1specificmonoclonalantibody.
ThisstudyprovidedagoodbasisforfurtherresearchonHPV16L1DNAvaccine.
KeyWords:Humanpapillomavirus;Molecularclone;Vaccines;Eukaryoticcell摘要:克隆并表达人乳头瘤病毒l6型(HPV16)晚期基因zJ,以期为研制防治宫颈癌的DNA疫苗奠定基础.
本实验采用PCR方法从质粒pl6L1BN1中获得HPV1611基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体中,核酸序列鉴定HPV16ll基因真核表达质粒构建成功,再用脂质体介导基因转染7721人肝癌细胞.
转化阳性细胞经SDS.
PAGE显示在分子量大约为55kDa的位置出现一条特异性条带,与HPV16L1分子量大小相符.
表达产物经Westernblotting分析:能与HPV16L1单克隆抗体特异结合.
真核表达质粒pcDNA3.
HPV16L1构建成功并能在真核细胞7721中有效表达,为下一步进行动物DNA免疫实验奠定了基础.
关键词:乳头瘤病毒;分子;克隆;疫苗;真核细胞中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:1003.
5125(2003)02一Ol11-04高危型人乳头瘤病毒16型(Humanpapilloma.
virustype16,HPV16)的感染与宫颈癌及人类许多肿瘤的发生密切相关.
研究表明:Ll蛋白能刺激机体产生中和抗体,在动物实验中可保护动物免受相同型别HPV的攻击¨J,因此ZJ基因是研究HPV预防疫苗的重要靶基因.
国内关于16型ZJ基因表达系统的报导多以腺病毒载体[2】、杆状病毒载体L3J及原核表达系统J为主,对于构建其真核表达系统(非病毒载体型),并在体外观察表达产物与特异性抗体结合反应的报导较少.
由于以裸DNA为主的核酸疫苗与重组病毒疫苗、VLPs(virus—likeparticles,VLP)疫苗相比具有安全、免疫原性强等特点,故本研究以HPV1611为目的基因,利用PCR克隆技术构建真核表达质粒pcDNA3一HPV16L1,制备HPV16型DNA疫苗,再运用脂质体转染技术转化7721人肝癌细胞株,观察其在体外表达,为下一步动物体内基因免疫试验打下基础.
收稿日期:2002.
09—02,修回日期:2002—10-30基金项目:湖北省自然科学基金资助(2002AB141)作者简介:吴琦(1977一),女,浙江省义乌籍,硕士在读,专业为肿瘤分子病理学.
黄利鸣(1958一),男,湖北宜昌籍,教授,硕士导师,从事宫颈癌相关病毒的研究.
Correspondenceauthor.
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com112中国病毒学第18卷1材料和方法1.
1材料1.
1.
1质粒、菌种和细胞株:质粒p16LIBN1(含HPV16ll全长基因,由于修平教授构建惠赠),真核表达载体pcDNA3.
0(含CMV启动子)、大肠杆菌DH5Q及TA克隆载体pMD18一T(大连宝生物公司产品)由山东医科大学分子生物学实验室提供,7721人肝癌细胞株购于中国科学院上海细胞所.
1.
1.
2主要试剂:限制性内切酶BamHI,HindIII,XbaI,T4连接酶,DNAMarker及PCR扩增试剂盒均为大连宝生物公司产品;质粒提纯及酶切片段回收试剂盒为Qiagen公司产品.
Lipofectamine2000Reagent,胎牛血清,RPMI1640购自GIBCO公司.
G418购自上海生工生物工程有限公司.
鼠抗HPV16L1单克隆抗体由卞继峰博士(山东医科大学分子生物学实验室)提供,羊抗鼠二抗购自北京中山生物公司.
低分子量标准蛋白质为Pharmacia公司产品.
1-2方法1.
2.
1PCR扩增目的片段:特异性引物P1、P2序列如下:P1:GCA!
!
ATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTP2:AGC!
!
TI'ACAGCTTACGTITTTTGCG上下游引物5'端各加入fII内切酶识别序列(画线部分)和保护碱基.
以质粒pl6L1BN1为模板,按照94~C变性3min,然后94℃45s,60℃45s,72℃1.
5min,循环30个周期后,72℃延伸7min.
1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果.
1.
2.
2HPV16llT—A克隆构建:PCR产物3'端多出的A碱基与载体pMD18一T的5'端的T碱基互补,于16~C连接过夜,以常规CaC12法转化感受态DH5o,在含有氨苄的LB平板上37~C培养过夜筛选阳性菌落,BamHI单酶切鉴定重组子pT-A16L1.
1.
2.
3真核表达质粒pcDNA3一HPV16L1的构建:重组体pT—A16ll经HindIII,XbaI双酶切,回收HPV16ll片段(约1.
52kb).
真核表达载体pcDNA3.
0同样经HindIII,XbaI双酶切回收,与回收的HPV16/1片段以1:3的摩尔比混合,16℃连接过夜,转化感受态DH5o,在含有氨苄的LB平板上37"C培养过夜筛选阳性菌落.
HindIII,XbaI双酶切鉴定重组质粒pcDNA3一HPV16L1,同时进行克隆片段全长测序(上海生工生物工程有限公司完成),以检查重组质粒中克隆片段核苷酸序列的改变情况.
1.
2.
4细胞转染及筛选:将7721人肝癌细胞株接种于6孔板中,37"C5%CO2条件下培养至80%汇合时,用脂质体转染的方法分别导入经PEG法纯化的质粒pcDNA3一HPV16L1和空载体pcDNA3.
0,在含有G418的RPMI1640中培养48h,筛选阳性转化细胞,G418的有效浓度为400ug/laL.
1.
2.
5表达产物的SDS—PAGE分析:收集阳性转化细胞沉淀,重悬于2*SDS—PAGE上样缓冲液中,100℃沸水煮8min,取出15pL上清液作12%SDS—PAGE,凝胶经考马斯亮兰R一250染色,脱色后照相.
1.
2.
6WesternBlot鉴定参照文献】:样品制备及SDS—PAGE同上.
将凝胶中蛋白质转印至硝酸纤维素膜上,100V2h,PBS洗3次,PBS+3%BSA封闭1h,加入PBS+I%BSA稀释的HPV16L1单克隆抗体(1:1000),37℃2h,TBS洗涤3次,加入TBS+1%BSA稀释的酶标二抗(1:500),37℃2h,TBS洗涤3次,DAB显色.
2结果2.
1重组质粒构建流程如图1:T,,一-、-/pcDNA3.
0I加II//indⅢ焉HPV16L,,@G400511lhn-1Bbp、',加—.
.
<.
一Jr删m图1重组质粒构建图Fig.
1Schemeforconstructionofrecombinantplasmid2.
2PCR扩增利用特异性引物扩增片段约1.
52kb,与HPV16@曼~^维普资讯http://www.
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comll4中国病毒学第l8卷位,且无病毒核酸的污染,又有很强的免疫原性和免疫综合性,可刺激机体产生中和抗体IgG、IgA¨,预防HPV16的感染,具有重要的开发价值.
由于HPV目前尚不能在体外大量培养,又有潜在的致癌性,故有关HPV16预防性疫苗的研制只能通过基因工程手段来实现.
相对于目前存在的多肽疫苗、重组病毒疫苗、VLPs疫苗等,以真核表达质粒为主体的DNA疫苗具有研制工艺简单、使用安全、可长期诱导免疫应答等特点,特别是肌肉注射免疫后可产生较强的T细胞反应J,众所周知,在抗肿瘤和抗病毒感染中细胞免疫占主导地位,因此研究HPVDNA疫苗具有更广阔的应用前景.
在载体的选择上,我们使用具有表达量高,表达产物稳定的真核表达载体pcDNA3.
0.
它含有CMV启动子、Amp选择基因和未甲基化的CpG序列.
CMV启动子是一种适应性较广泛的启动子,对肌肉注射比较理想;Amp选择基因含有免疫激活DNA序列ISS,可增强DNA疫苗的表达效率及免疫效果;而未甲基化的CpG序列是一种很强的自身佐剂,可促使体内建立Thl型占优势的免疫反应.
体外结果显示本研究构建的含CMV启动子表达质粒pcDNA3一HPV16L1能在7721真核细胞中有效表达Ll蛋白,证明HPLV16L1真核表达质粒构建成功,为进一步进行动物实验研究HPV16L1DNA疫苗的免疫效果奠定基础.
致谢:在本课题的实验过程中,山东医科大学分子生物学实验室的于修平、刘贤锡、卞继峰等老师给予了极大的帮助和指导,特此感谢!
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