定量pcr定量PCR实验后,一般要得到什么样的结果?

实时定量PCR的结果是怎样分析的？

摘要】 目的 探讨实时荧光定量PCR不同结果分析模式对检测结果的影响。

方法 用LineGene FQD33A型荧光定量PCR检测系统检测本院门诊和病房乙肝病人血清HBV DNA 77份，分别用最大二阶导数法和样点拟合法进行结果分析。

结果 发现两种分析方法的总体相关性较好（r= 0.978）。

但HBV DNA拷贝数含量＜105时， 两种模式的相关性差（r= 0.706），此时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低（t=2.61,P＜0.05），且易出现假阴性结果。

结论 虽然样点拟合法步骤较多，但其结果更可靠，因此进行结果分析时，建议使用样点拟合法。

而且当样本中HBV DNA拷贝数＜105时只能使用样点拟合法进行结果分析。

【关键词】 实时荧光定量； 聚合酶链反应； 质量控制 　　Effects of Different Analysis Mode of LineGene Real Time Quantitative PCR System on Results 　　Chen Yingjian,Hu Chengjin,Qi Falian，Xu Jun 　　（Department of Laboratry Medicine，PLA General Hhospital of Jinan Military Area,Jinan 250031,China) 　　Abstract： Objective To observe the effect of different quantitative analysis modes on results. Methods Using LineGene fluorogenic quantitative PCR detection system to detect HBV DNA of 77 patients and second derivative maximum method and fit point method to analyze results.Results In general, results got from the two methods had good relativity(r=0.9789). But when HBV DNA copy is less than 105 per ml, the relativity is poor(r=0.706). Results got from second derivative maximum method is lower than from fit point method, and prone to get false negative results. Conclusion Although fit point method is plicated than second derivative maximum method, the corresponding results is more reliable. Fit point method should be the first choice, and when DNA copy is less than 105 per ml, fit point method is the only method one could use. 　　Key words： real time fluorogenic quantitative PCR; polymerase chain reaction(PCR); quality control 　　实时荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQPCR）技术是近几年才应用于临床的。

它融汇了PCR技术的核酸高效扩增，探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。

具有完全封闭操作，仪器直接读数，结果判断更客观真实，定量范围宽(可达～108拷贝/ml)，且无需样品梯度稀释等特点。

在单管封闭的条件下，实现对PCR扩增产物的实时动态检测和自动结果分析，从根本上解决了PCR扩增产物的污染和不能定量的问题，并通过探针杂交进一步提高了特异性[1]。

但由于不同仪器在软件设计上的不同，致使相同标本在不同模式下计算的结果差别较大。

现以LineGene FQD33A型荧光定量PCR检测系统为例，分析如下。

　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　(1)检测标本：本院门诊和住院的乙肝病人血清，共77份。

（2）仪器：LineGene FQD33A型荧光定量PCR检测系统。

（3）试剂：深圳匹基基因诊断技术有限公司生产的乙型肝炎病毒(HBV)PCR荧光定量检测试剂盒。

　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA模板提取 　　采用聚乙二醇沉淀，表面活性剂裂解方式提取DNA模板。

在0.5 ml离心管中分别加入血清标本和聚乙二醇各100 μl，振荡混匀后于13 000 r/min离心10 min，吸干上清后，向沉淀中加25 μl表面活性剂，充分混匀后置99℃干浴10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。

　　1.2.2 核酸扩增与荧光数据采集 　　在PCR反应管中分别加入36 μl的PCR反应液和2 μl的模板提取液，稍加离心(混匀)后上机扩增。

循环条件设置为37℃，3 min；92℃,1 min后进行92℃，5s；60℃，30 s，共40个循环。

在60℃时单点收集荧光信号；仪器检测通道选择F1。

　　1.2.3 定量数据分析 　　扩增完毕后，仪器自动进入结果分析界面。

仪器提供两种分析模式：最大二阶导数法和样点拟合法。

利用最大二阶导数法分析结果时，将零点调整为2~10，单击“定量分析”，得到定量结果；利用样点拟合法时，将零点调整为2~10，噪声容限设定标准按照基线设置在各样本噪声上方，并尽可能的低的原则。

单击“定量分析”，设置阈值，阈值位置的设置综合考虑相关系数、误差等参数。

　　1.3 统计学处理 　　对两种分析方法所得定量结果进行相关分析，两方法间的差异显著性采用t检验。

　　2 结果 77份标本按两种方法进行定量数据分析，将得到的数据进行相关分析，结果显示：两种方法定量结果的总体相关性较好（r=0.978）（见图1），但当结果的数量级＜5时，两方法定量结果的相关性差（r=0.706）（见图2）。

用配对计量资料比较的t检验分析显示：HBV DNA拷贝数含量＜105时，最大二阶导数法要比样点拟合法得出的数值低（t=2.61,P＜0.05）。

而且当PCR扩增反应曲线不典型时（如图3，4），易出现假阴性结果。

　　3 讨论 　　LineGene实时荧光定量PCR检测系统以荧光实时检测方式分析PCR模板的数量，可采用DNA双链特异结合的荧光染料（如SYBR Green I）、荧光共振能量转移（FRET）的杂交探针技术以及水解探针模式（即Taqman 技术）。

本研究所采用的HBV DNA荧光定量试剂盒即为后者，在探针的5'末端标记发光基团，3' 末端标记淬灭基团。

在外来光源的作用下，由于淬灭基因的吸收作用而使发光基团不能发出荧光。

只有当探针与模板退火，并延伸过程中，由于Taq 酶5'外切酶活性，将探针5'末端的发光基团切割下来，发出荧光。

切割下来的荧光基团分子数与PCR产物的量成比例，因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量[3]。

　　LineGene实时荧光定量PCR检测系统可以提供最大二阶导数法和样点拟合法两种分析模式。

最大二阶导数法方法简便，进行零点调整后，即可得到分析结果。

样点拟合法需要进行零点调整、噪声容限设定、阈值设置，较繁琐，需要一定的经验。

究竟在实际工作中选用哪一种方法，需要对两种方法得到的结果进行比较才能得出结论。

因此，我们同时用两种方法分析结果，比较所得数据。

发现两种方法定量结果的总体相关性较好（r=0.978），而当结果的数量级＜5 h，两方法定量结果的相关性差（r=0.706）。

而且当结果的数量级＜5时，最大二阶导数法得出的数值要比样点拟合法低（t=2.61,P＜0.05）。

另外，当PCR扩增反应曲线低平时，样点拟合法分析结果为8.7×108，而最大二阶导数法为0。

查阅病人资料发现此病人为乙肝患者，五项指标结果为"大三阳"，样点拟合法所得结果符合临床表现，最大二阶导数法得到结果为假阴性。

而在PCR扩增反应曲线出现较晚、上升较慢时，样点拟合法分析结果为104左右，而最大二阶导数法分析结果较低，甚至出现阴性。

综上所述，在进行实时荧光定量PCR的数据分析时，为避免假阴性的出现，最好采用样点拟合法。

半定量RT-PCR和定量RT-PCR的区别

半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便，可快速推测样品中特异mRNA的相对数量；而定量RT-PCB可实时定量，较半定RT-PCB更准确。

1. 半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。

2. 定量RT-PCR（quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时定量PCR，定义

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。

实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。

如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-time RT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。

RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。

实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。

该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

定量PCR的名词定义

广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型： 1. 外参法+终产物分析　所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。

这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。

2. 内参法+终产物分析　所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。

这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。

3. 外标法+过程监测　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。

4. 内参法+过程监测　由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。

5. 外标法+过程监测+内对照　这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。

这种类型是应该提倡的。

　PCR过程的监测有多种检测模式。

最常用的有三种检测模式，见下面检测模式的内容。

狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。

在国家没有出台阴阳判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。

从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。

荧光定量PCR的 简单解释

简单来说普通PCR是终点检测,即实验结束后检测PCR的产物,而荧光定量PCR全称应该是实时荧光定量PCR,是过程检测,即检测PCR过程中每个循环PCR产物的变化,用绝对定量或相对定量,来研究需要解决的问题,如mRNA表达水平的变化,初始模板的浓度等等

定量PCR实验后,一般要得到什么样的结果?

定量PCR有绝对定量跟相对定量，绝对定量就是先用已知浓度的质粒浓度梯度（1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03）制作标准曲线，然后通过做Real-time PCR的CT值计算出其表达量；相对定量是比较管家基因（GAPDH）与目的基因的CT值，得出各标本之间目的基因表达量的多少。

目前实时荧光定量PCR主要用两种方法：染料法和探针法，如果科研资金充足的话，建议选用探针法，其数据比染料法准确。

染料法也可以达到定量的目的，而且比较廉价。