定量pcr实时定量PCR的意义

定量PCR的质量评价

RNA 定量的程序很多， 比较用了Ribogree,Agilent BioAnalyser,spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。

结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。

所以用不同的方法进行定量是不明智的。

因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。

RNA 质量 RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。

传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。

Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。

Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。

样品的RINs在10-4之间。

10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。

由于以上的方法并非100%准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。

这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。

我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。

设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。

探针设计的位点分别位于3’；5’以及中部。

扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。

如果3’；5’的比值在1，反应较高度完整性，如果高于5说明降解。

QRT-PCR抑制物的组成 QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。

抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG. 是否有抑制物的评价体系： 1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测 2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况 3.用细菌检测临床样品的抑制 4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况 反转录反应系统 1.RT和PCR单一酶系统 2.RT和PCR分离的酶系统 3.RNA逆转录引物的选择 引物主要有三种： 1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物. 2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难 3.特异引物：最特异最灵敏的方法。

特别RNA量足够情况下建议使用此法。

定量PCR，半定量PCR和相对定量PCR有什么差异

以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本 中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。

根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为四种：

①有限稀释法，即倍比稀释法： 通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止，来设置已知浓度的参照品；根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模 板的分子数；利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点。

优点是不需要特殊设备，缺点是扩增反应条件要标准化，严格注意污染，避免假阳性的产生。

②使用 外参照物的定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后做出标准曲线图，未知的标本按这标准曲线找出对应的拷贝数。

荧光定量PCR通 常使用该法做标准曲线。

③使用非竞争性内参照物的定量：PCR反应条件同样，在同一试管内，用两对引物，同步扩增来自同一DNA的一段靶序列和另一段内标 序列。

通过比较两种序列的扩增产量可对靶序列定量:

方法A、设计并合成PCR扩增靶基因及无关基因的引物，优化引物配比的条件。

方法B、在指数增长期实现 对靶基因及一系列已知含量无关基因的PCR扩增。

方法C、PCR产物琼脂糖凝胶电泳，EB 染色。

方法

D、电泳条带的紫外光下分析。

方法E、二者荧光强度相等管的DNA含量亦相等。

该方法只有当靶序列和内标序列以相同的量存在时，才能对两者相对 定量；也是对处于扩增指数期的PCR产物定量。

④使用竞争性内参照物的定量PCR：同样的反应条件，同一个试管，用同一对引物，同步扩增靶序列和内参照序 列。

靶基因的量可通基本条件是靶序列和竞争性序列均用相同的引物以相同的效率扩增，两序列的初始化比值在整个反应过程中保持不变。

目的DNA 内参照DNA 变性（同一对引物）PCR竞争性模板的设置：通过改变克隆的靶基因的序列来设计竞争性模板插入新的限制性酶切位点或使原来的酶切位点缺失通过基因重组技术 插入一个与特异性蛋白结合的DNA片段，或者使靶序列发生定点诱变人工合成竞争性模板。

竞争性模板设计目的：使其与靶基因的PCR扩增产物相区别（通过酶 切、杂交、显色等手段实现）。

常用的荧光定量为TaqMan探针技术，他特异的和目的片段结合，只是用的是TaqMan。

半定量RT-PCR用做内参照， 也应该是第三种，只是它是普通PCR，通过电泳的条带强弱，与GAPDH的比值，分析他们的灰度值半定量，个人认为数据不可靠，应该用TaqMan做相对 定量或绝对定量。

用rt-pcr比较两株细胞表达量的差异的时候，不一定要把两株细胞调整为相同浓度，因为要做内参照，可以校正模板量的差异

什么是实时荧光定量PCR，检测指标是什么？

实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量，在扩增过程中，荧光信号随着PCR产物的增加而增强。

我们实验室使用的BIOGHSC Super Probe Kit PCR实验检测DNA,测得的循环数在28左右，整个PCR过程有4个阶段，基线期---指数增长期---线性增长期---平台期，指数增长期内，PCR有高度重复性，一般的检测指标是看线性图谱的扩增曲线的起跳值（CT值）。

什么是实时定量PCR？有什么作用？请用自己的话详细说明。

PCR的全称是：多聚酶链反应，用俗话说就是人为地制造一个环境，使双链基因片段进行复制、扩增 目的基因：就是你想要扩增的基因片段 变性：是在热的环境下使双链解链，一般需要94摄氏度 引物：引导复制的开始，是一种RNA单链片段，能引导复制的起始位置 聚合酶：用的是Taq酶是在火山口找到的一种耐热的酶，在它的作用下以四种脱氧核苷酸（dNTP）为原料合成双链 延伸：通俗点说就是原来的模板链和新合成的单链组成一条新的双链的过程，延伸时间的长短、温度的高低会影响新双链的质量 PCR的大致过程 1、模板DNA 2、（第一轮循环）：模板DNA变性和引物复性 3、（第一轮循环）：引物延伸 4、（第二轮循环）：新合成的双链变性和引物复性 5、（第二轮循环）：引物延伸 …… 如此往复，直至结束 之后可以泡个琼脂糖电泳看看扩增的情况，也可以测OD值，计算浓度 现在也有real time PCR，实时定量PCR，可以在间隔相等的时间测反应物的浓度，获得相对较准确的数据，比较简便。

总的来说，做分子生物学实验就是一项烧钱的活

实时定量PCR的意义

实时定量PCR是靠检测CT值（就是达到检测阈的循环数）从而测定原组织内mRNA量的实验手段。

通过和标准曲线比对，可以精确知道原组织中某基因转录产物mRNA的量，从而对表达强度等进行分析。