序列首只警用克隆犬

第l7卷1期2002年2月中国病毒学VIROLOGICASIN1017(1):82—86February2002不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析范泉水,夏成柱,邱薇,黄耕,何洪彬,余春,乔军5武银莲,l殷震I(1成都军区联勤部军事医学研究所,昆明650032;2中国^民解放军农牧大学军事兽医研究所,长春130062;3.
东北农业大学,哈尔滨150030;4北京军区军走队.
北京昌平100021;5.
塔里术农垦大学,塔里木843300)ComparisonandAnalysis0fTheCAVFiberProteinGeneFANQuan—shui,XIAXian-zhu,QIUWei,HUANGGeng,HEHong—bin3,YuChun4,QIAOJun5,wuYin—lian,ZHOUXiao—huan2,[VlNZhenI''1.
TheMilitaryMedicalInstituteofCheng-DuMilitaryArea,Kunming650032,China;2TheVeterinaryInstitute.
UniversityofAgricultureandAnimalScience.
Cttangchun130062China;3TheNortheasternAgricultureUniversity,Harbin150030.
Chi—Hd;4TheMilitarydogtroopofBeOingMlilitaryArea,BeljingChangping100021,China;5.
TheTalimuAgricultureUniversi一,Talimu843300,China)Abstract:AccordilagtoCAVFipgenessequence,4parisofprimerweredesignedtOamplifytheFipgeneswithPCRmethod.
CompleteFipgenesequencesofal1CAVstrainswereshowntObeconsistedof1629ntand163lntandencoded542and543aminoacidsfromATGstartcoden.
ThededucedaminoacidsequencesoftheFipoftheCAV一2strainswerecomparedoneanotherandwithstandardardCAVstrainextractedfromtheGenBankdatabase.
Therearepointmutation(transversion)occurringinat—tenuatedSY—V6OandSY—V5TheFipgenesofCAVofvirulentstrainofdifferentareawere8e—quencedTherearelessdifferencesamongdomesticCAV一1strainsbutmoredifferenceswithforeignCAV.
1strains.
HonologyofFipbetweenCAV—landCAV一2iS80.
48%.
Keywords;Canineadenovirus;Fiberproteingene摘要;根据已发表的CAV纤突基因序列,用PCR方法,对4个CAV2毒株和4十CAV一1毒株的纤突基因进行了扩增和测序,测定的核甘酸序列经推导得到分别编码543和542个氨基酸C'AV纤突蛋白垒序列.
测定的CAV.
2比较表明:我国流行的CAV.
2SY强毒株与国外标准强毒株Tomnt0A26/61株相同.
其驯化致弱的毒株与驯化前相比在1134位发生碱基颇换.
测定的CAV1比较表明:我国流行的CAV-1株与标准强毒RI26l株差异相对较大,而国内cAv_l毒株互相之间相对差别较小CAV.
2与CAV,1纤突基因的同源性为80.
48%.
关键词:犬腺病毒;纤突基固;纤突蛋白中囤分类号;$852655文章标识码:A文章编号:1003.
5125c2002)01—0082.
05犬腺病毒同其它腺病毒一样.
其基因组为线状、双股DNA[.
其纤突直径为2nm,长度随腺病毒型而不同,CAV-2的纤突为35~37nm,比CAV-1的纤突长10nm左右.
纤突的远端部分为腺病毒型特异性抗原,纤突的基部为亚群特异性抗原.
纤突顶端为一个4nm直径的球形物(又称knob),这是病毒感染细胞时结合于细胞受体的部分,血凝素也在球部.
两型犬腺病毒在血凝方面的差别和纤突结构有关.
在和红细胞发生凝集时.
两者可能使用不同的或不完全相同的RBC表面受体.
纤突的氨基酸保守区收稿日期:20014)5.
14,修回日期:2001.
07.
23基金项目:全军医学科研"九五"青年基金项目(960019)作者简介:范泉水(I964—1,男,山西夏县藉,博士、副研宽员.
扶事病毒研究E-mai[fqsgyp@pub1yncn维普资讯http://www.
cqvip.
com第1期范泉水等:不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析为底部(又叫tail),与五邻粒基底相连,远离壳粒的一端为C末端,中间部分是由脯氨酸和疏水氨基酸残基组成(又叫shaft),含有多个重复序列,但其氨基酸组成却不保守.
这与腺病毒不同血清型的抗原特异性相关.
纤突蛋白和某些非结构蛋白均系糖基化蛋白.
另外纤突蛋白可阻断腺病毒大分子合成,抑制病毒繁殖.
1995年Rasmussen对编码纤突蛋白的基因进行了测序和分析…3.
CAV一1与CAV.
2之间的蛋白质有80%同源性序列,纤突蛋白在病毒吸附到细胞表面受体的感染过程中起着决定性作用,CAV.
1与CAV一2纤突基因的不同性预示着,两者在毒力和对不同的细胞亲嗜性上存在着差异,CAV一1对血管内皮细胞有较强的亲嗜力,因此引起犬的致死性肝炎,而CAV一2则引起上呼吸道感染和肠道感染.
早在1925年Green就报道由犬CAV.
1引起的狐狸脑炎.
蜕明CAV一1至少在1925年以前就存在,直到1962年,Dithfield在一次爆发犬传染性喉气管炎期间从犬呼吸道中分离获得单纯引起呼吸道病变(喉气管炎)而不引起肝炎的腺病毒.
即A26株(TorontoA26/61)_5J.
而在这期间病毒学发展非常迅速,如果CAV一21962以前很流行的话,应该早有报道和研究,但是直到1962年Ditfield才从患呼吸道疾病的犬中分离获得.
并且报道仅感染小狗导致传染性喉气管炎(小狗咳嗽).
在此以后CAC-2才在世界各地流行开来.
由于CAV.
2在形态结构、理化特性及抗原结构及核酸序列方面与CAV.
1都很相似,随后并发现,1型病毒也能引起单纯的呼吸道疾病,因此认为2型是1型的一个变异株.
最早发现CAV-2引起单纯的呼吸道疾病,23年以后.
直到1985年Hamelin和1988年Macarmey又证实CAV一2除引起狗上呼吸遭疾病,并在呼吸道上皮复制外,病毒也能在消化道上皮中增殖导致狗发生腹泻[4-9].
这也可能与CAV.
2发生变异有关.
我们所分离克隆驯化的CAV一2也是从患有肠炎犬的肠道中分离获得的,后来证实该毒株既能引起呼吸道症状又能引起肠道症状,为了证实在我国CAV一2是否也发生其亲嗜性变异从呼吸遭转变为肠道,或者说两者兼而有之,为此我们有必要进行犬肠病毒的分子流行病学调查,为进一步的免疫研究奠定基础.
对我们分离和系统鉴定的CAV.
2SY株在犬肾细胞MDCK上进行传代驯化在传到40多代以后.
发现该毒株已丧失原来的毒力.
对犬表现为好的安全性和免疫原性.
这可能是由于CAV2丢失一些毒力相关基因或者说与毒力相关的某些基因发生变异的结果,驯化的弱毒的最重要的问题是该毒株的遗传稳定性问题,我ffJSfI化的毒株在易感犬上传5代后对犬仍然安全,这说明SY毒株在驯化过程中丢失了一些毒力相关基因或与毒力相关的某些变异的基因是不可逆的不能发生回复突变,但尚未从基因水平上对此进行确证.
目前我国用于预防CAV所用的疫苗大部分为国外疫苗的复制品,因毒种背景不清以及在细胞上传代次数较多,免疫原性和安全性均难以得到保证.
目前在我国已免疫过CAV的地区仍有CAV感染的发生,这是否困我国流行的毒株与国外流行的毒株并不完全相同.
或国外疫苗复制品中的弱毒株由于传代次数过多所致.
为此我们通过对犬腺病毒毒力、细胞亲嗜性、抗原性相关的纤突基因的序列分析来研究我国犬腺病毒的变异情况和规律,以探索我国流行强毒株与国外毒株相比的变异情况、驯化致弱毒株在驯化前后及犬体上又传5代以后的遗传稳定陛问题、我国流行的毒株与目前我们所用的国外疫苗的同源性问题、以及我国流行的CAV-1在不同畜主和不同地区基因水平上的变异情况.
本文对CAV8个毒株的纤突基因进行了扩增和序列测定,利用分子生物学软件与国外已发表的CAV纤突基困序列进行了比较和分析,现将结果报告如下.
1材料与方法1.
1病毒犬2型腺病毒有以下毒株:1)沈阳分离株第5代毒(SY—V5);2)经蚀斑克隆驯化的大斑第60(SYV60)代弱毒;3)SY.
V60在易感犬体上传5代的回收毒(SY.
CP5);4)美国疫苗毒.
原代次不清.
在我们手中传20代(US—V20).
犬1型腺病毒有以下强毒株:1)长春犬株CCC-V6;2)昆明犬株KMC-V4;3)吉林狐狸株.
V7;4)云南熊株YNB和经蚀斑克隆驯化的第60(SY2.
V60)代毒弱毒.
v5.
以上毒株均为本研究组保存并经系统鉴定的毒株.
1.
2引物我们分析了GenBank中已有的CAV的纤突基因序列,选择纤突基因两侧及中间的相对保守区.
利用分子生物学计算机软件GOIDKEY,设计合成了4对8条引物.
Pl~P4扩增CAV一1的纤突基因:P5~P8扩增CAV-2的纤突基因.
引物详见下表1:维普资讯http://www.
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com84中国病毒学第l7卷cR2tzL培养液I加入48~tL扩增反应液2结果取细胞培养液.
加入扩增反应液…n(0.
2mmol/LdATP、dGTP、dCTP和dTTP;50mmol/l,KCL;2.
5mmol/LMgCI2;10mmol/l,Tri~HCI;pH8.
3室温);0.
01%明胶;上游引物1tzmol/L,下游引物l~mol/L;0.
03u/ITaq酶).
PCR反应条件为:96℃变性50s.
52℃退火60s,72℃延伸60s,共35个循环.
扩增产物经15%琼脂糖凝胶电泳检测.
PCR使用的引物配对是P5一P6、P7.
P8.
衰1计算机设计的CAV两十翟纤突基因引釉TableICAVFIp脚primersIsdesIgnedeompltterCAV+1P15primet"25874TGAAGCCAV.
1P23primer2682(IATATGGGAAAGTCCAGGTCCAmplifiedlength966Mddngtemperature:82150CAV-1P35prlm~26776GGAGTGGCTTAAGAGTATCCCAV-1P43primer27614AGAmpLifiedlength:858Meltingtmperatu~78.
760CAV-2P55眦iliter26495TTGGTCAV-2P63priliter27423TAGGCAAAGGTTAAGGGTGGAmplifiedlength:948Meltingtellt][2t~stlJI'e:82859CAV.
2P75primer27386GTCTGTCAV2P83pnm盯28278TAmplifiedlength:912Meltingtmperatu~:807481.
4PCR产物测序和犬腺病毒纤突基因的序列分析按购自日本宝生物工程(大连)公司的PCRFragmentRecoveryKit试剂盒使用说明书进行PCR产物的纯化.
由日本宝生物工程(大连)公司完成序列测定.
应用GOLDKEY、DNASIS和PROSIS等分子生物学软件对犬2型腺病毒SY—V5;SY-V60;SY—CP5;US-V20的纤突蛋白基因的测序结果进行了分析.
1.
5犬腺病毒纤突基因的序列分析应用GOI.
DKEY、DNASIS和PROSIS等分子生物学软件对犬2型腺病毒SY-V5;SY.
V60;SY-CP5;USv20、CCC-V6、KMC-V4、JLF—V7;YNB.
V5.
纤突蛋白基因的测序结果进行了分析.
2.
1PCR扩增结果用引物P1一P2、P3一P4、P5.
P6和P7一P8对CAV一1(CCC1一V6)和CAV一2(SY2一V5)株的MDCK细胞培养物进行扩增,均得到了阳性扩增结果.
扩增片段的理论值分别为966、858、948和912bp(见图1).
I2345图lCAV.
1(CCClV6)和V2(SY2.
v5)株的PCR扩增结果Fig.
1PCRproductsofCAV-1(CCC1一V6)∞dV2(SY2-v5)l,P3.
P4;2PI.
P2;3.
P5.
P6;4,P7一P8;5.
Marker(kDNAHindⅢ十EcoR1)2.
2犬腺病毒纤突蛋白基因的序列测定与比较结果应用G0LDKEY软件将CAv_2和CAV-1的每个毒株纤突基因的各4个PCR片段所测序列拼接后,去掉纤突基困3端和5端基因序列,得到了一个由1629和1632个核苷酸组成的鲆突蛋白的全基因序列.
分别编码542和543个氨基酸,SY-V60与CCC-V6比较结果见图2.
3讨论3.
1从纤突基因变异看我国CAV的流行和预防比较测定的犬腺病毒CCC.
V6、KMC-V4、JLFV7、YNB.
V5与Gent~ank中发表的由Morrison测定的犬CAV.
1的标准强毒RI261株的纤突蛋白基因序列的比较表明:我国流行的CAV.
1株之间相对变异较少,与Morrison测定的犬CAV-1的标准强毒RI261株变异相对较多.
这可能预示着我国流行毒株与国外流行的毒株并不十分相同;从CAV一1感染引起的宿主差异和地域差异上看,长春CCC.
V6和昆明KMC-V4两个犬源株有3个共同变异位;吉林狸和云畔熊源株有2个共同变位点;昆明犬源鼎辩獬f3维普资讯http://www.
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com第1期范泉水等:不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析KMC~V4株和云南熊源YNB-V5株有2个共同变个共同变异位点.
我们所测定的犬2型腺病毒的异位点;长春犬源OCC-V6株和吉林狐JIF—v7有2璧PP!
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黑一PG—LTI~TNTE~…ITVEKN蟾YND6KV—LT_SF—TSQ—'~一I'E_NGK…LGVKP…TTYAsP—P—LKK婴}!
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TFTYVGEN~圉2犬腺病毒1、2型纤突蛋白之间氨基酶序列比较ng2ccpi…(theC-AV-1蚰dCAV-2矗b虹p吐eam~ao如SY—V5;SY—V60;SY.
CP5;US-V20株与GenBank中的TorontoA26/61标准的CAV一2强毒株纤突蛋白基因序列的比较结果表明:美国疫苗毒株uS-V20与我国流行的强毒株(SY—VS)差异较大,有11个碱基发生变化.
而我们驯化克隆的毒株与我国的强毒抹(SYvs)差异较小.
仅1个碱基发生变化.
如果用我们驯化和克隆的毒株来预防我国的CAV应该更好一些,已进行的实际免疫效果证实了这一推测.
3.
2驯化痉苗株与原强毒株及国外痉苗株的纤突基因比较病毒在其产生传播和增殖过程中.
不断发生变异.
动物病毒的许多毒力变异株是人工培育的结果,细胞适应性变异是目前病毒研究中的重要方法.
也是目前应用于弱毒株筛选中的主要手段CAV1病毒疫苗株是通过猪肾细胞培养获得的.
CAV一2疫苗株是通过犬肾和猪肾细胞培养获得的.
我们将CAV2在犬肾细胞上进行了几十代次的人工传代培养.
从理论上讲病毒的突变率是很高的.
虽然CAV-2的基因组有30kb.
但与毒力相关基因却占少数.
本文通过对与犬腺病毒毒力、细胞亲嗜性、抗原性相关的纤突基因的序列分析来研究犬腺病毒的变异情况,通过在犬肾细胞上连续的传代导致与毒力相关基因的变异从而达到驯化致弱的目的.
驯化病毒的动物试验表明SYV60已发生了明显不同于SYV5的变异.
从分子生物学水平上探讨病毒核酸的正常和异常配对情况表明.
H与邻近N或0原子的氢键结合是碱基配对的基础.
据此在DNA复制过程中,腺嘌呤与胸腺嘧啶配对,而在转录或RNA复制过程中,腺嘌呤与尿嘧啶配对;鸟嘌呤则与胞嘧啶配对.
这些特异性配对通常是严格地执行的.
但在一定条件下,核酸碱基的结构又允许H原子从一个原子向另一个邻近原子转移.
从而可能发生不同的碱基配对,例如胸腺嘧啶中的N3上的一个H原子可能转移到O4上.
从而改变O4的酮基为烯醇基,并改变碱基配对,以致胸腺嘧睫可能与鸟嘌呤而不是与腺嘌呤配对.
鸟嘌呤同样也可发生酮式一烯醇式变化.
N1氢转移至O6氧上,从而使鸟嘌呤可与胸腺嘧啶配对.
我们驯化克隆的毒株SY—V60株与驯化前的SY—V5相比.
在1134位发生碱基颓换.
一个胸腺嘧啶被一个腺嘌呤替代发生点突变,从而导致由原来的天冬酰胺(N)变为赖氨酸(K).
美国疫苗株在此发生同样的变异,在此部位的变异导致位于379381的氨基酸所形成的潜在糖基化位点发生改变,驯化株致弱的SYV60与美国疫苗均投有此潜在糖基化位点,而Toronto与SYV5强毒株有,因此我们分析这个部位的点突变可能与病毒的致弱有关,由于犬腺病毒与毒力相关基因不止纤突一个部位,对其它部位我们没有进行核酸序列比较.
尚不能确定这个突变在毒力方面的意义.
突变是可逆的,通常把野生型到变异型的突变称为正突变(forwardmutation).
而将由变异型向野埔窨}∞啦耀∞昭眦眦锻咖维普资讯http://www.
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com中国病毒学第17卷生型的突变称为回复突变(backmutation).
我们将SY—V60在犬体上连续传了5代.
以观察SY—V60是否发生回复突变.
并把在犬体上传代毒也进行了纤突基因的序列测定,结果与SY—V60相同.
没有发生1134位的回复突变及其它部位的变异,这也能进一步说明发生在1134位的点突变可能与毒力有关.
3.
3据纤突基因进行的犬腺病毒分型对CAV一1的报导最早出现在1925年,直到1962年Dithfield在一次爆发犬传染性喉气管炎期间从犬呼吸道中分离获得单纯引起呼吸道病变而不引起肝炎的腺病毒CAV一2[5j.
由于CAV一2在形态结构、理化特性及抗原结构及核酸序列方面与CAV一1很相似,随后发现.
1型病毒也能引起单纯的呼吸道疾病,因此认为2型是1型的一个变异株.
一般认为犬2型腺病毒只能感染狗导致呼吸道疾病和腹泻犬1型腺病毒除能感染狐和狗外,还能感染狼、貉、山狗、黑熊、负鼠和臭鼬,其中狗、山狗、狼、貉、负鼠和臭鼬主要表现肝炎症状.
而狐狸和黑熊主要表现脑炎变化.
本文对引起犬肝炎的犬源株和引起熊和孤狸脑炎和狐狸株和熊株,及引起犬肠炎和喉气管炎的犬源株的纤突基因进行了序列测定.
从测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列结果来看,引起犬肝炎的犬源株和引起熊和狐狸脑炎的狐狸株和熊株,三者之间的亲缘关系比较接近其基因和氨基酸的同源性高于99%;而引起犬肠炎和喉气管炎的犬源沈阳株,和国外CAV一2疫苗株及标准CAV一2的强毒株Toronto株之间的亲缘关系比较接近,其基因和氨基酸的同源性高于99%;而引起犬肝炎和熊和狐狸脑炎的病毒株,与引起犬肠炎和喉气管炎的病毒株的纤突基因及推导的氨基酸序列之间的同源性仅为805%左右.
从纤突基因的同源性来看,我们比较的毒株可以明显地分为二个型,引起犬肝炎的犬源株和引起熊和狐狸脑炎的狐狸株和熊株为一个型即CAV-1.
而I起犬肠炎和喉气管炎的沈阳犬源株和Toronto为另一个型即CAV一2.
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