酵母首只警用克隆犬

第19卷6期2004年l1月中国病毒学VⅡ0L0GICASINICA19(6):616—619November2004犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性乔军,夏成柱,胡桂学2,杨松涛,赵忠鹏,谢之景1黄耕(1.
中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春130062;2.
吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;3.
塔里木大学动物科技学院,新疆阿拉尔843300)ExpressionoftheMajorAntigenicRegionFragmentofSpikeGeneofCanineCoronavirusandImmunogenicityofExpressedProductsQoJun,XIAXian.
zhu,HUGui—xue,YANGSong.
tao,ZHAOZhong—peng,XIEZhi-jing,HUANGGenf1.
InstituteofMilitaryVeterinary,AcademyofMilitaryMedicineofPLA,Changchun130062,China;2.
DepartmentofAnimalScienceandTechnology,JinlinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;3DepartmentofAnimalScienceandTechnology,TarimUniversity,Alar843300,China)Abstract:Inthisstudy,themajorantigenicregionofspike(S)geneofCaninecoronavirusgiantpanda'Sisolate(ccvstrainDxMV1wasexpressedinPichiapastor&.
TheSlgenefragmentencodingmajorantigenicregionofSproteinwasamplifiedandclonedintoTvector,thensubclonedintopPICZQAforyeastexpression.
TherecombinantpPICZQAS1WASlinearizedwithSacIandthentransfclrmedintocompetenceGS115cellsforexpressionundertheinductionof1%methano1.
ThepositiveyeastswerescreenedbyPCR.
ExpressionofS1proteinwasidentifiedbvSDS.
PAGEandWesternblot.
Theresultsrevealedthatithadamolecularweightof106kDa.
whichcouldbespecificallyrecognizedbymulticlonalantibodyagainstCCVTheexpressionofrecombinantS1proteinamountedto6.
6-8.
6%ofthetotalproteinofsupernatantbygelscanning.
AfterthreeimmunizationbytherecombinantS1protein.
theneutralizingantibodyinseraofmiceCanrangefrom1:8tO1:16.
whichindicatedthattherecom.
binantSlproteinwasofit'Simmunogenicity.
Keywords:Caninecoronavirus;Majorantigenicregionofspikeprotein;Expression;Immunogenicity摘要:应用Pichiapastoris酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(ccvDXMV)S蛋白主要抗原区基网片断.
用特异性引物扩增出CCVDXMV株s1基因片断,并将其克隆到pGEM—T载体中得到pTS1.
用KpnI和NotI双酶切pTS1回收目的基因S1定向克隆到pPICZQA中,构建出重组质粒pPICZQAS1.
将pPICZQAS1用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子.
用1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测.
结果重组酵母菌培养物上清用SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为106kDa大小的重组蛋白,Westem.
blot证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性血清学反应.
凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1%甲醇诱导144h后,重组蛋白S1表达量约占培养物上清总蛋白量的6.
6—8.
6%左右.
用重组蛋白S1免疫BALB/C小鼠3次后,小鼠血清CCV中和抗体可达1:8—1:16,表明重组S1蛋白具有一定的免疫原性.
关键词:犬冠状病毒,S蛋白主要抗原区,表达,免疫原性中图分类号:$852.
65文献标识码:A文章编号:1003—5125(2004)06—0616—04犬冠状病毒(Caninecoronavirus,ccv)感染幼犬能引起急性胃肠炎川,也可引起一些珍稀野生动物发病~,是对养犬业和野生动物保护业危害较大的一种病原.
它由四种结构蛋白构成,即纤突糖蛋收稿日期2004—05—31,修回日期:2004—08.
10基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.
30000123)作者简介:乔军(1971.
),男,新疆阿拉尔市人,博士研究生,主要从事分子病毒学研究.
通讯作者夏咸柱(1939.
),男,江苏盐城市人,中国工程院院士,主要从事动物病毒学研究.
Correspondenceauthor:Tel:0431—6986748;E-mail:xia_xianzhu@yahoo.
colr1.
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com乔军,等.
犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性617白(S)、膜蛋白(M)、小膜蛋白(SM)和核蛋白(N).
S糖蛋白暴露于病毒表面,一方面可与细胞表面的病毒受体结合引起细胞融合,另一方面可直接与机体免疫系统接触诱导机体产生中和抗体.
因此,S糖蛋白一直是CCV诊断和疫苗研究的重要对象J.
国外Horsburgh等用真核表达系统成功表达了该蛋白,研制出CCV亚单位疫苗并申报了欧洲专利L8l,但国内尚未见到相关的报道.
本研究应用RT-PCR技术扩增出编码S蛋白A、B、C和D四个抗原位点的基因片断,在毕赤酵母中首次实现了其分泌表达,为CCV特异性诊断和亚单位疫苗的研究奠定了良好的基础.
1材料与方法1.
1病毒CCVDXMV株是本实验室胡桂学博士从四川某大熊猫保护中心病死的一只大熊猫肝脏中用CRFK和F81猫肾传代细胞分离而得到的,经系统的病毒学鉴定后保存J.
1.
2质粒、菌株及主要试剂毕赤酵母表达载体pPICZaA、克隆宿主菌TOPl0、毕赤酵母表达宿主菌GS115、DEPC、反转录酶SuperScriptTMIIRNaseIT和Zeocin购自Invitrogen公司;T4DNA连接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各种限制性内切酶购自TaKaRa公司.
pGEM—T载体、RNasin为Promega公司产品.
CCV阳性血清由CCVDXMV株细胞培养物超离浓缩后经4次免疫健康犬而获得,其中和抗体效价为1:128.
1.
3引物设计根据我们已经测定CCVDxMV株S蛋白全基因序列(CenBank登录号:AY436637),设计了一对特异性引物,用于扩增编码S蛋白A、B、C和D四个抗原表位的S1基因片断.
上游引物P1:5'-CAACC气TTGTGCTTACATTGTGCC.
3';下游引物P2:5'.
GAGCGGCCGCTTAGAATATGTrATGATAGG.
3'.
为下一步克隆需要,分别在上、下游引物中引入,zI和NotI酶切位点,并加有两个保护性碱基.
引物由大连TaKaRa公司合成.
1.
4CCVDXMV株S1基因的扩增总RNA用上海生工生产的总RNA提取试剂盒提取;RT和PCR反应参照文献IlUJ进行.
1.
5酵母表达载体的构建和鉴定回收S1基因片断,并将其与pGEM—T载体l6℃连接过夜,转化大肠杆菌JM109;用限制性内切酶酶切和PCR方法获得阳性重组质粒pTS1,送上海联合基因生物公司进行测序.
将测序正确的pTS1和pPICZQA用KpnI和NotI酶切后分别回收目的片段和载体大片段进行连接反应,转化TOP10,使用含Zeocin(25~tg/mL)的低盐平板培养.
用限制性内切酶酶切和PCR方法获得阳性重组质粒pPICZQAS1.
1.
6酵母表达质粒pPICZQAS1的转化、重组子及其表型鉴定pPICZQAS1用SacI进行线性化,回收线性化片断与冰预冷的感受态酵母菌GSll5混匀,用Bio—RADGenePluser在375V/cm,25pF、250Q的条件下进行电转化.
酵母重组子及其表型鉴定按照Invitrogen公司操作手册进行.
1.
7酵母重组子的诱导表达及表达蛋白的检测选择表型为Mut的阳性重组子进行诱导.
诱导用的培养基为BMGY和BMMY.
先将酵母重组子接种到lOmLBMGY液体培养基中,27~C,170r/min摇床培养,到OD600岫值为2-6之间时,4000r/min离Ii,10min,弃上清.
用BMMY稀释菌体到OD值为1左右,27~C,170rim进行144h培养,并于诱导表达起始后,每隔24h补加20%的甲醇溶液使其终浓度为1%.
将培养物上清用Millipore公司生产的超滤离心管除盐和25倍浓缩;取浓缩产物35~tL与等体积的2*上样缓冲液混匀l00℃煮沸5min,用10%的分离胶进行SDS—PAGE分析;然后一抗用CCVDXMV株免疫犬多价血清、二抗用辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG进行Western—blot分析.
用双波长非点扫描仪对上述SDS—PAGE凝胶电泳的蛋白带进行扫描.
1.
8重组蛋白S1的浓缩及其动物免疫试验将工程酵母菌在BMMY培养基中培养144h后,离心收集培养物上清将其装入透析袋中,先在PBS中4℃透析24h,再用PEG20000进行10倍浓缩,然后上SephadexG.
25柱除盐,分装于灭菌的青霉素瓶中进行冷冻干燥浓缩,用Bradford染料结合法测定总蛋白含量.
12只体重为2O~28gBALB/C鼠分为2组,每组6只,一组为免疫组,另一组为对照组.
免疫前用灭菌生理盐水适当稀释干燥浓缩的重组蛋白与等量弗氏完全佐剂乳化,按50~g/只皮下注射免疫组BALB/C鼠,间隔15d,以等量弗氏不完全佐剂注射,共免疫3次.
对照组按相同程序注射灭菌生理盐水.
在第3次免疫15d后,进行眼眶采血,分离血清,按文献l】lJ进行CCV中和抗体的测定.
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com6l8巍l9卷2结果2.
1CCVDXMV株SI基因的扩增经07%琼脂糖凝胶lU泳,CCVDXMV株RT-PCR产物大小约为2415bp.
与预期绌相符2.
2酵母真核表达载体pPICZdAsl的构建与鉴定蓐组予pPICZaAS1分别.
1lj所Ⅲ】NotI双酶切.
町得到3600bp和24】5bp个H'段:jIJXho1和NotI酶匕玎线性化可得到6O】5bp人小l_1{J核酸J断c匿l1j以再【pPICZⅡASI为槿板,用PCR进行扩增可得到24I5bp大小的桉酸片段,表明该霞纽厩粒构建正确bP^[}I53~~1014l1pP[CZ(ASl降临芷站果FiglIdentificationofpPICZ:.
ASIbyenz_1]edigestionM.
D.
LrI5000;IpPICZ:lASI/kp,一r12pPICZl_ASl/Xhol:3pPICZnASI/Nor12.
3Mut+表型重组酵母菌的筛选及PCR鉴定电转化感受态酵母茼GS1l5,转化蔺经MDH/MIvlH平扳筛选,挑选Mut我酵母莳¨JPCR鉴定用玻璃珠浊提取酵母基鲺DNA.
S1壁因删序用的内f!
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l』特爿:'H.
引物进行PCR扩增求筛选鉴定重组子,结果筛选得到了3株亘如酵母菌r罔2)~图!
I'lfl-~-母重r的PCR鉴定结Fig2IdentificationofpositiveyeastbyPCRMD,L-t50CO+20flfl;1;a45.
Negatiunrecombinantyeasts;2,'3/6.
Positivel'o2oml3il]~llfflye~.
ts2.
4重组蛋白Sl的SDS—PAGE及Vv'estcnl—blot检测3株重细酵母蔺经1l崞诱导I"44h收集培养基}:清j;;fjMillipore公,st产旧趟滤离心篇.
除盐车u浓缩后进行SDSPAGE舒折,粜发现在培养摹清中可榆测到分了基为l06kDa大小的目的蛋ff3.
tl3道)f1JCCVDXMV株多克隆抗体对酵母表达产物进行Westernblot分析发现表达的霞组蛋白可以和DXMV株多克隆抗体发牛特异性血清学反应'图3第7道箭"Z-所叮{)凝歧薄层扫州分析表明,3株苇组酵母茼A1%印醇诱导l44h后,蛆sl蛋白表达量分别tI培养物肯总蛋白量的8.
6%、6.
8%和6.
6%左.
罔3pPICZIASI转c茼GS¨5选l.
SDSPAaEIWestern—blot舒折Fig3AnalysisofSDS—PlAGEofexpressedS】protcilIaridit'sWe-stetm-blotM,1.
'1molecularpmteln,197.
66433I21lI4kDt1):I一3.
hlducedp~im,erecombimmlyeast:4Uninduced、1ll~crecombinantyeast:5.
InducoJUrLmCombinanl~:eaM.
hlducedni!
nnalyea~lGSl_5:7Wcstem-l1jIMn¨lysi*:25重组蛋白动物免疫试验6只经再￡蛋FISl免疫的BALB/C随,其山L晴中CCVt和抗体分别在1:8…6之,刘照组CCV·}t和抗体为阴件结果表IJj.
I捉达的前【蛋白SIJ}囱定的免疫原陆3讨论与小结CCV是前冠状犏毒血清I群IIr卅究f少的嫡毒.
村其s蛋白丰抗原位,5:fr~J研瓮尚未见到报道,猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)魁IJCCV同属冠状犒毒GroupI的情毒,与CCVjtc.
t~3L天系搬近.
¨l前对婆s蛋白抗原位点的研究鞍多Correa干¨Delmas等通过试验证明,TGEVS蛋I.
f『A、B、C、D4个抗原位点.
井目.
4个位血位]s蛋』_N端的543个氯基酸溅壤之内"】Falima等地过用-社览降抗体竞争试验发现,S匿仔种水平呐抗原结构,即抗原位点、抗原亚位点和抗蟓决定簇llA位点又可分为Aa、Abf¨Ac3个、】俺点.
A他点缺失I导致s蛋白丧失诱导c和抗体的稚:I]氨酸残墓534、59l乖¨543位划Aa、Ab和Ac、II.
他的形成分别起键n用,氯琏睃践基586位时影响Aa、Ab亚位点的形成",返表明A他点具柯维普资讯http://www.
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com乔军,等.
犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表壅堕鱼!
!
复杂的空间构象.
B抗原位点在97—144氨基酸内,依赖于细胞内糖基化,也具有复杂的空间结构.
C抗原位点是连续的线状结构,其中50.
51氨基酸是形成该位点的关键氨基酸.
D位点位于残基378.
392位区域,至少有2个抗原决定簇,第358位甘氨酸残基对D位点的构象影响较大.
糖基化对与A、B两位点的形成是必须的,而C和D位点不依赖糖基化I】.
根据TGEVS蛋白单克隆抗体对s蛋白主要抗原位点定位与糖基化位点的相关性分析,我们推测CCVDXlVIV株S蛋白Aa、Ab、Ac、BI、B2五个抗原亚位点的形成可能分别与N端537.
539、557.
559、566.
568、14.
16、9496位糖基化位点密切相关.
在本试验中,我们对推测的编码CCVDXMVS蛋白A、B、C和D位点的基因片断在毕赤酵母中实现了分泌表达,并且通过动物免疫试验证实表达的重组蛋白具有一定的免疫原性.
酵母表达系统是一种低等的真核表达系统,尽管它相比于原核表达系统具有完整的蛋白表达和加工修饰功能(如糖基化),相比于杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统又具有快速、简单、成本低等优点,但我们在试验中发现,影响酵母分泌表达外源蛋白量的因素很多,除受限于表达载体本身之外,还与培养基pH值、甲醇浓度、诱导方式及目的基因内在因素有关.
在本试验中表达的重组S1蛋白表达量总体来说还是偏低,纯化较为困难.
因此,优化表达条件进一步提高重组蛋白表达量使其实用化是我们下一步研究的重点.
参考文献[1】殷震,刘景华.
动物病毒学[M】.
第2版北京:科学出版社.
1997,671—703.
[2】TennantBJ,GaskellRM,JonesRC.
ela1.
Studiesontheepizootiologyofcaninecoronavirus[J].
VeterinaryRecord,1993,132:7.
11.
[31MainkaSA,Qiux,Heela1.
Serologicsurveyofgiantpanda(Ailuropodamelanoleuca).
anddomesticdogsandcatsintheWolongReserve.
China[J].
JWildlifeDis,1994,30:86—89何爱华,杜胜芳,林桂华,等.
首次从腹泻熊猫粪便中检出冠状病毒简报[J1.
中国人兽共患病杂志,1996,4(3):4.
高凤山,胡桂学,夏咸柱,等.
联合PCR诊断大熊猫犬瘟热和犬冠状病毒的混合感染【J].
吉林农业大学学报,2003,25:91-93.
胡桂学.
高风山.
高玉伟,等大熊猫犬冠状病毒的分离与鉴定fJ]畜牧兽医学报,2004,35(2):202-207.
PratelliA,EliaGDecaroN,ela1.
CloningandexpressionoftwofragmentsoftheSgeneofcaninecoronavirustypel[J1.
JVirolMethods.
2004,117:61-65.
HorsburghBC,BrownTD.
Cloning,sequencingandexpressionoftheSproteingenefromtwogeographicallydistinctstrainsofcaninecoronavirus[J].
VirusRes,1995,39:63-74HorsburghBC.
Caninecoronavirussubunitvaccine[P]Europe:EP0510773,2003.
乔军,孟庆玲,夏咸柱,等.
犬瘟热、犬冠状病毒联合PCR检测方法的建立及初步应用【J1.
西南农业学报,2002,15:93—95.
范志强,夏咸柱,武银莲,等.
检测犬冠状病毒中和抗体的方法与应用[J1.
中国畜禽传染病,1998,20:357—360.
CorreaI,JimenezGSuneC.
ela1.
AntigenicstructureoftheE2glycoproteinfromtransmissiblegastroenteritiscoronavirus[J].
VirusRes,l988,lO:77—94.
DelmasB,RasschaertD,GtodetM,ela1.
Fourmajorantigenicsiteofthecoronavirustransmissiblegastroenteritisvirusarelocatedontheamino—terminalhalfofspikeglycoproteinS[J】JGenVirol,1990,71:l3l3一l323.
FalimaGWillewpA,CorreaC,ela1.
ResiduesinvolvedintheantigenicsitesoftransmissiblegastroenteritisvirusSglycoprotein[J].
JVirol,199l,183:225—238.
SimpkinsRA,WeilnauPA,BiasJ,ela1.
Antigenicvariationamongtransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV)andporcinerespiratorycoronavirusstrainsdetectedwithmonoclonalantibodiestotheSproteinofTGEV[J].
AmJVetRes,1992,53:1253.
1258.
…维普资讯http://www.
cqvip.
com