基因首只警用克隆犬

第17卷2期2002年5月中国病毒学VIR(】I』)GICASINICA17(2):149—152May2002伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及缺失转移载体的构建姜焱,侯玉峰,陈德胜,陈溥言P(1南京农业大学动物医学院.
江苏南京210095;2南束出^境检验检痤局.
江苏南京210001)Cloning,ConstructionofgEGeneandgIGenePartialDeletionMutantofPseud0rabiesVirusSHStrainJIANGYan.
HOUYu—feng,CHENDe—sheng,CHENPuyan"(1.
CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgicultureUniversit~,Nanjing210095,China;2NanjiNEHsrv—E武rlnspectio.
Tfl,dQ¨rantingBeauryNaH}ing210001ChinaAbstract:AccordingtotheGenbankopensequence,twopairsofprimerweredesignedinordertoam—plifygEgeneandpartialgIgeneofpseudorabiesvirusShanghaistrain,respectively.
Theg￡geneandpartialgIgenewereobtainedbypo]ymerasechainreaction(PCR),subsequentlyclonedintopGEMTvector.
ThenbothofthemwereinsertedintopUCI8vector.
TherecombinantplasmidpgEIdeletedpartofgIgenewasconstructed.
Keywords:Pseudorabiesvirus;glgene;gene摘要:根据已发表的伪狂犬病病毒(P~udorabiesVirus.
PRV)I'I~gt和gE基因序列.
设计两对引物用PCR方法扩增出PRV—SH和gE基因,将其克隆^pUC18载体中.
获得了缺失部分基因的转移载体质粒,命名为pgEI关键词:伪狂犬病病毒;gl基因;gE基因中图分类号:R3739文章标识码:A文章编号:10035125{2002)020149—04伪狂犬病病毒(PseudorabiesVirus,PRV)可引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病,尤其是猪的伪狂犬病已成为危害当今养猪业最严重的传染病之--[但各种灭活疫苗及弱毒疫苗对该病的防制、根除及对持续性感染的防制都是不成功的itIo随着分子生物学的发展,对一些传染病病原的分子剖析,使致病基因和免疫保护性抗原基因的鉴定和分离得以实现.
'J.
自20世纪70年代以来.
通过对PRV基因组的改造已先后研制了多利PRV基固歃失疫苗.
这些基因缺失疫苗株有的是缺失病毒的主要毒力基因,以降低其毒力;有的缺失r病毒的糖蛋白基因,从而可以通过血清学等方法将疫苗免疫猪和自然感染野毒猪区分开来,使控制并最终消灭此病成为可能.
.
gE和f是以非共价键形式结合成复合体gt/gE,是影响PRV生长的功能成分["].
gE基固是影响毒力的重要基因之一,且决定毒力的部位在第125位和第126位的两个氨基酸,只要突变这两个氨基酸,其毒力就会大大的降低¨.
现已证明,也与毒力有关,且对诱导完全保护是必须的(.
本研究用PCR的方法扩增厂f的部分基因和全基因,并克隆到pUC18中,构建了pgEI转移载体,这样在gE和基因之间缺失了250bp,即保留r部分gI基因又破坏了gE基因的阅读框.
为构建PRV的缺失株打下了基础.
1材料与方法11病毒和细胞系收稿日期:20010808.
修回日期:2001I116基盘项目:上海市农委重点攻差课题(98057)怍并简舟:姜螽(L972~),女,江茄:省泗阳蒋.
博十生.
研究七【】匀湾染痫学与预防兽医学料通讯作者C.
唧sp.
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com中国病毒学第17卷PRV—SH和RK细胞由车实验室保存.
12质粒和菌株DUC18和DH5由本实验室保存.
13酶和试剂Bn,nHI、HindⅢ等限制性内切酶和TaqDNA聚台酶等修饰酶购自宝生物工程(大连)有限公司.
DNA回收试剂盒购自四川博大公司.
1.
4PCR引物设计参照发表的PRVgE和基因,设计并台成了两对引物.
同时在引物的5端加上台适的酶切位点:基因的引物:5primer5'-GACGGATCCCCATGCGGCCCT—TTCTGCTGCGCGCC一33primer5一GCCAAGCTTCGGAATGCGGGC—GGACCGGTTCTCCC一3,基因的引物5'-primer5'-ACTGAATTCAC.
GTGACCCG(K2-TCCCCG一33'-primer5'-CGGGATCCGCCGGTAGATGCG—ATTCC一31.
5PRVDNA提取按文献]提取PRVDNA.
用100TCID的PRV—SH株接种长满方瓶的免肾细胞(RK细胞),待细胞出现8O%~90%病变时,收获病毒液.
冻融2次后取5o0I病毒液,加10%SDS至终浓度1%.
充分混匀后,加20mg/mL蛋白酶K4I,55℃30min.
取出后加酚、酚:氯仿和氯仿各抽提一次,加I/10体积的NaAC(3rnoI/I,,pH52)和2倍体积的无水乙醇,一20℃,30min,I2000r/rain离心I5min,70%乙醇洗一次,凉干,溶于3OI超纯水中作PCR模板16PCR法扩增PRV-SH的nE和g,基因以提取的PRV—SH的DNA为模板进行目的基因的扩增,反应体系为:PRV-SHuNA2I,引物各1I(20pmol/v.
I,),dNTP(2.
5mmol/[)4IIOXPCR反应缓冲液5I,MgCI2(25mmol/I)4I,,二甲基亚砜(DMSO)5pI,TritonX一10025I,,Taq(5u/【J)0.
5,aI.
其中PRVDNA先煮沸10min变性后加入反应体系中.
PCR反应的循环参数:95*(22min:94℃50s,64℃1min,72℃25rain,40个循环.
然后72'C10min.
置于4%2.
反应结束后.
取8"1PCR产物电泳.
1.
7PRV—SH的和基因的克隆PCR产物经琼脂糖电泳后,用试剂盒回收目的片段,在T4DNA连接酶的作用下,将纯化的基因片段连接到DGEM—T载体上.
转化DH5a大肠杆菌感受态细胞,挑取白色菌落进行培养,按文献l7提取质粒,用EcoRI进行酶切鉴定.
18缺失载体的构建将克隆在pGEMT载体上的耳E和F,基四分别用BamHI+HindⅢ和BarnHI+EcoRI消化,琼脂糖电泳后用试剂盒回收目的片段,同时用BⅡmHI十EcoRI消化pUC18,在T4DNA连接酶的作用下,将纯化的,基因连接到pUC18载体上,转化DH5,~大肠杆菌感受态细胞,挑取白色菌落进行培养,按文献")提取质粒,用BnzHI+EmRI进行酶切鉴定,将阳性质粒命名为pUCgI.
再用BamHI+HindⅢ消化pUCgl,用同样的方法将纯化的gE基因连接到pUCgI载体中,通过HidⅢ、BnmHI和EcoRI酶切鉴定,构建了缺失载体pgEI.
构建流程见图1.
2结果2.
1PCR法扩增PRV—SH的耳E和,基因参照已发表的gE和g,基因序列,分别设计并台成两对引物,以PRV—SH感染的细胞培养液提取的病毒DNA为摸板,用PCR的方法分别扩增出一条约960bp和一条约1740bp的基因片段,其大小与目的基因片段大小相符(图2).
2.
2目的基因的克隆将纯化的PCR产物与pGEMT载体连接后,转化DH5a大肠杆菌感受态细胞,挑取白色菌落进行培养,提取质粒,用E∞RI进行酶切鉴定(图3).
表明glE和g,基因已克隆入pGEM—T载体中,分别命名为pGEM—gE和pGEM—gI.
23缺失载体的构建用BarnHI+HindⅢ和Bar.
,zHI+EcoR【消化pGEM—gE和pGEM,gI,琼脂糖电泳后用试剂盒同收目的片段,与用相同的酶消比的pUC18进行连接,转化DH5a,挑取白色菌落培养,提取质粒,用维普资讯http://www.
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com第2期姜蠢等:伪狂犬病病毒上海株gE和gI基田的克隆及缺失转移载体的掏建151BdHI+HdⅢ和BamHI+EcoRI消化(图4).
表明gE和gI基因已克隆入pUC18中,分别命名为pUCgE和pUCgI.
然后用/,amHI+HindⅢ消化pUCgl,与用BamHI+HindⅢ消化的基因进行连接,通过HiNdⅢ、BamHI和EcoRI酶切鉴定(图5),证明成功的构建了缺失载体pgEI.
图1pgEI缺失载体构建的流程图Fig+1Constructiortthedeleted㈣0pgE囝2PCR扩增产物Fig+2TresultofPCRproduct1,MarkerDL15000;2.
ThegenePRV·SH;3,ThegetleofPRUSH图4酶切鉴定站果Fig4TheresultREanalysis1,Markel;2,pUcgE(BamHI+HindIli);3.
pUCgI(EcoR1+BaHf);4、pUC18(EcoRI)图3酶切鉴定结Fig3Theresuh.
fRE~lnalⅧs.
oCEM_|(EcoR1:3.
p(3EMT(EcoR1)bp1500050002500000隆】5pgE[酶切鉴定结粜Fig5TheresultREanalysispgE『【,pgEl(EcoRIHd口),2,pgE[(130nHI+H/ndHI);3.
pgEI(Rf+BaⅢHI):4,tzgEI(/~'oRI);5.
Marker㈣渤…维普资讯http://www.
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com巾国病毒学第l7卷3讨论据报道【la',在过去研究者们常采用在某些细胞系中多次传代PRV.
使之适应于该细胞,在适应过程中造成PRV的某些毒力基因的丢失;或先通过构建基固文库,然后用外切核酸酶人为地剪切掉某个毒力基因来构建缺失转移载体,此方法费时费力.
本研究采用了成熟的PCR技术,通过设计两条特异性引物扩增出gE和基囤,使gE和f基因之间缺失掉250bp,将和gf基因克隆到pUC18中,钶建了缺失转移载体pgEl,此方法简单、方便.
伪狂犬病病毒的原发宿主是猪,成年猪往往是潜伏感染状态,但排出有感染性毒力的病毒传染其它易感动物时都能引起严重的疾病,甚至死亡[6,s3.
缺失gE基固的PRV缺失疫苗接种猪后能抑制病毒的神经侵袭性和传播力,具有较好的安全陛【】.
完全缺失了gE和gf基因的缺失疫苗不能完垒的保护强毒的攻击.
据报道,g对完垒保护的诱导是必须的J.
基因是主要的毒力基因之一,而它的决定性是第125位和126位的两个氨基酸,只要突变掉着两个氨基酸,PRV的毒力就会大大下降.
gE和g,是非共价键的形式结台成复台体,形成功能单位,本研究用PCR法将gE—gI之间缺失掉250bp,这样即保留了部分gf基因,同时也能改变gE基因的阅读框,从而破坏了gE具有毒力的条件.
这为进一步构建PRV—SH的缺失株打下了基础.
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