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452004,Vol.
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3基础研究食品科学发现,当浸提液体积一定时,分多次浸提比一次浸提的多糖浸提率高.
多糖的纯化,就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分.
一般是先脱除非多糖组分,再对多糖组分进行分级.
本项实验采用Sevage法(氯仿∶异戊醇=3∶1混合摇匀)进行脱蛋白,用SephadexG-15的葡聚糖凝胶柱进行进一步的纯化,红托竹荪样品多糖组分分级情况见表2.
2.
2红托竹荪多糖单糖组成成分分析结果采用薄层层析法分析单糖组分.
薄层层析显色后,根据不同单糖标样参考斑点的颜色和相对位置及Rf值或Rg值,同红托竹荪多糖水解所得单糖斑点的颜色和相对位置及Rf值或Rg值,确定样品中有哪几种糖.
红托竹荪多糖纯化得Dr-1,Dr-2,Dr-3三个级分的单糖组分相同,均为半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖.
3结语食用菌多糖是一种能够增强人体免疫功能的生物活性物质,国际学术界称之为生物应答效应物(BiologicalRe-sponseModifier),目前已经成为分子生物学、食品科学、药学等领域中的热点研究内容之一[6].
随着分子生物学的发展,人们逐级认识到糖及其复合分子具有极其重要的生物学功能,多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系.
开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究具有十分重要的意义[4,6,7].
近年来,有关食用菌多糖的研究、报道的频率相当高,人们一直在努力寻找提取多糖的最佳方法以及不断获得新的功能性多糖资源.
红托竹荪作为我国的特色食品,具有极高的开发价值.
随着红托竹荪人工栽培规模的不断扩大,红托竹荪多糖的研究和开发必将会产生明显的效益.
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香蕉酶促褐变的研究张勇1,池建伟2,*,温其标1,张名位2,徐志宏2(1.
华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640;2.
广东省农科院生物所,广东广州510640)摘要:本文以邻苯二酚为底物采用分光光度计测定氧化产物的方法对香蕉果肉多酚氧化酶(PPO)的催化特性、收稿日期:2003-05-28*通讯联系人基金项目:广东省农业攻关项目(攻关号B202)作者简介:张勇(1977-),男,硕士研究生,研究方向为粮食油脂及植物蛋白质工程.
乙醇浓度(%)过柱液多糖质量(g)过柱液多糖含量(%)洗柱液多糖质量(g)洗柱液多糖含量(%)总含量(%)第一级沉淀650.
08300.
056080.
00970.
006550.
06263第二级沉淀750.
07480.
050540.
05054第三级沉淀850.
17420.
117700.
06550.
044260.
16196备注:多糖含量=多糖质量/样品质量;总含量=过柱液多糖百分含量+洗柱液多糖百分含量.
表2红托竹荪子实体样品多糖分级提取http://www.
paper.
edu.
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346基础研究食品科学最适温度、最适pH值、热稳定性等性质进行了研究.
结果表明,香蕉PPO的最适温度为25℃,最适pH为5.
0,75℃水浴处理5min酶基本完全失活,100℃水浴处理20s可钝化PPO的活性,并且香蕉PPO具有同功酶.
关键词:香蕉;多酚氧化酶;褐变;同功酶StudyontheCharacteristicsofPolyphenolOxidaseinBananaZHANGYong1CHIJian-wei2WENQi-biao1ZHANGMing-wei2XUZhi-hong2(1.
CollegeofFoodandBiologicalEngineeringSouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640,China;2.
Agro-BiotechnicalResearchInstituteAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,China)Abstract:Takingcatecholassubstrate,thisarticlemadearesearchonthecharacteristicsofpolyphenoloxidase(PPO)ofbananabyspectrophotometer,includingitscatalyticcharacteristics,theoptimumtemperature,theoptimunpH,thethermody-namicstabilityofenzymeandsoon.
TheresultsshowedthattheoptimumtemperatureandpHwere25℃and5.
0respecfively.
ThePPOwasinactivatedat75℃for5minandtheextinctconditionofPPOwas20sat100℃.
ThePPOhadisoenzymeinitsmixture.
Keywords:banana;polyphenoloxidase;browing;isoenzyme中图分类号:Q554文献标识码:A文章编号:1002-6630(2004)03-0045-04香蕉是生长于南北纬30℃以内的热带和亚热带水果,风味独特、清甜芳香、营养丰富,富含淀粉、蛋白质、脂肪、果胶、胡萝卜素、维生素B1、B2、维生素C、维生素E及Ca等,深受人们的喜爱.
因香蕉成熟后质地柔软,较难长期保鲜或储运,因此开展香蕉深加工势在必行,但香蕉在加工过程中极易褐变而影响了其加工性能及感观质量.
香蕉褐变的主要原因是香蕉组织中多酚氧化酶(polyphenoloxidase简称PPO)催化各种酚类底物发生氧化,首先氧化成醌,然后再聚合成黑色素,给产品带来令人不愉快的感观[1].
本实验对香蕉多酚氧化酶特性加以研究,为香蕉在加工过程中避免或减轻褐变的产生、生产品质上乘的产品提供理论参考.
1材料与仪器1.
1主要材料香蕉(市售新鲜八成熟香蕉,颜色浅黄).
1.
2试剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮),PEG(聚乙二醇),丙酮,TWEEN80(吐温80),邻苯二酚,均为分析纯,磷酸盐缓冲液(0.
2mmol/L,pH6.
86).
1.
3仪器分析天平(AEG-120G),高速组织捣碎机(DS-1型),冷冻离心机(3K30,Sigma),冰箱,紫外可见分光光度计(752C型),磁力搅拌机(JB-2型).
2方法2.
1多酚氧化酶(PPO)的提取参照塔卡基方法[2](略有修改).
称取100g香蕉果肉,迅速加入含1%PVP和1%PEG的磷酸盐缓冲液250ml(-2℃).
然后用DS-l型高速组织捣碎机在5000r/min转速下捣碎3min,将糊状的香蕉混合物用3K30型冷冻离心机(Nr.
12155转头)在0℃,转速20000r/min条件下离心15min,将清液和沉淀分离,沉淀中再次加入含l%PVP和1%PEG的磷酸盐缓冲液(-2℃,250ml),然后再以与第一次捣碎相同的条件下捣碎3min,再冷冻离心(条件同第一次);弃去沉淀,将所得的清液与第一次得到的清液混合(约为500ml).
在混合清液中加入冷丙酮(-15℃,1000ml);丙酮要慢慢地加入,一边加入,一边慢慢地搅拌,加入完毕保持搅拌15min,然后冷冻离心(条件同上);将所得的沉淀加入1000ml、-5℃的含1%TWEEN80的磷酸盐缓冲液,捣碎5s,然后用磁力搅拌机3℃下搅拌1h,最后进行冷冻离心(条件同上),去除沉淀,所得的清液即为多酚氧化酶液.
2.
2测定波长的选择取磷酸缓冲液2ml,加入0.
2mol/L邻苯二酚溶液1.
0ml、0.
1mlPPO粗酶液至比色杯中,室温下迅速混和均匀,然后在波长370~460nm间测光密度变化.
2.
3多酚氧化酶活力测定[3]在比色杯中迅速加入磷酸盐缓冲2ml、0.
2mol/L邻苯二酚1.
0ml和0.
1mlPPO粗酶液,摇匀后在上述所选波长400nm处比色测定,酶液加入后开始计时,每60s记录一次吸光度A值随时间的变化值,以20min内最初直线段的斜率(A/t)计算酶活力.
酶活力以在此测定条件下每分钟A值改变0.
001为一个酶活力单位(U).
2.
4底物浓度与反应速度的关系室温时,在2ml磷酸盐缓冲液中,分别加浓度为0.
02、472004,Vol.
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3基础研究食品科学00.
20.
40.
60.
811.
21.
4360380400420440460480波长(nm)A400nm图1工作波长的选择图2底物浓度与反应速度的关系00.
250.
50.
75100.
040.
080.
120.
160.
20.
24底物浓度(mol/L)反应速度/A400nm00.
20.
40.
60.
811.
200.
050.
10.
15PPO浓度(mol/L)反应速度/A400nm图3PPO浓度与反应速度的关系0.
04、0.
06、0.
08、0.
10、0.
12、0.
14、0.
16、0.
18、0.
20mol/L的邻苯二酚1.
0ml,然后分别加入0.
05mlPPO粗酶液,迅速摇匀在波长400nm处每60s记录一次反应产物的吸光度(A400值),并求出相对最大的反应速度.
(以最大的A/min来表示,以下同)2.
5酶浓度与反应速度的关系室温时,在磷酸盐缓冲液2ml中,加浓度为0.
1mol/L邻苯二酚1.
0ml,然后分别加入PPO粗酶液0.
005、0.
01、0.
02、0.
03、0.
04、0.
05、0.
06、0.
07、0.
08、0.
09、0.
1ml,分别在波长400nm处每60s记录一次反应产物的A400值,并求出相对最大的反应速度.
2.
6酶活力与pH值关系的测定在室温20℃、pH值分别为3.
0、3.
5、4.
0、4.
5、5.
0、5.
5、6.
0、6.
5、7.
0、7.
5、8.
0、8.
5、9.
0的一系列2ml磷酸盐缓冲液中,分别加浓度为0.
1mol/L邻苯二酚1.
0ml,PPO粗酶液0.
05ml,按2.
3节方法测定不同pH值对酶活力的影响.
2.
7多酚氧化酶的最适温度及热稳定性取磷酸缓冲液20ml、浓度为0.
1mol/L的邻苯二酚10ml和PPO粗酶液0.
5ml分别在40、50、60、70、80、90℃的水浴中保温5min,取出冷却至室温,在波长400nm处测酶活力;另备一份在100℃水浴中分别热烫5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60s,取出后均迅速冷却,按2.
3节方法测定酶活力.
3结果与分析3.
1反应体系工作波长的选择(nm)体系反应产物在可见光波370~460nm下的吸光度如图1.
由图可知反应体系在可见波长400nm处有最大吸收峰(A400),在波长360~400nm范围内随着波长的增加吸光度逐渐增大;在波长400~460nm范围内随着波长的增加吸光度逐渐降低,因此在以下的测定中均采用波长400nm为工作波长.
3.
2底物浓度与反应速度的关系浓度对反应速度的影响如图2双相特征曲线所示.
在底物浓度较低的情况下,随着底物浓度增加,酶活力也相应的增加,反应速度也相应的增加,但当底物浓度达到0.
12mol/L时,即使再增加底物浓度,反应速度也不再增加.
在底物浓度达到0.
2mol/L时仍保持一定的反应速度,即未观察到对酶活力明显的抑制作用.
根据Henri解释,反应在低底物浓度时,并非所有的酶分子都能与底物分子相结合,而是随着底物浓度增加,愈来愈多的酶分子与底物相结合,当浓度达到一定程度时,所有的酶分子与底物相结合时(酶被底物饱和),进一步增加底物浓度也不能提高反应速度,这时的反应速度被称为最高速度Vmax[4].
根据米氏方程,底物浓度小于0.
02mol/L,反应显示一级动力学特征;底物浓度大于0.
12mol/L时反应速度与底物浓度无关,表现出零级反应的动力学特征.
3.
3酶浓度与反应速度的关系由图3可知,在酶液相对浓度较低时,随着酶浓度的增加其反应速度的增加十分明显,而当酶液达到0.
08ml时,反应速度的增加趋于稳定,这是由于酶的作用产物抑制了酶的活力的原因.
3.
4酶活力与pH值的关系图4为反应体系吸光度pH值的关系曲线.
从图中可知,反应体系的pH值对香蕉PPO酶活力影响比较明显,在pH值5.
0~6.
5之间吸光度最大,说明此pH值范围内酶活力最大;在pH值小于5.
0时,随着pH值的降低,酶活力也逐渐降低,表现为体系反应速度逐渐变慢.
当pH值小于3.
0时PPO活性显著被抑制;体系pH值大于6.
5时,随着pH值的增大,酶活力逐渐减小.
当pH大于8.
5时,酶活力得到了显著的抑制.
其原因是PPO为碱性蛋白质,在较强的酸性条件下,辅基铜将2004,Vol.
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348基础研究食品科学00.
20.
40.
60.
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21.
42.
54.
56.
58.
510.
5体系pH值反应速度(A400nm)图4酶活力与pH的关系00.
250.
50.
751010203040沸水处理时间(s)反应速度(A400nm)以铜离子的形式解离出来,从而使酶失活;而在碱性条件时,辅基铜会解离成氢氧化铜,使酶活力显著降低[9].
同时由图可知,香蕉PPO的最适pH值为5.
0,同时在pH6.
0还有一个吸收峰,这表明香蕉PPO有同功酶存在,已有文献报道了牛蒡[5]、草菇[6]、板栗[7]、莲藕[3,8]等的多酚氧化酶具有同功酶.
因此,调节pH值能有效抑制PPO活性,可以减轻香蕉加工中的酶褐变的程度.
3.
6酶活力与温度的关系采用调节温度来控制酶催化反应速度是非常重要的.
一方面,在低温下保藏食品能减少酶对软化、不良风味的产生和成熟等的影响;另一方面,在食品加工中采用高温处理能破坏或钝化所有的酶活力.
此外,在酶测定中准确地控制温度是得到可靠重复数据的先决条件[4].
温度对多酚氧化酶的影响是双重的,一方面温度升高能加快酶催化反应速度进程,另一方面促使酶蛋白变性,是两种对抗效应综合反应.
图5为PPO粗酶液在不同温度下处理5min后的效果图,由图可知,香蕉PPO的最适温度为25℃,在20~35℃之间反应反应速度最大,即酶活力最大,低于20℃酶活力较低,高于40℃,酶开始钝化,到75℃处理5min后,酶基本不可逆失活,80℃以上酶已没活性;从图6可以看出,酶液沸水浴钝化处理时,前5s及10~15s酶钝化较缓,5~10s较快,15~20s又减缓,过了20s基本没有活性,出现这种现象可能是由于同功酶[2]的存在.
因此,在沸水浴中处理超过20s,香蕉果肉中的多酚氧化酶及其同功酶基本全部钝化失活.
一般地说,存在于完整组织或匀浆中的酶,由于它的结构被其他胶体物质(蛋白质、碳水化合物和果胶等)所保护,从而比起它以纯化的形式存在时更为耐热,因此在香蕉加工中应考虑组织状态对热传递的影响与化学物质对褐变的保护作用,从而选择合适的加工温度以控制加工质量.
4小结4.
1香蕉多酚氧化酶的酶促褐变的产物在可见光波长400nm处有最大吸收峰.
4.
2多酚氧化酶的最适pH值为5.
0,在pH值5.
0~6.
5范围内酶活力最大;其他pH值下均表现出不同程度的抑制,因此可通过调节pH值来控制香蕉褐变的程度.
4.
3香蕉中多酚氧化酶存在同功酶,相应最适pH6.
0.
4.
4多酚氧化酶对热敏感,其最适温度为25℃,75℃处理5min酶基本全部钝化,100℃时多酚氧化酶全部钝化的临界时间为20s,因此在香蕉加工中可以利用高温短时热烫来控制褐变程度的发生.
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