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中华消化杂志1995年6月第15卷第3期I、Ⅳ型胶原及板层素在肝纤维化大鼠肝窦周围的变化徐列明刘平吕刚刘成薛惠明朱剑亮'7C摘要运用免疫组化方法检测大鼠肝脏的I、Iv型胶原及板层索(LM).
发现三者在正常大鼠肝窦周围均有少量存在.
在经CCI刺激后造成肝纤维化大鼠的肝脏.
第6周造模组肝窦周围1型胶原与正常组相似Ⅳ型胶原明显减少.
LM增多:第u周造模组大鼠肝窦周围的I型胶原仍无增多Ⅳ型胶原进一步减少.
LM则比第6周末明显降低.
提示肝纤维化时.
大鼠肝脏内皮细胞和肝细胞之间大量的功能性基底膜遭受破坏但因连续性基底膜的形成受到干扰肝窦毛细血管化程度不根严重.
此可能是CC1.
肝纤维化大鼠有自愈倾向的原因之一.
关键词肝纤维化免疫组化肝窦毛细血管化细胞外基质的变化是肝纤维化形成的主要机制之一,而肝窦的毛细血管化则是纤维化肝脏的一种重要病理改变….
本文运用免疫组化方法,通过检测正常和肝纤维化大鼠肝脏的I、Ⅳ型胶原及板层索(1aminin.
LM),探讨实验性肝纤维化肝脏肝窦毛细血管化形成和转化的原因.
材料与方法一、材料㈠实验动物:Wistar雄性大鼠34只.
体重200~250g由本院实验动物中心提供.
㈢主要试剂:1.
多克隆抗体:①I型胶原抗体:兔抗牛I型胶原抗血清,上海医科大学病理教研室产品.
工作浓度为i:50.
②Ⅳ型胶原抗体:兔抗小鼠Ⅳ型胶原NC1片段NC1/2抗血清.
由德国FREIE大学DetlefSchuppan博士馈赠.
工作浓度为1:60.
③LM抗体:兔抗鼠LM抗血清,北京医科大学生化教研室产品,工作浓度为1:20o.
2.
羊抗兔IgG(ZE作浓度为1:200);兔抗羊PAP抗体(工作浓度为1:200);正常羊血清.
均系上海医科大学病理教研室产品.
二、方法㈠造模方法:用纯四氯化碳(CC1.
,分析纯)造模24只大鼠n.
至第6周末.
乙醚麻醉、断头处死15只.
其余9只自第7周起停用CCl.
恢复饲普通饲料.
至第l1周末,乙醚麻醉.
断头处死.
另外10只大鼠作为正常组.
不作任何处理.
饮料均为自来水.
㈢免疫组化方法:取肝脏左叶.
标本用10甲醛固定,石蜡包埋.
切片厚55m0.
1胃蛋白酶溶液消化.
采用PAP法,DAB显色.
同时设阴性替代片和空白片对照显色.
㈢免疫组化显色标准:按显色程度分弱、中、强三种,分别用+、++、+++表示.
按显色范围分为:①+:显色范围占肝脏3/4.
并将显色程度和范围换算成显色指数:显色指数=显色程度*显色范围(+为1、++为2、+++为3、++++为4).
结果一、正常大鼠肝脏免疫组化观察I型胶原蛋白主要存在于中央静脉、门脉区三联管管周及管间纤维组织中,在肝窦四周也有少量存在.
Ⅳ型胶原蛋白围绕在各种血管周围,量少,在门脉区中量极少,在肝窦周围也有作者单位:20OO32上海市中医药研究院肝病研究巾心http://www.
paper.
edu.
cn中华梢化杂志1995年6月第l5卷第s期少量存在,在某些肝细胞表面染色阳性.
LM位于血管和胆小管周围,在门脉区纤维组织内也可见到四周有少量LM的细胞,肝窦周围有不连续的LM,量很少二、肝纤维化大鼠免疫组化观察造模第6周末处死的大鼠,肝窦周围I型胶原的分布与正常组相似:Ⅳ型胶原比正常组明显减少;LM呈不连续状,量增多.
造模第l1周末处死的大鼠肝窦周围的I型胶原仍无增多:IV型胶原较第6周末进一步减少;LM则比第6周末明显降低(附图)附罔正常大鼠与肝纤维化大鼠肝窦周围I、lv型脏原以及扳层常的比鞍讨论Ⅳ型胶原又称基底膜胶原,占总胶原量的7,位于小叶血管及胆管的基底膜中,也存在于狱氏间隙周围.
多年来,正常肝脏一直被错认为缺乏基底膜.
晚近,Bissell等"'用免疫荧光法发现Ⅳ型胶原沿着肝窦周围连续性存在,Ⅳ型胶原分子互相连续形成基底膜筛网状结构,为相邻肝细胞和窦内皮细胞之间的一种功能性基底膜然而,Hayasaka等"仍持相反观点他们在电镜下观察到正常肝脏狄氏间隙有Ⅳ型胶原,但无典型的连续性基底膜.
本文用PAP法在正常大鼠肝脏显示的Ⅳ型胶原分布范围与前者报道相同.
LM又称基膜连接蛋白、层粘连素、层粘连蛋白、层粘蛋白或昆布氨酸是基底膜中主要的糖蛋白.
LM具有通过一种特殊的LM受体(属于整合素家族的一种)与上皮细胞相连接的能力.
LM与Ⅳ型胶原特异性结合后,再互相聚合形成大分子复合物,从而发挥基底膜的功能",调节包括肝细胞在内的上皮细胞….
LM在正常肝脏主要分布在血管、淋巴管和胆管的基底膜中n,本文在这些部位也观察到LM的存在.
以前认为,正常肝脏的肝窦内皮细胞表面或肝窦内不存在LM,从而认为肝窦内无基底膜存在.
然而晚近发现LM总是伴随Ⅳ型胶原存在,其在狄氏间隙中星弱阳性反应n.
本文在肝窦周围观察到少量不连续的LM,支持正常肝脏狄氏问隙存在LM的学说.
在肝硬化或肝纤维化的进展过程中,有一步骤起了十分重要的作用,即肝窦或狄氏间隙的毛细血管化".
所谓毛细血管化指的是在肝内皮细胞和肝细胞之间,出现一层基底膜的病理变化,使肝窦或狱氏间隙丧失原有的生理功能,成为类似于毛细血管一样的管道.
肝纤维化时,肝窦毛细血管化具有重要的病理学意义.
一方面,其作为一种屏障,阻碍了肝细胞与血液之间正常进行的物质交换:另一方面,肝窦内基底膜形成使窦腔变窄,造成肝内血流阻力增加,为形成门脉高压提供了基础.
基于对正常肝脏是否存在功能性基底膜的不同认识,目前对肝纤维化时基底膜的形成及构成成分有二种观点.
比较传统的观点认为正常肝窦周围缺乏Ⅳ型胶原和LM,故不存在基底膜.
肝纤维化时,因病原损伤肝脏,使肝内Ⅳ型胶原和LM合成分泌增加,二者沉积于窦内皮细胞表面,相互并同其它一些基质成分结合,共同形成基底膜另一较新观点则认为正常狄氏间隙内存在由Ⅳ型胶原和少量LM组成的功能性基底膜.
当肝脏因感受各种病因而受损后,使狄氏间隙内原本静止的贮脂细胞活化释放出Ⅳ型胶原酶,降解Ⅳ型胶碌,同时该细胞由正常合成分珏Ⅲ型胶原改为合成分泌I型胶原,后者取代了Ⅳ型胶原.
贮脂细胞活化后还合成分泌大量LM.
如此,由I型148胶原和LM组成了完整的基底膜从而使狄氏间隙毛细血管化,并进一步激活贮脂细胞".
这二种观点都有一些体内外实验数据所支持.
本文观察到的由CCI.
所致的肝纤维化肝脏免疫组化变化,支持上述第二种观点.
二组未处死的大鼠肝脏肝窦周围的Ⅳ型胶原帮比正常动物大为减少从而大量破坏了内皮细胞和肝细胞之间的功能性基底膜,这是活化的贮脂细胞分泌Ⅳ型胶原酶使Ⅳ型胶原大量降解的结果.
在造模第6周末,肝窦周围U增多,可是由于该部位的I型胶原没有同步增多,因而干扰了连续性基底膜的形成致使肝窦毛细血管化程度不很严重.
至第l1周末时虽然肝窦周围Ⅳ型胶原进一步减少,功能性基底膜进一步被破坏,但是由于贮脂细胞不再受到CCI.
的刺激,以及未受到连续性基底膜形成后的进一步活化,其合成分泌细胞外基质的功能转为抑制状态故肝窦周围的I型胶原和LM量均已在正常范围,这可能是CCI.
大鼠肝纤维化模型有白愈倾向的原因之一.
(本文在研究过程中得到上海医科大学病理解剖教研室张秀荣副主任技师的帮助,致谢)中华消化杂志1995年6月第16卷第3期参考文献l_SchuppanD.
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InCCh-inducedhepaticfibrosisofratsatthe6thweek,thequantityofcollagentypeIinthehepaticperisinusoidswasasaboutthesameasthatofnorl~alratgroup,collagentypeIVdecreasedobviously,andLMelevated.
At也ellthweek.
thequanfityofcdllagentypeIstilldidnotincrease,collagentypeIVdecreasedcontinuously.
andLMwasfarlessthanthatofthe6thweekgroup.
Thesealterationsindicatedthat,inhepaticfibrosis,fitnctionalbasementmembranewasdamagedbetweenendothelialcellsandhepatocytesinratliver.
butcapillarizationofsinusoidSwasnotmarkedbecauseofsomedisturhancesinformingacontinuousbasementmembrane.
ThiSmaybeoneofcausesleadingtoself-resolutionoffibrosisinducedbyCCh—inratliver.
Keywords:Hepaticfibrosis;Immunohistochemistry;Capillarizationofsinusoids.