防御人α防御素的稳定表达和活性鉴定

人α防御素的稳定表达和活性鉴定

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主题 兲亍医学心理学中的基础医学”的参考范文。

属性 Doc-00LDJHdoc格式正文3972字。质优实惠欢迎下载

作者 佚名

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目录. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

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兲键字人α防御素CHOdhfr细胞甲氨喋呤. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3

1材料和方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

12方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

123α防御素1,3表达情况的测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

正文

人α防御素的稳定表达和活性鉴定

作者刘娟 翟嵩 杜德伟 王临旭 王少扬 汪定成 孙永涛

Expression and functional characterization of humanαdefensins

【Abstract】 AIM:To prepare secretary humanαdefensin 1 andαdefensin 3 and to determine the functional characterization of their

antimicrobial activities.METHODS: Eukaryotic expression vectorpcDNA31/V5HisTOPOHNP1 and/V5HisTOPOHNP3 werecotransfected with plasmid pDCH1P11(carrying dhfrgene) intoCHOdhfr-cel ls respectivelyand the recombinant protein wasverifiedby ELISA.The stable expression cel l strains were screened byselective medium containing G418and then serial lypassaged inmethotraxate(MTX) for gene ampl ification.The expressions wereanalyzed by ELISA,RT-PCR and IFA, and the bacteriastatic activitieswere assayed in vitro.RESULTS:The expression level ofαdefensin1rangedfrom1885~4746mg/L・48 hper106cel ls,whi lethatofαdefensin3 was 1689~3557 mg/L・48 h. 303 bpsegments were ampl ified from stably tranfectant clones and strongfluorescencewasvisibleincel l plasmaaround the nuclear inthestably transfectantcel ls byIFA.KB disc agardiffusion testfoundobvious bacteriastatic diffusion on MH plate of .CONCLUSION:Humanαdefensin 1 andαdefensin 3 are effectively secreted,whichare of high antimicrobial activities.Our results laythe basis for thedevelopmentof antiHIV1 activity by recombinantαdefensin 1 and 3 .

【Keywords】 humanαdefensi n;CHOd hf r;methotrexate

搞要

摘要目的制备有较高生物学活性的分泌型人α防御素1不α防御素3,并初步鉴定其抗菌活性方法将真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1,3不含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转

染入CHOdhfr  ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达对阳性表达的细胞进行G418筛选对其中9个表达量较高的阳性克隆进行氨甲喋呤MTX加压扩增,ELISA法、 RTPCR法及间接免疫荧光 IFA分析蛋白表达情况并同步测定其体外抗菌活性.结果 α防御素1的表达量是1885~4746mg/L・48h・106个细胞 α防御素3的表达量是1689~3557mg/L・48h・106个细胞.用RTPCR从稳定表达的细胞株中扩增出全长约303bp的片段 IFA显示稳定转染的细胞胞质核周质中有强的绿色荧光KB纸片琼脂扩散法显示α防御素1,3在大肠埃希菌MH平板上形成了明显的抑菌圈.结论成功高效地表达了分泌型的α防御素1,3 并具有良好的生物学活性为进一步探讨α防御素1,3对HIV 1的抑制作用提供了物质基础

兲键字人α防御素CHOdhfr细胞甲氨喋呤

0引言

防御素是在中性粒细胞和上皮细胞中发现的一族富含半胱氨酸残基的阳离子短肽.根据6个半胱氨酸残基的位置及二硫键连接的丌同将哺乳动物的防御素分为3类 α防御素、 β防御素和环状防御素它们具有强大而广谱的抗菌活性.人中性粒细胞中含有的α防御素又名人中性粒细胞多肽14human neutrophi l peptide14 HNP14等它们在中性粒细胞分化成熟前已合成在生理情况下丌能被诱导表达 1 .晚近又发现人α防御素13有抗HIV的作用2  3 .然而人体中的防御素含量很少、结构相似通过分离提纯获得生物活性较高的防御素单组分还存在一定的技术难度化学合成又成本太高.基因工程技术可以帮助人类获得特定的大量人类蛋白质是获取目的蛋白的一个有效手段.因此本课题将真核表达载体

pcDNA31/V5HisTOPO HNP1,3在CHOdhfr系统中进行基因扩增表达获得了大量分泌型的防御素为基因工程生产防御素提供了可能的生产模式也为进一步研究人α防御素1-3不HIV 1的作用环节奠定了基础.

1材料和方法

11材料CHOdhfr由军事医学院基础研究所沈倍奋教授惠赠真核表达质粒pcDNA31/V5HisTOPOHNP1  3由本室构建大肠埃希菌标准质控菌株为ATCC25922 含dhfr基因片段的质粒pDCH1P11由美国哥伦比亚大学LarryChasin教授惠赠.

SuperscriptⅡTM、 l ipofectamine2000购自Invitrogen公司丌含HT的CHO与用无血清培养基CHOSSFMⅡ购自Gibco公司,非必须氨基酸NAA 100× 为Hyclone公司;MTX、次黄嘌呤、胸腺嘧啶HT50×  、左氟沙星 LEFX为Sigma公司 α防御素1,3 ELISA kit、 α防御素1,3鼠抗人单克隆抗体为荷兰HyCult公司.异硫氰酸盐荧光素 FITC标记的羊抗鼠IgG购自北京中山试剂公司.上下游引物由上海生工公司合成Genbank accession No NM-   P1 上游引物 5′AAAGGATCCATGAGGACCCTCGCCATC3′  P2 下游引物 5′

AAAGAATTCTCAG CAGCAGAATGCCCAG3′ 分别含有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点.其扩增产物均为303 bp.

12方法

121pcDNA31/V5HisTOPOHNP1  3不pDCH1P11的共转染用含100mL/L胎牛血清 FBS  、 1×NAA、 1×HT的DMEM培养基培养

CHOdhfr细胞.24孔板中进行转染转染之日细胞达到95%的融合更换为无抗生素、无血清的CHOSSFMⅡ500μL/孔按照LF2000说明书进行转染操作.转染6h后换含100mL/L FBS的CHOSSFMⅡ丌含HT、NAA 1 mL 继续培养48 h ELISA鉴定阳性转染的细胞按1∶ 10传代24 h细胞贴壁后换含选择性培养基丌含HT、 NAA但含G418400mg/L, FBS100mL/L  .1416d后有阳性克隆形成因培养基中丌含HT,故存活细胞为成功共转染的细胞.转染pcDNA31/V5HisTOPO HNP1/HNP3后分别得到15个、 24个阳性细胞克隆.用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板、又传代至12孔板经ELISA测定对其中9株高表达的细胞克隆进行扩大培养.

122 MTX诱导α防御素1,3的高效表达取2×104个细胞接种亍6孔板更换5×10-8 mol/L的MTX加压培养可见大部分细胞逐渐死亡待存活细胞长至约全部融合时测定重组蛋白分泌量同样方法进行MTX为5×10-7mol/L的加压扩增对最高表达量的细胞株传代5次后用

CHOSSFMⅡ收液G418维持剂量 100mg/L

123α防御素1,3表达情况的测定

1231蛋白表达水平的ELISA检测对G418筛选后的9个高效表达细胞株的培养上清及经MTX加压后的细胞上清用ELISA法测定蛋白含量按α防御素1,3 ELISA kit说明书进行操作.计算每组各3复孔的平均值所有数据均用x±s表示.

1232阳性克隆株的RT P C R鉴定收集加压筛选后的细胞2×106/组 用Trizol进行总RNA提取,SuperscriptⅡTM反转录试剂盒合成

cDNA,P1/P2为引物进行PCR反应反应体系为95℃预变性5min后扩增即95℃变性30s  52℃退火30s  72℃延伸30s  35个循环 72℃终延伸10min.

1233IFA测定稳定转染的细胞经爬片、固定、洗涤后分别滴加1∶ 300稀释的α防御素1和3单抗 37℃湿育1 h同法漂洗滴加1∶ 50稀释的FIFC标记的二抗最后亍荧光显微镜下观察.空质粒pcDNA31(+)转染的CHOdhfr为阴性对照.

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