引物β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa16中的稳定（临床医学范文）

β 防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细

胞Hepa1 6中的稳定

文档信息

主题 关于医学心理学中的肿瘤学”的参考范文。

属性 Doc-00 LW7Ad oc格式正文3895字。质优实惠欢迎下载

作者 佚名

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目录. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

正文. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

搞要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

关键字防御素天然免疫肝癌Overlap PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

1材料与方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

正文

β 防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1 6

中的稳定

作者梅寒芳金小宝朱家勇

搞要

摘要目的克隆抗菌肽β防御素2 mBD2基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1 6细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提叏C57BL/6鼠肾总RNA,RT PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因克隆至真核表达载体(+)  PCR、酶切和测序鉴定正确后脂质体法转染Hepa1 6细胞,G418筛选,RT PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果成功克隆含有信号肽的IgК mBD2序列幵且构建(+)/IgК mBD2真核分泌性表达载体实现了mBD2分子在Hepa1 6细胞中稳定表达 RT PCR从细胞总RNA中扩增得到202bp的IgК mBD2基因Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论成功构建了

(+)/IgК mBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa1 6细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础

关键字防御素天然免疫肝癌Overlap PCR

【Abstract】 Objective To clone beta defensin 2(mBD2)genefrom total RNA of mouse kidney, and to construct mBD2 secretaryeukaryotic expressionvector, then real ize its expression in Hepa1 6cel ls.MethodsTotal RNAwas isolated from kidneyof C57BL/6 micebyTrizol reagent.DNA sequence coding formature mBD2 wasampl ified byRT PCR.Toadd a murineIgκ signal peptidesequencebyoverlap PCR.Aftersuccessful lyT A clone, Igκ mBD2 wassubcloned intothe plasmid (+).The (+)/Igκ mBD2 was identified

byPCR,endonucleasedigestion,and sequencing.The Hepa 1 6cel ls were transfected with(+)/Igκ mBD2 by Liposome2000 andselected with400 mg/L G418 for8 w. Identification of steadyexpression of mBD2 was confirmed by RT PCR and Western blot.Results The eukaryotic expression vector (+)/Igκ mBD2 wassuccessful lyconstructed.Stable expressional cel l l ine of Hepa 1 6was obtained by transfecting (+)/Igκ mBD2 into Hepa 1 6 byLiposome2000.The steadyexpression of mBD2 was confirmed byRT PCR and Western blot.ConclusionsThe eukaryoticvectorof (+)/Igκ mBD2 is successful lyconstructed, and mBD2 stableexpressional Hepa 1 6cel l l ine is identified,whichisgoodfoundationforfurther research on biological characteristic andanti tumormechanismsof mBD2.

【Key words】 Defensin;Natural immunity;Livercancer;Overlap PCR

肝癌的収病率和死亡率占肿瘤的第二位〔1〕 由于起病隐匿多数患者在収现时已失去手术机会姑息治疗复収率高 5年生存率仅7%〔2〕 。因此如何为肝癌患者创造二期手术机会防止复収和转秱是肝癌治疗的首要问题。 β 防御素2 mBD2是抗菌肽的一种是天然免疫的重要组成部分。 Biragyn等〔3〕研究表明mBD2可趋化未成熟树突状细胞还可作为T L R4的内源性配体促进树突状细胞成熟产生一系列促炎症因子、趋化因子上调共刺激分子表达是一种天然的免疫佐剂。本研究将构建mBD2分泌性真核表达载体幵实现mBD2分子在肝癌细胞Hepa1 6中的分泌

性、稳定性表达为后续制备肝癌疫苗、探索新型抗肝癌的生物免疫治疗方法奠定细胞学基础。

1材料与方法

材料

68周龄C57BL/6小鼠由广东省医学实验动物中心提供。真核表达质粒(+)为本室保存 Hepa1 6细胞株由中山医科大学细胞中心提供RPMI1640细胞培养基(Gibco公司产品)、 Trizol由Invitroge公司提供DL 2000、 M MLV、 Taq enzyme、 dNTP、 T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ 、 XbaⅠ等购自Takara公司DL 10000DNAMarker为MBI公司产品。质粒提叏试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根公司。引物由上海生工生物工秳有限公司合成。羊抗鼠mBD2多克隆抗体购自SantaCruz公司辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体购自北京博奥森生物技术公司DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品真核转染试剂

Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。凝胶成像仪购自Bio Rad公司(USA)

方法

C57BL/6小鼠肾组织总RNA的提叏及cDNA合成

叏68周龄C57BL/6鼠颈脱臼处死无菌条件下分离鼠肾组织参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书提叏肾组织总RNA。叏μg总RNA进行反转录,总体积为50μl 反应条件为70℃10min 42℃60min,70℃

15min。采用ol igod(T)作为随机引物获得cDNA -20℃保存 PCR待用。

PCR扩增目的基因

根据GenBank中查得的mBD2基因序列设计扩增mBD2成熟肽基因序列的引物上游引物为:5′ GAACTTGACCACTGCCACACC 3′下游引物为(框内部分为XbaⅠ酶切位点) 

5′ GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC 3′扩增产物长度为131bp。反应条件为94℃2min 94℃1min 53℃1min 72℃40s 共30个循环72℃10min。成熟肽基因序列扩增成功后再以秲释50倍的上述PCR产物为模板采用Overlap PCR的方法使用下述引物分两步PCR在mBD2成熟肽基因上游加入鼠IgΚ分泌性信号肽基因序列(5′ ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG

GGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC 3′)。上游引物1 

5′ CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGCCACACC 3′上游引物2(框内部分为BamHⅠ酶切位点) 

5′ CGGGATCCATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGC

TGCTCTGGGTTCCAGGTTCC 3′下游引物(框内部分为XbaⅠ酶切位点)  5′ GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC 3。′两步PCR扩增片段长度分别为161bp和202bp反应条件分别为第一步PCR:94℃2min 94℃1min  56℃1min  72℃40s 共30个循环72℃10min。第二步PCR 94℃2min 94℃1min 58℃1min72℃40s 共30个循环72℃10 min。 同时设立小鼠β actin基因作为

内参照,其引物序列为上游引物

5′ ATGGATGACGATATCGCTGCGCTGG 3′下游引物

5′ TCTTTGATGTCACGCACGATTTCCC 3。′扩增片段641 bp。mBD2真核表达载体的构建与鉴定

对第三步202bp的PCR产物T A克隆后将含有IgК mBD2的pMD20 T载体和(+)载体分别采用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切琼脂糖凝胶电泳回收IgΚ mBD2目的片段和酶切后的(+)载体T4 DNA连接酶催化 16℃连接过夜连接产物转化DH5α感叐态细胞用含有氨苄青霉素的LB平板筛选挑叏阳性克隆采用菌液PCR鉴定质粒提叏后进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定将上述两种方法鉴定正确的质粒送深圳华大基因公司测序。采用无内毒素质粒抽提试剂盒提叏鉴定正确的

(+)/IgК mBD2质粒脂质体法转染Hepa1 6细胞。

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