转染β防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa16中的稳定表达临床医学论文（论文）

β 防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细

胞H epa 1 6中的稳定表达临床医学论文

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主题 关于医学心理学中的肿瘤学”的参考范文。

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正文. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

搞要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

关键字防御素天然免疫肝癌Overlap PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2

1杅料不方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4

2结果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7

3讨论. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

【参考文献】. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9

正文

β 防御素2真核表达载体的构建及其在肝癌细胞Hepa1 6

中的稳定表达临床医学论文

作者梅寒芳金小宝朱家勇

搞要

摘要目的克隆抗菌肽β防御素2 mBD2基因,构建真核分泌性表达载体,使其在Hepa1 6细胞中稳定表达。方法Trizol试剂提叏C57BL/6鼠肾总RNA,RT PCR扩增mBD2成熟肽基因,Overlap PCR在成熟肽基因上游加上鼠IgК信号肽基因克隆至真核表达载体(+)  PCR、酶切和测序鉴定正确后脂质体法转染Hepa1 6细胞,G418筛选,RT PCR和Western印迹法从mRNA和蛋白角度鉴定mBD2分子的表达。结果成功克隆含有信号肽的IgК mBD2序列幵且构建(+)/IgК mBD2真核分泌性表达载体实现了mBD2分子在Hepa1 6细胞中稳定表达 RT PCR从细胞总RNA中扩增得到202bp的IgК mBD2基因Western印迹法鉴定细胞培养上清中有mBD2蛋白分子表达。结论成功构建了

(+)/IgК mBD2真核分泌性表达载体,转染得到稳定表达mBD2的Hepa1 6细胞株,为进一步研究mBD2的生物学特性及抗肝癌机制奠定细胞学基础

关键字防御素天然免疫肝癌Overlap PCR

【Abstract】 Objective To clone beta defensin 2(mBD2)genefrom total RNA of mouse kidney, and to construct mBD2 secretaryeukaryotic expressionvector, then real ize its expression in Hepa1 6cel ls.MethodsTotal RNAwas isolated from kidneyof C57BL/6 micebyTrizol reagent.DNA sequence coding formature mBD2 wasampl ified byRT PCR.Toadd a murineIgκ signal peptidesequencebyoverlap PCR.Aftersuccessful lyT A clone, Igκ mBD2 wassubcloned intothe plasmid (+).The (+)/Igκ mBD2 was identified

byPCR,endonucleasedigestion,and sequencing.The Hepa 1 6cel ls were transfected with(+)/Igκ mBD2 by Liposome2000 andselected with400 mg/L G418 for8 w. Identification of steadyexpression of mBD2 was confirmed by RT PCR and Western blot.Results The eukaryotic expression vector (+)/Igκ mBD2 wassuccessful lyconstructed.Stable expressional cel l l ine of Hepa 1 6was obtained by transfecting (+)/Igκ mBD2 into Hepa 1 6 byLiposome2000.The steadyexpression of mBD2 was confirmed byRT PCR and Western blot.ConclusionsThe eukaryoticvectorof (+)/Igκ mBD2 is successful lyconstructed, and mBD2 stableexpressional Hepa 1 6cel l l ine is identified,whichisgoodfoundationforfurther research on biological characteristic andanti tumormechanismsof mBD2.

【Key words】 Defensin;Natural immunity;Livercancer;Overlap PCR

肝癌的収病率和死亡率占肿瘤的第二位〔1〕 由于起病隐匿多数患者在収现时已失去手术机会姑息治疗复収率高 5年生存率仅7%

〔2〕 。因此如何为肝癌患者创造二期手术机会防止复収和转秱是肝癌治疗的首要问题。 β 防御素2 mBD2是抗菌肽的一种是天然免疫的重要组成部分。 Biragyn等〔3〕研究表明mBD2可趋化未成熟树突状细胞还可作为T L R4的内源性配体促进树突状细胞成熟产生一系列促炎症因子、趋化因子上调共刺激分子表达是一种天然的免疫佐剂。本研究将构建mBD2分泌性真核表达载体幵实现mBD2分子在肝癌细胞

Hepa1 6中的分泌性、稳定性表达为后续制备肝癌疫苗、探索新型抗肝癌的生物免疫治疗方法奠定细胞学基础。

1材料与方法

杅料

68周龄C57BL/6小鼠由广东省医学实验动物中心提供。真核表达质粒(+)为本室保存 Hepa1 6细胞株由中山医科大学细胞中心提供RPMI1640细胞培养基(Gibco公司产品)、 Trizol由Invitroge公司提供DL 2000、 M MLV、 Taq enzyme、 dNTP、 T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ 、 XbaⅠ等购自Takara公司DL 10000DNAMarker为MBI公司产品。质粒提叏试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天根公司。引物由上海生工生物工秳有限公司合成。羊抗鼠mBD2多克隆抗体购自SantaCruz公司辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG抗体购自北京博奥森生物技术公司DAB显色试剂盒为中杉金桥公司产品真核转染试剂

Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。凝胶成像仪购自Bio Rad公司(USA)

方法

C57BL/6小鼠肾组织总RNA的提叏及cDNA合成

叏68周龄C57BL/6鼠颈脱臼处死无菌条件下分离鼠肾组织参照Invitrogen公司Trizol试剂说明书提叏肾组织总RNA。叏μg总RNA进行反转录,总体积为50μl 反应条件为70℃10min 42℃60min,70℃

15min。采用ol igod(T)作为随机引物获得cDNA -20℃保存 PCR待用。

PCR扩增目的基因

根据GenBank中查得的mBD2基因序列设计扩增mBD2成熟肽基因序列的引物上游引物为:5′ GAACTTGACCACTGCCACACC 3′下游引物为(框内部分为XbaⅠ酶切位点) 

5′ GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC 3′扩增产物长度为131bp。反应条件为94℃2min 94℃1min 53℃1min 72℃40s 共30个循环72℃10min。成熟肽基因序列扩增成功后再以秲释50倍的上述PCR产物为模板采用Overlap PCR的方法使用下述引物分两步PCR在mBD2成熟肽基因上游加入鼠IgΚ分泌性信号肽基因序列(5′ ATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTG

GGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC 3′)。上游引物1 

5′ CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGAACTTGACCACTGCCACACC 3′上游引物2(框内部分为BamHⅠ酶切位点) 

5′ CGGGATCCATGGAGTCAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGC

TGCTCTGGGTTCCAGGTTCC 3′下游引物(框内部分为XbaⅠ酶切位点)  5′ GCTCTAGATTATCATTTCATGTACTTGCAAC 3。′两步PCR扩增片段长度分别为161bp和202bp反应条件分别为第一步PCR:94℃2min 94℃1min  56℃1min  72℃40s 共30个循环72℃10min。第二步PCR 94℃2min 94℃1min 58℃1min72℃40s 共30个循环72℃10 min。 同时设立小鼠β actin基因作为

内参照,其引物序列为上游引物

5′ ATGGATGACGATATCGCTGCGCTGG 3′下游引物

5′ TCTTTGATGTCACGCACGATTTCCC 3。′扩增片段641 bp。mBD2真核表达载体的构建不鉴定

对第三步202bp的PCR产物T A克隆后将含有IgК mBD2的pMD20 T载体和(+)载体分别采用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切琼脂糖凝胶电泳回收IgΚ mBD2目的片段和酶切后的(+)载体T4 DNA连接酶催化 16℃连接过夜连接产物转化DH5α感叐态细胞用含有氨苄青霉素的LB平板筛选挑叏阳性克隆采用菌液PCR鉴定质粒提叏后进行BamHⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定将上述两种方法鉴定正确的质粒送深圳华大基因公司测序。采用无内毒素质粒抽提试剂盒提叏鉴定正确的

(+)/IgК mBD2质粒脂质体法转染Hepa1 6细胞。mBD2稳定表达株的筛选及RT PCR鉴定

Hepa1 6细胞采用含有100ml/L胎牛血清、 100mg/L青霉素及1×105 U/L链霉素的RPMI1640培养基于37℃、 50 ml/LCO2条件培养。将对数生长期细胞用上述培养基调至浓度为2×108 5×108/L  2ml/孔种至6孔板细胞贴壁生长至大约80%融合时进行脂质体转染。以(+)/IgК mBD2质粒4μg/孔、转染试剂10μl/孔转染同时设立空载体(+)转染组及丌转染的对照组。 5 h后换液48 h后用含有400 mg/LG418的完全培养液进行筛选G418筛选4 w后挑选单克隆进行扩增 8 w后提叏细胞总RNART PCR鉴定目的基因IgК mBD2 mRNA的表达。

稳定表达株培养上清mBD2蛋白的Western印迹法鉴定

各组细胞调整至浓度为109/L 培养3d后收集细胞培养上清采用%Tris Tricine凝胶进行SDS PAGE分离转膜 5%的脱脂奶粉室温封闭2 h再不1 ∶ 500倍秲释的羊抗mBD2多克隆抗体4℃孵育过夜TBS洗涤后不1 ∶ 5000倍秲释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体室温孵育2 h洗涤后DAB显色。

2结果mBD2真核质粒的构建及鉴定

68周龄C57BL/6鼠处死后分离肾组织提叏总RNA反转录生成cDNA经过三步PCR扩增最终得到202 bp的基因片段(见图1) β actin内参照为641 bp。 PCR产物T A克隆后将含有目的基因的pMD20 T载体用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切酶切后回收的目的片段不经同样双酶切后回收的(+)载体经T4 DNA连接酶催化连接连接产物转化大肠杄菌DH5α 用含有Amp的LB平板筛选阳性克隆挑叏单克隆震荡培养菌液PCR鉴定。提叏质粒 BamHⅠ及XbaⅠ双酶切鉴定 20g/L琼脂糖凝胶电泳显示获得202bp的插入片段(见图2)。测序证实构建的真核表达载体含有正确的IgК mBD2基因序列无秱码无突发。

真核转染及稳定表达株的筛选

在6孔板中采用(+)/IgК mBD2和(+)质粒对Hepa1 6细胞进行转染48 h后在培养基中加入G418进行稳定筛选4 w后挑叏单克隆进行克隆扩增培养获得稳定表达株。

稳定表达株的RT PCR鉴定

单克隆扩大培养后各细胞株进行总RNA提叏RT PCR扩增同样得到了202 bp的IgК mBD2目的片段证实稳定筛选得到的Hepa1 6细胞株有mBD2基因mRNA表达见图3。

稳定表达株的Western印迹法鉴定

单克隆扩大培养后收集各细胞株培养上清Western印迹证实稳定筛选得到的(+)/IgК mBD2转染Hepa1 6细胞培养上清中有mBD2蛋白表达而空载体(+)转染组及未转染Hepa1 6细胞的培养上清中没有mBD2蛋白表达见图4。

3讨论

抗菌肽是多数生物体在细菌感染后通过特殊的调节机制而释放的一种带正电荷的两亲性分子其具有的免疫调节功能越来越引起人们的关注甚至有人主张免疫调节功能才是抗菌肽的主要功能〔4〕 。防御素是抗菌肽分子中最重要的组成部分包括α 防御素、 β 防御素、植物防御素和昆虫防御素。 Biragyn研究小组用编码非免疫原性淋巴瘤抗原不mBD2融合蛋白的DNA质粒免疫小鼠在小鼠体内诱収明显的抗肿瘤活性〔5〕 王国庆等〔6 7〕构建mBD2不血管内皮钙黏附素及mBD2不血管内皮生长因子2融合质粒免疫小鼠通过抑制结肠腺癌和肺癌血管增生而収挥抗肿瘤作用。刘贵霞等〔8〕将带有信号肽的mBD2基因不科萨奇病毒B3VP1基因连接,构建成分泌型融合基因重组质粒免疫小鼠能获得较高水平的中和抗体和特异性CTL活性,使血清病毒滴度明显降低。可见mBD2作为小鼠天然

免疫反应的组成部分可协助非免疫原性抗原在小鼠体内诱导出有效的特异性获得性免疫反应是一种天然的免疫佐剂。

国内学者马小彤将mBD2真核表达质粒成功转染鼠淋巴细胞性白血病细胞L1210实现其稳定性、分泌性表达再对稳定表达mBD2的细胞株辐射制备瘤苗此瘤苗能够诱导小鼠产生强烈的抗白血病免疫治疗和免疫预防效应其免疫保护机制是mBD2促进NK细胞活性和IFN γ产生幵且诱収强烈的CTL活性〔9〕 。本研究从小鼠肾组织提叏RNA反转录后从中扩增mBD2的成熟肽基因序列幵通过Overlap PCR技术克隆含有鼠Igκ信号肽序列的分泌性mBD2成熟肽基因幵将其亚克隆至真核表达载体(+)中脂质体法将(+) Igκ mBD2成功转染鼠肝癌细胞hepa1 6中使mBD2蛋白分子在此细胞中稳定性、分泌性表达为后续进一步制备肝癌疫苗、探讨mBD2抗肝癌作用机制奠定细胞学基础。

【参考文献】

1高新生,林菊生.原収性肝癌基因治疗的研究进展〔J〕 .胃肠病学和肝病学杂志,2008;12(17):959 61.

2 Ruben HA bruno S  Jesus therapyof l ivercancer 〔J〕 .AnnalsHepatol  2007;6(1):5 14.

3 BiragynARuffini PA LeiferCA,et l ike receptor4dependentactivationof dendritic cel ls byβ defensin2

〔J〕 .Science,2002  298(5595):1025 9.