·7·第30卷第19期中国现代医学杂志Vol.
30No.
192020年10月ChinaJournalofModernMedicineOct.
2020收稿日期:2020-04-10*基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金资助(No:2016YXZD024,2017KFYXJJ085,2018KFYYXJJ118)DOI:10.
3969/j.
issn.
1005-8982.
2020.
19.
002文章编号:1005-8982(2020)19-0007-08右美托咪定减轻兔脊髓缺血再灌注损伤的机制研究*樊晓娜,刘娇,池卉,袁芬,胡霁(华中科技大学同济医学院附属梨园医院麻醉科,湖北武汉430077)摘要:目的探讨右美托咪定(Dex)对兔脊髓缺血再灌注损伤(SCIRI)的保护作用及潜在分子机制.
方法采用成年新西兰大耳白兔复制SCIRI模型.
实验一:42只兔随机分为7组,分别于灌注前(0h)及再灌注后3h、6h、12h、24h、36h及48h7个不同时间点,用Westernblotting法检测脊髓组织磷酸化的Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化的信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)的表达.
实验二:36只兔随机分为对照组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)及Dex干预组(Dex+I/R组).
Sham组分离腹主动脉后,不做缺血处理.
I/R组和Dex+I/R组,分离腹主动脉并夹闭30min,以诱导脊髓组织缺血.
脊髓缺血前30min,Dex+I/R组静脉给予Dex[10μg/(kg·h),直至再灌注后1h.
再灌注后48h对兔后肢运动功能进行Tarlov评分,苏木精-伊红(HE)染色观察脊髓组织病理学改变,原位末端转移酶标记(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况,伊文思蓝检测血-脑屏障的渗透性,Westernblotting法检测脊髓组织p-JAK2、p-STAT3、活化型半胱天冬酶-3(Cleavedcaspase-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达.
结果实验一:与灌注前(0h)比较,再灌注后6h、12h、24h及36h脊髓组织p-JAK2、p-STAT3的表达增加(均P0.
05).
见图1.
2.
2Dex对SCIRI后运动功能的影响再灌注后48h,各组Tarlov评分结果分别为:Sham组(4.
000±0.
000)、I/R组(1.
500±0.
904)、Dex+I/R组(2.
917±0.
668),经方差分析,差异有统计学意义(F=48.
145,P=0.
000).
Sham组均无运动功能障碍;I/R组评分低于Sham组(P0.
05);而Dex+I/R组p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量较I/R组升高(P<0.
05).
见图6.
再灌注后48h,各组Cleavedcaspase-3蛋白相对表达量分别为:Sham组(0.
054±0.
026)、I/R组(0.
320±0.
043)、Dex+I/R组(0.
155±0.
025),经方差分析,差异有统计学意义(F=102.
559,P=0.
000);各组TNF-α蛋白相对表达量分别为:Sham组(0.
061±0.
033)、I/R组(0.
534±0.
072)、Dex+I/R组(0.
248±0.
074),经方差分析,差异有统计学意义(F=87.
413,为对比明显,Merged所示图片为TUNEL染色与DAPI染色图片的重叠;①与Sham组比较,P<0.
05;②与I/R组比较,P<0.
05.
图4各组脊髓组织凋亡神经细胞比较(*100)Sham组I/R组Dex+I/R组50403020100凋亡神经细胞/%Sham组I/R组Dex+I/R组①②①Sham组I/R组Dex+I/R组TUNELDAPIMerged①与Sham组比较,P<0.
05;②与I/R组比较,P<0.
05.
图5再灌注48h后各组脊髓组织中伊文思蓝含量比较(*200)Sham组I/R组Dex+I/R组20151050Sham组I/R组Dex+I/R组Sham组I/R组Dex+I/R组伊文思蓝含量/(μg/g)①②①图3各组脊髓组织病理学结果(HE染色*100)Sham组I/R组Dex+I/R组樊晓娜,等:右美托咪定减轻兔脊髓缺血再灌注损伤的机制研究·12·中国现代医学杂志第30卷3讨论SCIRI作为胸腹主动脉术后最严重的并发症之一,可导致患者严重和长期的残疾.
因此,改善这种破坏性状况的新举措具有十分重要的临床意义.
本研究结果表明,Dex在缺血前30min直至再灌注后短期内(1h),能够改善新西兰大耳白兔SCIRI后神经功能障碍,并减轻其脊髓组织学损伤.
在SCIRI过程中,导致神经元丢失的病理生理学机制十分复杂.
因此,揭示其潜在过程是实施新型神经保护疗法的关键.
SCIRI产生的主要原因是:术中P=0.
000);各组IL-6蛋白相对表达量分别为:Sham组(0.
148±0.
040)、I/R组(0.
489±0.
071)、Dex+I/R组(0.
288±0.
055),经方差分析,差异有统计学意义(F=54.
199,P=0.
000).
I/R组Cleavedcaspase-3、TNF-α及IL-6蛋白相对表达量较Sham组升高(P<0.
05);而Dex+I/R组Cleavedcaspase-3、TNF-α及IL-6蛋白相对表达量较I/R组降低(P<0.
05).
见图7、8.
与I/R组比较,P<0.
05.
图6各组脊髓组织中p-JAK2、p-STAT3蛋白表达131kD86kD37kDSham组I/R组Dex+I/R组p-JAK2p-STAT3GAPDHSham组I/R组Dex+I/R组p-JAK2p-STAT30.
80.
60.
40.
20.
0p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量①与Sham组比较,P<0.
05;②与I/R组比较,P<0.
05.
图8各组脊髓组织中TNF-α和IL-6蛋白表达Sham组I/R组Dex+I/R组Sham组I/R组Dex+I/R组0.
80.
60.
40.
20.
0Sham组I/R组Dex+I/R组26kD37kDTNF-αGAPDH25kD37kDSham组I/R组Dex+I/R组IL-6GAPDHSham组I/R组Dex+I/R组Sham组I/R组Dex+I/R组0.
80.
60.
40.
20.
0TNF-α蛋白相对表达量IL-6蛋白相对表达量②②①①17kD37kDSham组I/R组Dex+I/R组CleavedCaspase-3GAPDHSham组I/R组Dex+I/R组Sham组I/R组Dex+I/R组CleavedCaspase-3蛋白相对表达量0.
50.
40.
30.
20.
10.
0①②①与Sham组比较,P<0.
05;②与I/R组比较,P<0.
05.
图7各组脊髓组织中CleavedCaspase-3蛋白表达·13·第19期樊晓娜,等:右美托咪定减轻兔脊髓缺血再灌注损伤的机制研究脊髓组织缺血以及血流再恢复后,氧自由基大量生成、促炎因子释放和线粒体衰竭等造成"二次损伤"[12-14].
在这一过程中,促凋亡信号诱导的运动神经元延迟和选择性死亡,以及炎症导致的血-脑屏障结构的破坏,是脊髓不可逆损伤的关键.
其中,细胞凋亡被认为是SCIRI后神经元的主要死亡方式[15].
而血-脑屏障的完整性对维持中枢神经系统稳态和内环境稳定至关重要[16].
再灌注早期,血-脑屏障的破裂和出血导致免疫细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)浸润,引发炎症级联反应,进一步加重组织损伤[17].
因此,对血-脑屏障破坏的早期干预,可有效预防SCIRI.
本研究结果显示,SCIRI过程中,Dex可减少凋亡神经细胞数,并降低血-脑屏障的渗透性.
因此,在研究剂量内,对凋亡的抑制和血-脑屏障结构完整性的维持,可能是Dex发挥其神经保护效应的关键.
JAK2/STAT3信号通路的活化在老鼠器官的I/R损伤中发挥关键性的保护作用[18-19].
Caspase-3是细胞凋亡信号的主要执行者,可由外源及内源性途径激活[20].
在体外通过氧糖剥夺模拟I/R损伤发现,激活的JAK2/STAT3信号通路,可通过提高bcl-2/bax比值,从而降低CleavedCaspase-3水平,保护HT22神经细胞免受凋亡[21].
该调节作用在心肌I/R损伤的体外研究中,同样得到证实[22].
此外,活化的STAT3还通过抑制下游炎症因子TNF-α、IL-6的表达,减轻I/R损伤[7,23].
通过实验一,本研究发现,再灌注短期内,JAK2/STAT3保护性通路被激活,但这种激活作用并未维持,这可能是导致SCIRI加重的关键,OSUKA等[8]的研究结果也证实了这一点.
而Dex能够激活JAK2/STAT3信号通路,并抑制炎症因子(TNF-α、IL-6)及凋亡蛋白(CleavedCaspase-3)的表达.
因此,Dex可减轻SCIRI的潜在机制可能与其激活JAK2/STAT3信号通路,从而对炎症与凋亡进行调控有关.
综上所述,在脊髓缺血前,直至再灌注短期内连续给予Dex,可作为一种相对安全的神经保护策略,应用于SCIRI的预防及治疗过程.
此外,对JAK2/STAT3信号通路的调节,可能为进一步寻找新的脊髓神经保护策略提供分子靶点.
再者,若Dex以低剂量的镇静浓度持续应用于再灌注后48h,是否能提供更稳定及有效的神经保护作用,值得探讨.
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