基因首只警用克隆犬

第l9卷2期2004年4月叶】国病毒学VIROLOGICASINICAl9(2):l20_~124April2004伪狂犬病病毒Ea株基因组UL区的克隆与序列分析马相如,胡勤芹,肖少波,方六荣,陈焕#中农、大学农业微:物学家重点实验室,湖北武汉430070)春CloningandSequenceAnalysisoftheGenomeUniqueLongRegionofPseudorabiesVirusEaStrainMAXiang—Ru,HUQin—qin,XIAOShao—bo,FANGLiu—rong.
CHENHuan—chun(StatekeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiologyHuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)Abstract:A3.
76kbgenomeDNAfragment,containingthecompletecodingsequencesofc,,c,2,UL33andUL34genesandthepartialcodingsequencesofUL3OandUL35genesofPseudorabiesvirus(PRV)Eastrain,wasamplifiedbyPCRandsequenced.
TheresultsshowthattheG+CcontentsofU.
己rJ2,己rJ3and己rJ3genesarevariedfrom69.
5%tO73.
4%.
andtheaminoacidcompositioniSskewedtocodonsrichinGsandCsnucleotides,especiallythethirdcodoniSCsorGs.
Thethreemostcommonaminoacids(Ala,LeuandArg)comprise36.
4%ofthetotalresidues.
BoththenucleotideandaminoacidsequencesidentitiesofUL31and32genesofPRVEastrainandPRVKastrainaremorethan98.
2%,whereastheaminoacididentitiesof￡j3andLj4genesare95.
7%and94.
8%.
respectively.
eUL3lgeneishighlyconservedamongalphaherpesviruses.
andthehomologyofUL31geneofPRVandEquineherpesvirus4(EHV一4)ishigherthanothers.
Theaminoacidsequenceidentitieof【,L2,L33andL3genesofPRVandBovineherpesvirusl(BHV—1)arehigherthanothers.
ProteinkinaseCphosphorylationsitesandcaseinkinaseIIphosphorylationsitesarefoundinalltheaminoacidsequencesofUL3l,UL32,UL33andUL34genes,whichsuggeststhatallthefourgenesarepossiblyphOsphOprOteins.
Keywords:Pseudorabiesvirus;Genomefragment;Cloning;Sequenceanalysis摘要:从伪狂犬病病毒Ea株基凶组DNA中扩增到3.
76kb的基因组片段,该片段包含3』、UL32、UL33和UL34基因完整编码区,以及UL30和UL35基因部分序列.
3』、UL32、UL33和UL34基因G+C含量为69.
5%~73_4%,偏向于使用富含GC特别是第_二密码子位置上核苷酸是C或G的密码子,Ala、Leu、Arg的利用率最高,占氨基酸残基总数的36.
4%.
PRVEa株3』和UL32基因与PRVKa株核苷酸与氨基酸序列同源性都很高,在98%以上;而UL33和UL34基因与Ka株的氨基酸序列同源性较低,分别为95.
7%和94.
8%.
rj』基因在疱疹病毒a一亚科所有成员之间都很保守,并H【,』基因与马疱疹病毒IV型同源程度最高.
UL32、UL33和UL34基因均与牛疱疹病毒I型同源程度最高.
【』、UL32、UL33与UL34基因产物均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.
关键词:伪狂犬病病毒;基因组片段;克隆;序列分析中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1003—5152(2004)02—0120—05伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)属疱疹病毒科q.
疱疹病毒亚科水痘样病毒属,其基因组为线状双链DNA,长约150kb,排列非常紧凑,可编码70~100种蛋白质llo疱疹病毒0【.
亚科其它成员收稿日期:2003—08—19,修回H期:2003—11—10作者简介:马相如(1977一),男、河南郑州籍,硕士研究生,主要从事动物病毒分子生物学研究.
}通讯作者.
CorrespondingauthorTel&Fax:027—87282608.
E—mail:hzauvet@public.
whhbcn维普资讯http://www.
cqvip.
com马相如,等.
伪狂犬俩铂毒Ea株基囚组UL区的克隆与序列分析121如人单纯疱疹病毒I型(Humanherpes~,iru.
HSV一1)、牛疱疹病毒I型(Bovineherpesvirus,、BHV一1)、马疱疹病毒IV型(Equineherpesvirus,EHV一4)和火鸡疱疹病毒(Turkeyherpesvirus,THV)全基因组测序早已完成,而PRV由于G+C含量高达73%以,至今仍未完成全基因组测序.
但据最新的义献显示,PRV基因组测序已完成95%以卜Ill,只有部分基因间隔区域未测定.
PRV约有30种结构蛋白质,它们聚集形成4种形态不同的病毒成分:最里层的核蛋白核心、具宵二十面体结构的衣壳、包含病毒糖蛋白的脂质囊膜以及位于衣壳和囊膜之间的问质蛋白层IlI.
最近,关于疱疹病毒包装过程及蛋白质相互作用的研究很多.
Klupp(2000)等发现PRVUL34蛋白分布在宿主细胞的核膜上,若缺失UL34蛋白,核衣壳不能完成早期的包膜l.
2002年Fuchs等发现PRV[{】UL3l和UL34蛋白相互作用影响核衣壳的早期包膜,而且酵母双杂交分析表明UL31蛋白与UL34蛋白N端的特异性相互作用,有利于UL31蛋白在核内的定位J.
虽然关于PRV中UL32与UL33基因的研究很少,但人单纯疱疹病毒巾UL32与UL33同源基因的功能已经研究的比较清楚.
HSV一1中UL32与UL33蛋白质与病毒基因组DNA的裂解.
平u包装以及衣壳形成有关I4、51.
2002年Beard等研究发现HSV.
1中DNA裂解和包装蛋白UL28、UL15与UL33在感染细胞中形成复合体I6J.
本研究从伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA中扩增到包含UL31、UL32、UL33和UL34基因完整编码区以及UL30和UL35基因部分序列的3.
76kb基因组片段,并对其核苷酸与氨基酸序列进行分析及同源比对,仞步研究了PRV的密码子使用偏性.
为进一步深入研究PRV病毒中UL31、UL32、UL33和UL34基因的功能奠定了基础.
1材料与方法1.
1实验材料伪狂犬病病毒Ea株由本室分离并鉴定I,J,大肠杆菌菌株DH5.
由本室保存.
各种限制性内切酶、Taq酶、pMD18一TVector均为TaKaRa公司产品.
DNA快速回收试剂盒购自上海生工公司.
1.
2基因组模板的制备PRV病毒基因组DNA的提取按文献J进行;将提取的PRV病毒基因组以灭菌的双蒸水200倍稀释作为PCR模板.
1.
3引物设计根据文献艮道的PRVKa株UL30(3端部分序列)、,、UL32、UL33(5端部分序列)基因序列以及文献报道的PRVKa株UL33、UL34和UL35基因序列分别设计上下游引物P1和P2.
用OMIGA2.
0软件将文献报道的两段DNA序列进行拼接,发现位于引物P1和P2之问的PRVKa株基因组片段序列长度为3734bp.
引物P15一ACGGAAAGGTTGCTCAAGC—引物P2:5一GTTGAGCCGGAGCAGAArGT—1.
4PCR扩增基因组片段的扩增条件为:96oC4min变性后进入循环95oC、30s,52℃、lmin,72℃、5min,共31个循环,最后72℃延伸lOmin.
0.
8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物.
1.
5目的片段的克隆DNA快速回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物,与pMD18一T载体连接,转化EcoliDH5.
,涂布含氨苄青霉素、X—gal和IPTG的LB培养基,挑取白色单菌落,碱裂解法制备质粒,酶切鉴定重组子,阳性重组质粒命名为pMD—UL3.
76.
1.
6序列分析将重组质粒plglD—UL3.
76纯化后,送TaKaRa公司用DNA自动测序仪及人工合成引物接驳的方法不断延长测定序列,直至测完全序列,对有些区域作反复测定.
对测定序列用blastn及blastx搜索GenBankDataBase中的高分同源序列.
用OMIGA2.
0软件进行序列分析比较.
用白编程序DNAskew对UL3,、UL32、UL33和UL34基因同义密码子及氨基酸使用偏性进行统计分析.
2结果2.
1PCR扩增和酶切鉴定以PRV基因组DNA为模板,Pl和P2分别为上下游引物,在PCR扩增体系中加入终浓度为10%的甘油.
扩增产物在0.
8%琼脂糖凝胶中可见一条3.
76kb左右的特异性条带,其大小同预期的相当.
回收该片段,克隆到pMD18一T的相应位点,获得重组质粒pMD—UL3.
76.
重组质粒pMD—UL3.
76用BamHI单酶切以及BamHI和H/ridIII双酶切鉴定,0.
8%琼脂糖凝胶电泳分析(图1).
BamHI单酶切所得片段大小6.
45kb左右,与理论计算值相符;BamHI和HindIII双酶切结果中可见一条3.
76kb左右的外源片段与一条2.
69kb左右的载体片段.
以上结果表明重组质粒pMD—UL3.
76构建正确.
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coml22{病毒学第l9卷l重组质粒pMD—UL3.
76的酶切鉴定Fig.
1IdentificationoftherecombinantplasmidpMD—UL3.
76M:DNAmarker(DL一15000);1.
pMD—UL376/BamHI:2.
pMD—UL376/BarnHI+HindIII.
2.
2基因组3.
76kb片段的序列测定纯化重组质粒pMD.
UL3.
76,用DNA自动测序仪及人工合成引物接驳的_方法不断延长测定外源片段DNA序列,直至测完全序列,共合成6个测序引物,进行8次测序反应,对与观基因区域作反复测定.
该序列总长度为3756bp,G+C含量为72.
47%,已录入GenBank,序列号(AccessionNumber)为AY3l8876.
该3.
76kb基因组片段包含PRVEa株UL3、UL32、UL33和4基因完整编码区以及UL30和比5基因部分序列,与PRVKa株对应序列同源程度为96.
7%,PRVEa株有25处插入突变,3处缺失突变,92处置换突变,突变区域主要集中在UL33与UL34基因内部及其间隔区域.
2-3序列比较分析对UL3、UL32、UL33、UL34基因的编码区序列统计与比较分析见表1.
UL32和UL34基因的G+C含量较高,为73.
38%,H72.
77%,其密码子第三位置上G+C含量更是高达96.
82%和96.
95%.
密码子第一位置上G+C含量与基因编码区总G+C含量相近,而密码子第二位置上G+C含量则很低,为45%~52%.
PRVEa株UL33和UL34基因与Ka株核苷酸序列同源性较低,分别为96.
3%,96.
7%;其氨基酸序列同源性也很低,分别为95.
7%,94.
8%.
从PRV与疱疹病毒Ⅱ.
亚科其它成员BHV.
1、EHV.
4、HSV.
1、THV等L.
、UL32、UL33和UL34同源基因编码的氨基酸序列多重比对结果可以看出:比3基因同源程度最高,各毒株间同源程度均大于50.
2%.
UL34基因同源程度最低,其次为UL32基因.
PRV基因与EHV.
4同源程度最高,为61.
3%;而2、UL33和UL34基因均与BHV.
1同源程度最高.
PRV基因与EHV.
4同源程度最低,为42-4%;而、2和UL34基因均与THv同源程度最低,其中UL34基因与THV同源程度为34.
7%.
表l眦3,、UL32、眦、UL34基冈的编码区序列统汁与比较分析TablelStatisticalandcomparativeanalysisforthecodingsequencesofU,,UL32,UL33andU—L3—4—gen—esNote:(a):G+C,G+C1,G+C2andG+C3aretheguaninepluscytosine(G+Cjcontentsforallandeachofthethreecodonpositionsofthecodingsequences.
(b(c):representtheidentitiesofthenucleotideandaminoacidsequencesbetweenPRVEastrainandPRVKastrain(theaccessionnumberinGenBankdatabase:UL31andUL32genes,AJ319028:UL33andUL34genes,AJ276165),respectivelyfd1:representstheidentitiesoftheaminoacidsequencesbetweenPRVandotheralphaherpesviruses(theaccessionnumberinGenBankdatabase:BHV_1NC一001847;EHV.
4,NC一001844:HSV一1.
NC~001806:THV,NC一002641).
2-4蛋白质功能分析用OMIGA2.
0软件推测PRVEa株UL31基因编码的蛋白质分子量为30.
38kDa,等电点为8.
8,进行蛋白质Motif搜索发现2个CAMP磷酸化位点(cAMP—andcGMP—dependentproteinkinasephos·phorylationsite1,2个酪蛋白激酶2磷酸化位点fCaseinkinaseIIphosphorylationsite),3个蛋白激酶C磷酸化位点(ProteinkinaseCphosphorylationsite1,并在第4.
20氨基酸残基处发现核定位序列(Bipartitenucleartargetingsequence1.
UL32基因编码的蛋白质分子量为51.
75kDa,等电点为6.
5,氨基酸序列中有2个N.
糖基化位点(N-glycosylationsite),8个酪蛋白激酶2磷酸化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点.
UL33基因编码的蛋白质分子量为12.
89kDa,等电点为4.
9,氨基酸序列中有1个酪蛋白激酶2磷酸化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点.
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com兰,.
人病病毒Ea株基区I组UL的克隆与序列分析UL34基因编码的蛋白质分子量为28.
06kDa,等电点为9.
1,氨基酸序列中有1个N一糖基化位点,3个酪蛋白激酶2磷酸化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点.
2.
5同义密码子与氨基酸利用率从UL31、UL32、33、UL34基因的密码子使用表(见表2)中可以看出,富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是G或C的同义密码子利用率最高,譬如CCC、GCC、GCG、CGC、GGC、GTG等等.
氨基酸Ala、Leu、Arg的使用率最高,分别为15.
3%、11-2%、10.
0%,共占氨基酸总数的36.
4%.
另外,UL31、32、UL33、UL34四个基因各自的同义密码子和氨基酸利用率也基本相似.
农2』、UL32、UL33、UL34基因的密码子使用表ACodonUL31UL32UIj3UL34CodonUnlUn2UL33Un4LysAAAllOOLeuCTA0020AAG7922CTCl5l52l3AsnAAC3lO2nCTGl335l1l4AATOOlOC1vrOOOOThrACAOOOOTTAOOOOACC2j041vrG3lOlACG4l4I46GluGAAlOlOACTOlOOGAGl23O76SerAGC5426AsDGACl7289l4AGTOOOOGATlO2OTCAOOOOAr2AGA2OOOTCCO2O:3AGGOOOOTCG9jO11CGA3OOOTCTOOOOCGCl84l9l7TvrTACl3l'{24CGG6437TATl1OOCGTOOOlMetATG62lOGlvGGAlOOllieATA000l'GGClO2O7l6ATC4j28GGG51l25A1vrlOOOGGTOOOlGlnCAAOOOOValGTA0lOOCAG682lOGTC3647HjsCAC6l436GTG22215l2CATOOOOG1vrOlOOProCCA000lPheTTC82l3lOCCC9ll2l5TTTj72OCCG6lO26CvsTGC6l4l7CCTlOO1TGTOllOAlaGCAllOOTryTGGl6llGCCl6458l9StopTAAOOllGCGl842l28TAGOOOOGCTOOO1TGAllOO3丁伦最初我们根据PRVKa株,和UL34基因DNA序列分别设计了两对引物,并顺利扩增到UL31全基因,但在扩增UL34基因时遇剑困难,经不断摸索条件反复实验仍未扩增到特异性条带.
因此我们改以,基因上游引物和UL34基因下游引物为PCR引物,则扩增到全长3.
76kb的皋因组片段,经酶切鉴定及DNA测序证实该片段含仃完整的,、UL32、UL33、UL34基因完整编码区以及UL30和UL35基因部分序列.
分析测序结果发现基因附近G+C含量较高,并且4基因上游引物对应的核苷酸序列的第5个碱基由T突变为C,由于最初设计的引物只有17bp,故我们认为可能是由于引物的不完全配对与GC含量高导致单独扩增UL34全基因失败.
Cheung等1989年对PRVIE180基因碱基及氨基酸组成分析发现,IE180基因G+C含量高达维普资讯http://www.
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coml24中国病毒学第19卷80.
1%,偏向于使用富含G和C的密码子,Ala、Pro、Arg和Gly占氨基酸残基总数的53.
8%.
我们对PRVUL31、2、、UL34基因密码子及氨基酸使用进行统计分析,发现该四个基因G+C含量为69.
5%~73_4%,密码子使用偏性都很强,富含GC特别是第三密码子位置上核苷酸是C或G的同义密码子利用率最高,氨基酸Ala、Leu、Arg的使用率最高.
这种密码子使用的显著偏差现象表明,密码子偏爱性和氨基酸使用率可能是PRV基因组G+C含量高达73%以上的原因之一.
氨基酸序列分析发现UL31、UL32、UL33、UL34基因均有酪蛋白激酶2磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点,表明UL31、UL32、UL33、UL34蛋白质可能都是磷酸化蛋白质.
Reynolds(2002)lJUJ等报道HSV.
1UL31蛋白质和UL34蛋白质在核边缘的正确分布需要US3蛋白激酶的作用,并推测UL3l和UL34蛋白质可能是US3蛋白激酶的底物.
由于PRV中UL31和UL34蛋白质氨基酸序列中均含有多个蛋白激酶磷酸化位点,据此我们推测PRV中UL31和UL34蛋白质可能也是US3蛋白激酶的底物.
Fuchs(2002)J等研究已经证实PRV中UL31蛋白质是核基质相关的核磷酸化蛋白质,定位在感染细胞核内.
故我们认为UL31基因氨基酸序列中富含精氨酸的第4.
20氨基酸残基区域可能是潜在的核定位信号序列.
在同源性比较中我们还发现伪狂犬病病毒UL31基因与EHV.
4同源程度最高,而UL32、比和UL34基因与BHV.
1同源程度最高.
目前已知UL31基因在Ⅱ.
疱疹病毒亚科中高度保守,在p、Y一疱疹病毒亚科中也有同源基因…l;同时其他学者在研究中还发现PRV另外一些高度保守的基因,如UL23基因【】,也与EHV.
4同源程度最高;另外,c【.
疱疹病毒亚科中Orf/基因仅在PRV、EHV一1与EHV.
4中发现".
根据上述研究结果我们推测PRV可能与EHV.
4亲缘关系最近,不过这种推测还需大量的研究数据予以证实.
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