向日葵分子生物学研究进展刘杰莫结胜刘公社!
齐冬梅李芳芳(中国科学院植物研究所北京!
"""#$)摘要向日葵是一种营养价值极高的资源植物,向日葵的研究和生产在当前我国中西部大开发的战略中具有重要的意义.
本文对近年来国内外向日葵分子生物学研究的最新进展,在蛋白质、酶、基因及基因工程、分子标记等方面进行了综述.
特别对生化标记、分子标记技术在向日葵研究上的应用及所取得的成果作了重点介绍,并对今后向日葵研究工作进行了展望.
关键词向日葵,分子生物学,分子标记0.
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向日葵(5'6%E)是植物油脂和蛋白质的重要来源,在有效供给油脂和蛋白质、改善食物结构、促进养殖业和加工业发展等方面起重要作用.
向日葵不仅是世界重要油料作物,也是我国新疆、内蒙古、甘肃等北方省区的主要油料作物,在未来中西部大开发和种植结构调整过程中具有重要经济意义.
认识和改造向日葵种质资源,培育优良的杂交新品种,提高向日葵油的产量和质量,是改善食用油供应结构的主要手段.
目前,运用分子生物学方法和生物技术,特别是分子标记技术在5MJ水平上对向日葵进行深入的研究,认识向日葵与环境的相互作用,剖析其抗性机制,寻找其产量、品质与基因的对应关系等等,已成为当前向日葵生物学研究的热点.
随着生物技术的发展,向日葵分子水平上的研究也取得了许多新进展,本文对此作一综述,以资借鉴.
8蛋白质和酶的分析8E8种子蛋白!
联系人J/3DB3D;3DD*AG30@*0;*作者简介:刘杰,!
#N$年O月生,!
#PQ年毕业于河北农大园艺系,!
##O年获中科院理学博士学位.
现于中科院植物所工作.
至今已在国内外重要学术刊物上发表论文!
"余篇.
刘公社,!
#RP年生,!
#P!
年毕业于西北农学院,!
#PN年在法国获生物学博士学位,!
#PNS!
#PP年回国从事博士后研究工作,!
#P#年在中科院植物所工作至今.
现为中科院植物研究所研究员,研究方向为生物工程及其在持续农业上的应用,发表学术论文NN篇.
主编《向日葵研究与开发》、《北方农牧交错带可持续发展研究论文集》等.
收稿日期:Q"接受日期:Q"""-"T-QP责任编辑:程红焱植物学通报Q""!
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向日葵种子含有球蛋白、清蛋白、油脂体蛋白等丰富的蛋白质.
用十二烷基硫酸钠!
聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳(('))和双向电泳对多个向日葵栽培品种的种子蛋白进行分析表明,不同栽培品种的**"球蛋白、清蛋白和油脂体膜蛋白在多肽组成、分子量、电荷方面具有较大的相似性,育种手段和生长环境对贮存蛋白基因的表达没有明显的影响(+,-.
/01等,*22*).
*234年56789:;等人从向日葵种子中成功提取盐溶性球蛋白,从中检测出三种含有相似亚基的蛋白质组成分子;亚基组成的离子交换层析结果表明向日葵种子较大的贮存蛋白与植物豆球蛋白族里的豆球蛋白类似.
的同源性(B;::-等,向日葵向日葵自交系、杂交种的向日葵油质体蛋白的7#J%:!
"#$和!
"#%;这两个基因是在种子发育时发生转录的,!
"#%在种子成熟和油脂沉积时表达早于!
"#$.
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K"热激蛋白对植物热激蛋白新种类的进一步研究有助于更深地了解向日葵热逆境反应机制,并可明确植物细胞培养中分泌蛋白的作用.
向日葵悬浮培养细胞能够分泌热激蛋白:在4=L持续A小时的热激条件下,向日葵细胞合成新的多肽并分泌到基质中去,同时其他多肽的合成则受到抑制;大小约E=H#,和A向日葵具有较丰富的同功酶多态性,因而同功酶可以作为向日葵种质资源分析的依据.
利用同功酶标记可以鉴别基因型,辅助建立向日葵染色体图谱(QR6::;F等,*22向日葵品种的A=个类型的酯酶同功酶,认为向日葵品种内的群体间具有共同的特征带,但品种内的遗传基础较复杂,可把酯酶同功酶谱带作为一个可靠的依据整理地方品种.
"基因组研究从向日葵中分离得到的基因比玉米、大豆、烟草等其他作物少,已公开发表的#J%序列有向日葵叶绿体基因组与烟草、菠菜的叶绿体基因组非常相似(+6;C;N;GO和";6:;G,A向日葵的进化和系统发生.
!
$"与发育相关的基因人们已经发现向日葵的某些蛋白质直接参与控制器官组织的生长发育.
%&'()*和+,-.
*)(.
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""/)根据同源蛋白质的保守区设计引物,从向日葵根0123文库分离并鉴别了一个与器官组织生长发育有关的含有同源区的0123———!
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,并研究了相应4523的表达.
由!
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推出的氨基酸序列与蛋白质+637538表现出同源性;9*9:!
在干种子、下胚轴和根等植物生长的较早时期表达;在茎节中至少有一个相关基因表达.
9*9:!
可能和其他相关基因组成了一个基因家族.
和;*))((!
""/)对向日葵中含有亮氨酸拉链同源区的蛋白的相互作用进行了研究,分离确定了一个全长的0123克隆$"!
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%&'(和以前报道的$"!
%&'共表达时形成同源二聚体,两者拉链的*!
处和蛋白质(含有60结构域)是重要的真核发育调节因子,含有一个或几个双锌指结构.
向日葵花粉6=>蛋白中的A6=>!
的0123作为杂交探针,从向日葵多个器官的0123文库中分离了相关蛋白的编码序列.
其中B6=>!
与A6=>!
一样都含有两个6=>域.
使用5C@AD5技术在具有生活力可再生的器官中能够检测到B6=>!
的转录,抗体检测在这些组织里找到一个约E#F1的蛋白质.
通过免疫化学检测发现这个蛋白质广泛存在于各个器官的多种类型的细胞中,或位于核内,或位于细胞质中,或两处都有.
在来自于根、茎、子房的离体培养细胞的细胞分裂后期的末期和有丝分裂末期的早期,这个蛋白质表现出明显的积累,很有可能参与细胞分裂.
!
$!
抗性基因分析向日葵是一种适应性强的油料作物.
人们对向日葵的抗性有了比较充分的了解,已经分离到向日葵抗霜霉病基因和抗锈病基因.
霜霉病是在欧洲、北美以及拉丁美洲肆虐疯狂的一种作物病害,目前已发现的病原菌小种就有/种之多.
自!
"G#年以来,人们相继从不同的向日葵种质中分离到抗霜霉病基因()*基因),分别从H3IIE和H3IIJ中分离到)*+,从H3II/KII"中得到)*,,从5H3IL#获得)*-,这三个基因都抗前述/种病原菌(>))(:和+M)N*,!
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).
向日葵锈病在全球危害严重,自G#年代到"#年代,>))(:等(!
"GG)、OM:(&9和P*-(!
""8)和6*4Q:))(:(!
""L)相继从不同来源的向日葵谱系中分离得到分别对不同锈病小种具有抗性的多个基因.
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0、.
1.
不同基因之间的连锁关系,对育种工作者们很有帮助,对几个锈病小种的抗性可能较容易地转到一个简单基因型里.
向日葵最严重的病害是由核盘菌引起的菌核病,它可以侵染根、茎、叶和花盘等多个部位,引起腐烂,导致减产,降低油脂的含量及质量.
向日葵菌核病抗性已经明确是多基因控制的(;(*:和C,M:R())(,!
"GG;D*&'*-,等,!
""I),获得更多的具有复合抗性(可以抵御不同部位感染)并可稳定遗传的植株,是将抗性应用于大规模农田生产的第一步.
!
期刘杰等:向日葵分子生物学研究进展II!
基因工程向日葵是双子叶植物,可用根瘤农杆菌的!
"质粒进行基因转化.
早在#$%&年,'()*"等人用!
"质粒将菜豆的三个基因转入到向日葵冠瘿瘤中,其中胭脂碱合成酶的基因得到表达.
01/22.
/)(#$$3)用微注射法将质粒456转入向日葵自交系的可育胚珠内,最终获得了具有!
"#基因表达的植株及其后代.
杨立国和石太渊(#$$%)转导外源总456来创造农作物新种质,#$$3年以菊芋为供体,通过花粉管转导将其总456导入向日葵保持系77#%8中并观察其后代的表现,希望能把野生向日葵的抗病性或其它优良性状转移到栽培向日葵上,改良自交系的某些特性,选育出品质好抗性强的自交系,93和9&的接种鉴定结果显示4:3;&和4:37&两个系对霜霉病(向日葵的抗逆性状(主要是抗病虫害、抗旱、抗盐、耐热等)以提高工程植物的性能同时,也希望改良向日葵的品质,提高其油脂和蛋白质的含量、质量.
有人设想,如能将月见草的一种脱饱和酶基因转入向日葵中,以使后者将含量丰富的亚油酸转化为!
0亚麻酸,这一想法一旦成为现实,向日葵的身价将不可同日而语.
"分子标记技术在向日葵生物学研究中的应用456分子标记技术的应用是生物技术发展中最为显著的变化之一.
分子标记技术的产生突破了遗传学研究的瓶颈,与传统的遗传学研究方法相比,它具有不可比拟的优势,其应用也越来越广泛.
认识到生物个体大分子多态性可以作为标记始于#$%>年9=向日葵基因组研究中的应用日趋广泛,各式各样的分子标记如9=向日葵种质资源的研究乃至基因组、基因片段的分析,与遗传标记尤其是分子标记的研究和运用是密不可分的.
"#$限制性酶切片段长度多态性(%&'()细胞质雄性不育(D'@)使杂交向日葵高产成为可能,杂交种子的商业生产目前主要依赖于=/A2/)AK细胞质(=/A2/)AK,#$%L).
8)BM.
等(#$%N)对=/A2/)AKD'@系统进行分子研究,比较了可育系和不育系的线粒体456、叶绿体456和双链56,发现两者只是线粒体基因组的456的片段长度有所不同.
用9=向日葵雄性不育性进行遗传学分析的研究.
对3#种向日葵细胞质雄性不育(D'@)品系的线粒体基因组$%&'基因位点处456分子变异的研究表明,在$%&'基因位点区域有L种456序列存在于3#种细胞质雄性不育品系中;在向日葵D'@品系中即使细胞质来源相同,不育基因也有多种存在方式,细胞质雄性不育有多种机理(季静等,#$$%).
&L植物学通报#%卷有些向日葵对叶子和花盘上的核盘菌菌丝体延伸具有抗性,可以应用!
"#$标记和同工酶标记来协同研究与这种抗性有关的数量性状位点(%')等,-.
.
/),这些%'分别检测为种子重量、含油量和开花期,其多基因控制的基础得到确证.
向日葵对核盘菌的抗性具有复杂的本质,在栽培向日葵基因型中鉴定出与这种抗性有关的%'是可能的;若要使核盘菌抗性与其它优良农艺性状共选择,有必要继续检测更多的数量性状.
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"#$也可用来检测向日葵自交系系内和系间的变异(01234等,-.
.
5).
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"#微卫星也称简单序列重复,.
.
/)在某些情形下,微卫星序列在突变事件中扮演着关键的角色.
向日葵基因组中微卫星序列的出现有不同的方式和频率(6734等,-.
.
8),利用微卫星序列作为探针可以得到向日葵基因组的遗传指纹,既可用微卫星序列作为探针进行!
"#$分析,也可在微卫星位点附近的基因组序列直接扩增.
微卫星直接扩增给出微卫星位点周围的第一手信息;克隆其两侧的序列可研究单一微卫星在重复数上的变化;还可以在不同水平上研究减数分裂、有丝分裂的微卫星序列.
实践证明:用这种技术研究向日葵基因型的差异是行之有效的,微卫星遗传指纹可鉴别构建的体细胞杂交种,可给出向日葵属起源的遗传信息;现在这种方法已证明野生向日葵比栽培向日葵表现出更大的变异.
不同的微卫星主型((9*,:)在栽培向日葵的遗传起源分析中的作用是有差异的(;)1个不同的简单序列重复和-个(-重复序列作为杂交探针,在分子水平上检测两个德国自交系和北美已知谱系向日葵的起源关系,并确定独立的短的串联重复是否都适用于遗传分析,结果表明只有寡聚核苷酸(@A@)>、(A@&)>、(A@&@)5、(B@A@)8和(B@&@)8能产生可估测的指纹模式,其余的微卫星序列不是过多就是过少.
虽然不同的简单重复序列杂交表达出不同的多态性水平,但无论是CD个探针———酶组合还是各个独立的探针———8种不同限制性内切酶组合都表现出了德国材料与北美材料的明显分离.
!
"0随机扩增片段长度多态性(/123)使用!
@$;标记能够有效地进行比较遗传图谱的研究,!
@$;标记变异水平比其它分子标记高得多.
基因图谱可以揭示物种进化的不同模式,!
@$;标记的使用无疑对其构建大有裨益.
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,)')E)+4(-.
.
)在同工酶分析的辅助下,利用!
@$;标记对向日葵二倍体杂交种进行遗传作图.
从二倍体杂种FGH7**!
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"IJ2K))的5>个分离后代得到->-个!
@$;位点,辅以-个同工酶位点(@A$L),并依此绘成-/个连锁群,总遗传距离C/M向日葵的遗传多样性.
他们对澳大利亚种植的向日葵商业栽培种、繁殖系、野生向日葵品种、远缘种、六倍体O二倍体杂交种等进行分析,发现不同的基因型表现的多态性程度不同,驯化向日葵的遗传基础是非常广泛的.
(97P)Q2+等人(-.
.
5)建立了向日葵抗霜霉病基因/'0位点(抗霍尔斯单轴霉族-)的!
"#$和!
@$;图谱.
/'0位点定位在向日葵栽培种一致的!
"#$图谱的连锁群-上.
用霜霉-期刘杰等:向日葵分子生物学研究进展5病敏感系!
"和携带!
"#的#"$%%杂交,取&$代进行单株分析,鉴别出与'()连锁的$个#&*'标记和)个#+',标记.
这些标记的应用以及进一步的深入研究对于向日葵育种具有很高的实用价值.
-.
//012+(3.
45等人()667)对向日葵属中的若干个染色体组的证据进行了研究,用#+',技术分析了向日葵属中的8%个种及9个未明类别共四十个分类群.
他们发现,享有共同#+',片段的若干个种归于属中的同一派.
还有些片段普遍存在向日葵属的所有种中,这些片段的大多数大小一致,分子杂交表现出具有同源性;扩增产物的分子杂交揭示了向日葵属染色体组与"0(53:;向日葵属中的派的组成.
研究说明大小相同、享有较大同源性的#+',片段似乎是基因组定义的关键片段,因而搞清楚为什么#+',/在鉴别不同的基因组时比起其它分子标记更为有效也是比较重要的.
在,=+指纹技术(如#+',/)和其他相关技术中得到的大量的,=+带中,有一些共迁移带是非同源性的.
+>3/和#50/0@0AB()667)就#+',带的非同源性对相似性和多变量统计分类排列的影响作了探讨.
#+',分析可能会发生将错码、共迁移、非同源的,=+带当成同源带的错误,但向日葵数据组中的非同源性错误是随机的和极微量的.
他们对三个已确认共迁移带的向日葵种进行了分析,分别用两个数据组(分别包含原始的)CC条#+',带和已更正且证实同源性的)6C条#+',带)分析这三个向日葵种的相似性,比较得出这三个种之间的关系在这两组数据中几乎是等同的.
分子标记辅助选择在植物育种中表现出明显的优势,特别是使抗性基因释放到普遍的背景中而对植物病原产生持久抗性(*3D/.
:等,)667).
分子标记可以应用于向日葵抗性基因的选择.
自交系'$中的$%&'基因具有对大部分锈病病原的抗性,寻找到了与之相连锁的两个#+',标记EF$G%GG和EEG96HG,并且由这两个标记发展了-I+#标记-IF$G%GG和-IEG96HG.
$%&'基因的-I+#/标记在'$系的许多近相关系中都可扩增得到,这个基因位点正在进一步的研究中,它可能有助于在分子育种中选择产生对锈菌的持久抗性.
#+',/和大量单株分析为发展专一特性标记如-I+#/提供了一个非常有效的方法.
内含子可能是向日葵和其他作物植物高变异标记的来源.
硬脂酰基载体蛋白脱饱和酶-+,(/;03A.
1(23J1(J3AA50AKA.
;05:>0/3;4A3/0)使硬脂酸脱饱和形成油酸,".
:B;A3L4(等()667)对向日葵自交系发育种子中强表达的-+,进行分析,由J,=+克隆发展得到()*基因的,&*'、--I'和--#标记,大多数标记在八个向日葵自交系中表现出多态性.
来自自交系"+8CG和"+8C$的-+,内含子经测序发现长度及核酸序列有变化,内含子多态性造成了,&*'、--I'和--#的大部分多态性.
据国际向日葵协会发布的)66CM)667年国际向日葵年报登载,现许多科学家正在用分子标记技术辅助或者完善自己的研究(N/;0(3和I.
:O3(0O,)66C;I.
:O3(0O和P3((0,)66C).
澳大利亚的Q.
:B用传统技术和,=+指纹研究向日葵锈病病原类型的进化,用杂交法和分子标记、连锁图谱探索向日葵锈病抗性遗传学,以期发展抗锈病的种质.
在法国,+(5@20A;着眼于向日葵体细胞胚胎发生的细胞学和分子机制、栽培型和野生型向日葵的体细胞8%植物学通报)7卷杂交以及向日葵遗传工程;和)'*$用+,-.
、.
/+、+0.
1研究抗性基因,分析抗性产生和作用的机制;2"34'*3则主要关注向日葵基因多样性的研究与保护以及标记辅助育种……!
研究展望我国食用油市场缺口较大,亟待提高植物油的生产水平.
向日葵油质量高,而且向日葵适应性强,在地广人稀、经济相对落后的我国中西部地区,有着尤为远大的发展前景.
研究向日葵种质资源,可以为筛选优良品种或对其进行品质改良打下基础.
我国向日葵品种资源比较丰富,弥补国内向日葵分子标记研究的空白,运用分子标记技术为我国的向日葵生产事业作出贡献,是向日葵工作者义不容辞的责任.
作者所在的实验室,已经尝试着用+0.
1方法对部分中国食用葵品种及国内外油用葵的遗传多样性进行分析,大部分引物能够产生稳定的具有丰富多态性的+0.
1标记,有的引物在两者之间没有表现出差异,有的引物则明显地表现出中国食用葵品种和国外油用葵的不同,+0.
1可以作为向日葵种质资源分析的工具.
我们打算在现有基础上运用大量引物对向日葵品种进行聚类分析,研究其起源进化中出现的变异,寻找不同性状不同功能的优势基因群的所在.
本实验室也已经在向日葵杂交种种子纯度鉴定方面作了部分工作,实验结果表明用+0.
1进行这一工作是可行的(莫结胜等,待发表).
分子标记技术在向日葵种质资源研究领域是大有可为的,例如应用+0.
1、55+等技术寻找抗性基因标记,为向日葵抗性育种开辟新方法;用+0.
1提高现有的向日葵+,-.
图谱的标记密度,构建高密度标记的遗传图谱;此外,还设想综合运用多种分子标记技术对向日葵主要栽培种进行系统学研究,为未来的育种工作提供基础材料和新技术手段.
近年来,国际上向日葵研究在农艺、繁育、病理、生理和技术等方面不断取得进展,如美国和法国的科学家们一直致力于商业杂交种的培育,旨在提高含油率,增加产量;同时发展新技术,提高对生物和非生物病害的抗性而简化操作,降低成本.
国际同行们在向日葵生物学尤其是分子生物学和生物技术方面的工作和成就不胜枚举,相比之下,国内研究工作相对薄弱,急需加强这方面的研究,此外研究工作应当在实用性以及深度上发展.
参考文献刘公社60(*&32"34'*36彭克敬67889:向日葵研究与开发:北京;中国科学技术出版社刘公社6赵泓6刘杰6788;@ABA>杨立国6石太渊6788向日葵地方品种酯酶同工酶研究:中国油料作物科学技术新进展:北京;中国农业科技出版社6DA7BDAD季静6王罡6E:5'$&$FG6788向日葵细胞质雄性不育系线粒体基因组*HI0位点的研究:遗传学报6#!
=96J@ABJA90K*LG+.
6+&'G'M'$N-E6788JBJ>@03&G&L"%*SC6,&K"+T6!
*HO*L506788D:U'3"HFI&Q%*$&*H&"3*3KI"(FL"$IO&GL"P>G*(%#L&3G"PG#3P("V'$:5-2,6+%&';7DB>J2$"V3UU62#GG'FE61'G+"G&'$G-T6787B7>8/*GH*3",6)'*$,61-6788J:+'G&GH*3Q'"PG#3P("V'$&3M$'K(&3'GH"%*$&"#GP"$LG"P*HH*QWMF5Q('$"H&3&*GQ('$"H&"$#L*3K$'(*H&"3GV&HOG"L'L"$IO"("N&Q*(QO*$*QH'$G:5-2,6+%(&;)$8&/>#6@)#A'(>B&6B(7/>$,'#C/"0#'#(%1++!
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#COF4U4期刘杰等:向日葵分子生物学研究进展N5
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