染色体向日葵

中国细胞生物学学报ChineseJournalofCellBiology2014,36(2):195–199DOI:10.
11844/cjcb.
2014.
02.
0302收稿日期:2013-09-17接受日期:2013-11-12国家向日葵现代产业技术体系项目(批准号:CARS-16)资助的课题*通讯作者.
Tel:0471-5294388,E-mail:nkyanyulin@163.
comReceived:September17,2013Accepted:November12,2013ThisworkwassupportedbytheNationalModernIndustryTechnologySystemofSunflower(GrantNo.
CARS-16)*Correspondingauthor.
Tel:+86-471-5294388,E-mail:nkyanyulin@163.
com网络出版时间:2014-01-1715:14URL:http://www.
cnki.
net/kcms/doi/10.
11844/cjcb.
2014.
02.
0302.
html向日葵rRNA基因克隆及其染色体定位研究高猛1,2安玉麟1*孙瑞芬1张艳芳1(1内蒙古农牧业科学院生物技术研究中心,呼和浩特010031;2内蒙古农业大学农学院,呼和浩特010019)摘要该研究以内葵杂3号三交种为材料,采用同源序列法克隆了5SrRNA和18SrRNA基因并进行了序列测定,测得片段长度分别为515bp和1808bp.
以5SrRNA、18SrRNA和45SrRNA基因为探针,分别与内葵杂3号三交种染色体进行荧光原位杂交(FISH)分析.
结果表明:45SrRNA和18SrRNA基因均得到3对杂交信号且位点分布相同,分别位于第3对和第10对染色体及第2对随体染色体的短臂末端;5SrRNA基因的信号位点共有2对,分布在第7对和第10对染色体短臂端部.
关键词向日葵;染色体;rRNA基因;荧光原位杂交(FISH)CloningandPhysicalMappingofrRNAonMetaphaseChromosomesinSunflower(HelianthusannuusL.
)GaoMeng1,2,AnYulin1*,SunRuifen1,ZhangYanfang1(1BiotechnologyResearchCenter,InnerMongoliaAcademyofAgricultureandAnimalHusbandrySciences,Huhhot010031,China;2CollegeofAgronomy,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Huhhot010019,China)AbstractInthispaper,5SrRNAand18SrRNAgenefragmentswereclonedfromthetriplehybridof"InnerMongoliaHibridoilsunflower3"andtheirsequenceswereanalysed.
Thelengthsof5SrRNAand18SrRNAgenefragmentswere515bpand1808bp,respectively.
Influorescenceinsituhybridization,theprobesfor5SrRNA,18SrRNAand45SrRNAwerehybridizedwithsunflowergenomicDNAfromthetriplehybridof"InnerMongoliaHibridoilsunflower3".
Threepairsofhybridizationsignalsweredetectedatthesamelocibothwith45SrRNAand18SrRNAprobes:attheendofshotarmsofchromosomepairs3,10andsatellitechromosomepairs2.
45SrRNAprobeshowedthesameintensityofhybridizationsignals.
5SrRNAshowedtwopairssignalsattheendoftheshortarmsofchromosomepairs7and10.
Keywordssunflower;chromosome;rRNAgene;fluorescenceinsituhybridization(FISH)核糖体是蛋白质生物合成的场所,核糖体由大、小两个亚基组成,主要成分为核糖体RNA(rRNA)和蛋白质.
真核生物的rRNA有4种类型,即18SrRNA、5.
8SrRNA、28SrRNA和5SrRNA.
18SrRNA序列位于小亚基40S上,其他3种位于大亚基60S上.
核糖体rRNA的编码基因主要分布在细胞核内的染色体上,不过也有极少数分布在叶绿体和线粒体中.
编码这几种rRNA的基因有两种,一种为45SrDNA,另一种为5SrDNA.
其中,45SrDNA是高度串联重复序列,它位于核仁组织区(NORs)[1],具有NORs的染色体称为随体染色体,在有丝分裂的中期细胞学形态表现为染色体的次缢痕[2].
每个45SrDNA重复单位依次编码5.
8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA,而5SrDNA虽然也是串联重复序列,但其并不位于核仁组织区上[3],每个重复单位编码5SrRNA.
荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是一项分子生物学与细胞学相结合的技术,目前在植物研究中的应用非常广泛.
它是用特异性的核酸重复序列作为探针,用一定方法将其进行荧光标196·研究论文·记,然后与被测目标进行杂交,通过荧光显微镜可以观察到特异的荧光信号,从而对其进行分析处理.
目前,荧光原位杂交技术广泛应用在核糖体重复序列的染色体定位研究中.
通过rDNA在染色体上的定位,能够识别形态相近的染色体和核型相近的物种[4-5];根据rDNA位点数目和位置的变化,可以揭示染色体结构的变异,分析物种亲缘关系、多倍体物种之间的系统发育关系及基因进化[6-7]等.
向日葵是世界上重要的油料作物,目前向日葵的全基因组序列还没有报道,国内外有关向日葵染色体方面的研究主要集中在核型分析上.
近年来,利用FISH技术已将5SrDNA、18SrDNA、45SrDNA分别定位在玉米[8]、大麦[9]、小麦[10]、棉花[11]等多种植物的染色体上.
在向日葵染色体上的定位国外已有报道[12-15],而国内迄今未见报道.
本文以向日葵内葵杂3号三交种为研究材料,通过同源序列法克隆了18SrRNA和5SrRNA基因,这一结果将有利于增进对向日葵属植物重复序列基因结构的认识;采用FISH技术将克隆的5SrDNA、18SrDNA和水稻45SrDNA定位在染色体上并对其位点分布进行分析,建立了一套向日葵染色体荧光原位杂交的技术方法,同时该研究结果为探讨向日葵染色体进化及种间亲缘关系和进化模式等提供了依据,并对指导杂交种育种实践和新品质创新具有重要意义.
1材料与方法1.
1材料1.
1.
1实验材料供试材料内葵杂3号三交种,由内蒙古农牧业科学院向日葵课题组提供;含有水稻45SrRNA序列的质粒由南京农业大学细胞遗传研究所王秀娥教授馈赠.
1.
1.
2主要试剂植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DL2000Marker、感受态细胞TOP10购自北京天为时代科技有限公司;EcoRI、pGEM-TeasyvecterKit购自Promega公司;2*TaqMasterMix购自南京博尔迪公司;硫酸葡聚糖(DS)、鲑鱼精DNA(ssDNA)、去离子甲酰胺(dFA)、甲酰胺(FA)购自Amresco公司;碘化丙啶(PI)购自Sigma公司;抗荧光衰减封片剂购自广州外显子生物公司;NickTranslationKit、Fluorescein-12-dUTP购自Roche公司;其他均为国产分析纯试剂.
1.
1.
3引物根据水稻18SrRNA和5SrRNA基因序列设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.
序列如下:18SrRNA引物1:5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′,引物2:5′-GTAGGTGAACCTGCAGAAGGATCA-3′;5SrRNA引物1:5′-GATCCCATCAGAACTCCGAAG-3′,引物2:5′-ATACCAGCACTAAATCACCG-3′.
1.
2方法1.
2.
118SrRNA与5SrRNA基因的克隆及序列分析用植物基因组DNA提取试剂盒提取向日葵基因组DNA,并以其为模板PCR扩增18SrRNA和5SrRNA片段.
扩增产物经1.
0%琼脂糖凝胶电泳检测,并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化目的片段.
通过T4DNA连接酶将目的片段连接到T载体上,用连接产物转化E.
coliTOP10,在添加X-gal、IPTG、Amp的LB培养基上筛选阳性克隆,并进行PCR检测和酶切鉴定.
将检测合格的阳性克隆各5个送上海生物工程公司测序,测得序列通过DNAMAN软件的MultipleSequenceAligment程序进行序列分析,确定的序列再通过NCBI数据库进行Blast比对分析.
1.
2.
2染色体荧光原位杂交(FISH)按照闫素丽等[16]的方法制作染色体制片.
以含有45SrRNA、18SrRNA和5SrRNA序列的克隆为模板,按照NickTranslationKit说明书采用缺刻平移法进行探针标记,并将标记好的探针与杂交液混匀后,100°C变性10min,立即置于冰上10min.
同时,将脱水气干后的制片在76°C~78°C的70%FA中变性70s,之后立即置于–20°C预冷的70%、95%、100%乙醇中各5min,气干.
每张制片均匀滴加含有探针的杂交液30μL,盖上盖玻片,放在垫有湿滤纸的密闭盒子中,37°C避光杂交过夜.
次日揭去制片的盖玻片,用2*SSC洗片2次,每次10min;50%FA洗片1次,每次5min;2*SSC洗片2次,每次5min;以上洗片均在42°C下进行;最后用1*PBS常温下洗片2次,每次5min.
洗片过程中轻轻晃动制片,确保洗片充分.
制片清洗后晾干,取1.
2μLPI母液(100μg/mL)稀释于1mL1*PBS中,混匀后每个制片上滴加500μL,染色1~2min,1*PBS冲洗数次后晾干.
在制片上滴加10μL抗荧光衰减封片剂,封片后进行信号检测.
以上过程均应避光操作.
2结果2.
118SrRNA与5SrRNA基因的序列分析从内葵杂3号三交种克隆的18SrRNA和5S高猛等:向日葵rRNA基因克隆及其染色体定位研究197rRNA基因片段(图1~图3),测得序列长度分别为1808bp和515bp,序列经BLAST分析表明,1808bp序列与GenBank中公布的向日葵18SrRNA基因序列(AF107577)同源性达99%;515bp序列与已公布的向日葵5SrRNA基因序列(DQ865267)同源性达94%.
除此之外,2个rRNA基因序列与多种植物的18SrRNA和5SrRNA基因的序列也有很高的相似性,如1808bp序列与白术粳稻(Atractylodesjaponica)和非洲菊(Gerberajamesonii)的18SrRNA基因序列(EU678363,AF107576)相似性均达99%;515bp序列与桉树(Eucalyptuspreissiana)的5SrRNA基因部分序列相似性达94%(U10652.
1|EPU10652),与辣椒(Capsicumbaccatum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、维尼亚豇豆(Vignaunguiculata)和番茄(L.
esculentum)的5SrRNA基因序列(AF217951,Y16655,AF141141和X55697)相似性分别达95%、97%、92%和98%,说明克隆的内葵杂3号三交种的18SrRNA和5SrRNA基因片段,可以用来进行FISH研究,2个序列已提交NCBI并注册,登录号分别为HM638219和HM638217.
以上比对分析证明了18SrRNA和5SrRNA基因序列在物种间的高度保守性.
2.
2染色体荧光原位杂交分析2.
2.
15SrRNA位点分布在内葵杂3号三交种染色体上,观察到两对5SrRNA杂交信号,分别位于第7对同源染色体和第10对同源染色体上,其中第7对染色体上的信号较强,第10对染色体上的信号较弱,而且这几个位点都位于染色体的短臂近端部(图4).
信号强弱与5SrRNA的拷贝数多少有关,说明5SrRNA在不同的染色体上的拷贝数不同.
2.
2.
218SrRNA位点分布在内葵杂3号三交种染色体上,检测到3对清晰可见的18SrRNA杂交信号,分别位于第3对、第10对同源染色体以及第2对随体染色体的短臂末端,其中第3对和第10对染色体上的信号较强,第2对染色体上的信号较弱,但第2对染色体上的信号将整个随体包围(图5).
同样,信号的强弱反映出18SrRNA的拷贝数不同.
M:DL2000marker.
图118SrRNA和5SrRNA基因的PCR扩增Fig.
1Amplicationof18SrRNAand5SrRNAgenesM18S18SM5S5S20001000500750bpbpM:DL2000marker;1,2:18SrRNA;3,4:5SrRNA.
图2重组质粒的PCR检测Fig.
2PCRamplicationof18SrRNAand5SrRNAfromrecombinantplasmids20001000750500M1234bpM:λDNA/HindIIImarker;1、2:18SrRNA重组质粒;3、4:5SrRNA重组质粒.
M:λDNA/HindIIImarker;1,2:18SrRNArecombinantplasmiddigestedwithEcoRI;3,4:5SrRNArecombinantplasmiddigestedwithEcoRI.
图3重组质粒的酶切鉴定Fig.
3Resroctionenzymedigestionofrecombinantplasmids23222027564M1234bp198·研究论文·2.
2.
345SrRNA位点分布45SrRNA在内葵杂3号三交种染色体上的位点数及分布与18SrRNA的位点数及分布一致,同样有3对位点,分别位于第2对、第3对以及第10对同源染色体上的短臂末端,不同的是3对信号强弱基本一致(图6),说明45SrRNA在3对同源染色体上的拷贝数差别不大.
由于染色体制片清晰度欠佳,致使第2对染色体上的随体显示不明显,不过由于向日葵染色体上的随体本身很小、呈圆点状,因而可以推断第2对染色体上的整个随体也被信号所包围.
3讨论真核生物中,5.
8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA组成一个转录元,产生45S的前体RNA,因此18SrDNA的位点分布也反映了45SrDNA的位点.
5SrDNA和45SrDNA是独立存在的,通常分布在不同的染色体上.
研究表明,在多种植物中,通过FISH将45SrDNA(或18SrDNA)定位在中期染色体的次缢痕处,与随体相连,45SrDNA在次缢痕处的位置实际上还包括随体,甚至信号能将随体包围[17].
Ceccarelli等[12]对向日葵自交系HA89进行了rDNA的FISH分析,得到了4对45SrDNA杂交信号分别位于染色体短臂的末端,其中3对信号分别与3对随体染色体的次缢痕有关,另外1对不在随体染色体上,与Schrader等[13]和Vanzela等[14]的研究结果基本一致.
他的研究还表明,这4对杂交信号中3对随体染色体上的杂交信号较强,另外1对信号较弱,而Schrader等[13]发现这4对信号中2对信号较强,2对信号较弱.
Cuellar等[15]同样对相同向日葵品种进行研究,结果只在有随体的3对染色体上出现了45SrDNA的杂交信号,这可能与实验中信号显示的分辨率有关.
对于5SrDNA的定位分析前人的研究结果比较一致,Schrader等[13]和Cuellar等[15]的实验结果发现,5SrDNA的杂交信号出现在2对染色体的短臂末端,1对较强,1对较弱,其中1对信号出现在随体染色体上与45SrDNA的位置接近.
本文中,实验材料内葵杂3号三交种的染色体数为2n=34,第2对染色体为随体染色体[16].
该实验结果显示出3对18SrDNA和45SrDNA杂交信号及2对5SrDNA杂交信号.
18SrDNA和45SrDNA位点分布一致,不同的是,18SrDNA的3对信号中2对较强1对较弱,45SrDNA的3对信号强弱基本一致;2对5SrDNA信号中有1对与45SrDNA和18SrDNA定位在同一对染色体的短臂末端.
具有随体的染色体有18SrDNA和45SrDNA的杂交信号,与前人研究结果基本一致,随体染色体上没有5SrRNA的信号.
一般来说,45SrRNA基因的位点数与随体的数目是相等的,但我们的实验结果中该基因除了出现在随体上这一位图45SrRNA基因的定位Fig.
4Locationof5SrRNAgeneintriplehybridsunower图518SrRNA基因的定位Fig.
5Locationof18SrRNAgeneintriplehybridsunower图645SrRNA基因的定位Fig.
6Locationof45SrRNAgeneintriplehybridsunower1071073221010322101033高猛等:向日葵rRNA基因克隆及其染色体定位研究199置外,在其他染色体上也有.
类似现象除了在向日葵HA89中存在外[12],在多种植物如小麦[18]、油菜[19]、大麦[20]等中也有.
我们的结果还显示出5SrRNA和45SrRNA的位点出现在同一对染色体上的现象,在向日葵其他品系中也存在[13,15].
一般在真核生物的基因组中,5SrDNA和45SrDNA是独立存在的,分布在不同的染色体上,但是也有很多物种出现了两者处于相同的染色体上的现象.
Lim(LimKB.
Intergressionbreedingthroughinter-specificpolyploidisationinlily:Amolecularcyto-geneticstudy.
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D.
thesis,2000)研究发现,麝香百合(Liliumlongiflorum)和百合属另一种植物Liliumrubellum中的两种核糖体rDNA同时定位在4、7号和2、4号染色体的相同位置上,在麦类中也存在两者出现在同一染色体上的现象[21].
以上说明,不同物种间的核糖体rDNA之间的关联性存在很大的差异,通过这一现象可以区别不同的物种和进一步研究核糖体基因重复序列的关系.
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