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分子生物学实验指导第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则二、实验室安全防护第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化二、聚合酶链反应技术三、分子杂交技术四、分子克隆技术五、其它新技术第三节、常用仪器使用一、离心机二、分光光度计三、PCR仪第四节、如何撰写实验报告第五节核酸分离纯化技术实验一、基因组DNA的提取制备与检测实验二、总RNA的提取制备与检测实验三、质粒DNA的提取制备与检测第六节PCR技术实验四、常规PCR技术实验五、定量PCR技术第七节分子克隆技术实验六、DNA的限制性酶切与电泳实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收实验八、DNA连接实验实验九、感受态细胞的制备实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选第八节分子杂交技术实验十一、Southern印迹杂交实验十二、Northern印迹杂交实验十三、Western印迹实验十四、核酸原位杂交第九节综合性实验实验十五、蛋白质双向电泳实验十六、酵母双杂交实验实验十七、RNA干扰实验第一节、实验室规则及安全防护一、实验室规则1.
每个同学都应该自觉遵守课堂纪律,维护课堂秩序,不迟到,不早退,不大声谈笑.
2.
实验前认真预习实验内容,熟悉本次实验的目的,基本原理,操作步骤,懂得每一步操作的意义和了解所用仪器的使用方法,否则不能开始实验.
3.
实验时要听从指导老师的指导,严格认真地按规程进行实验,并注意与同组同学的配合.
未经许可,不得乱动实验装置、仪器以及电器设备等.
4.
实验数据和现象应随时记录在专用的实验记录本上.
实验结束时,实验记录必须送指导老师审阅后方可离开实验室;实验报告应该当堂完成或在下次实验开始前交给指导老师.
5.
保持台面、地面、水槽内及室内整洁.
精心爱护各种仪器,要随时保持仪器的清洁.
如发生故障,应立即停止使用并报告指导老师.
完成实验后应将器材洗净,把器材、药品归放回原处,试管倒置于试管架中并排列整齐.
按规定处理好废物,废液,做好清洁卫生.
器材、仪器如有损坏须立即报告指导老师并按学校规定进行适当比例赔偿.

6.
按需要量取药品及蒸馏水等各种物品,注意节约.
7.
公用仪器,药品用后放回原处.
多取的药品不得重新倒入原试剂瓶内.
公用试剂瓶的瓶塞要随开随盖,不得混淆,更不能互相污染.
严禁用口吸或用皮肤接触有毒药品与试剂.
8.
需交指导老师保存的样品,药品及其他物品都应加盖,并标注自己的姓名,班级,日期及内容物.
9.
废液体可倒入水槽内,同时放水冲走.
含强酸,碱及有毒废液应倒入废液缸.
废纸屑及其它固体废物和带渣滓的废物倒入废品篓或废品缸中,不能倒入水槽或到处乱扔.
书包及实验不需之物品放在规定处.

10.
实验室内严禁吸烟!
不得将含易燃溶剂的溶液近火.
对电炉等火源,严格做到:人在火在,人走火灭.
乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热,并要远离火源操作和放置.
实验完毕,应立即拔去电炉插头和关好水龙头,拉下电闸.
漏电的设备一律不得使用.
离开实验室前应该检查水、电、窗等是否关好.

11.
实验室内一切物品,未经教师批准,严禁带出室外.
12.
每次实验课由班长或课代表负责安排值日生.
值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和其它服务性工作.
二、实验室安全防护实验室是学校教学的重要科学基地,贮存有贵重的仪器和化学危险药品等.
为防止损失和产生事故,必须做好防盗、防火、防水、防毒和安全用电等工作.
(一)防盗1.
加强防卫,经常检查,堵塞漏洞.
2.
非工作人员不得进入仪器室,室内无人时随即关好门窗.
3.
仪器室内不会客,不住宿,未经领导同意,谢绝参观.
4.
发生盗窃案件时,保护好现场,及时向领导、治安部门报告.
(二)防火、防爆1.
严禁在仪器室内生火取暖.
2.
易燃、易爆的化学药品要妥善分开保管,应按药品的性能,分别做好贮藏工作,注意安全.
3.
做化学实验时要严格按照操作规程进行,谨防失火、爆炸等事故发生.
(三)防水1.
实验室的上、下水道必须保持通畅.
2.
冬季做好水管的保暖和放空工作,要防止水管受冻爆裂酿成水患.
(四)防毒1.
实验室必须做好防毒工作,有毒物质应妥善保管和贮藏,实验后的有毒残液要妥善处理.
2.
凡易燃、易毒、腐蚀剂等危险性药品要设专柜单独存放.
要定期检查,严格管理,做到双人管理、双人收发、双人领取、双人记帐、双人把锁.
3.
实验中严格遵守操作规程,制作有毒气体要在通风橱内进行,保持实验室内通风良好.
4.
化学实验室备有废液缸,实验室附近有废液处理池,防止有毒物质随意排放.
(五)安全用电1.
实验室电路及用电设施要定期检修,保证安全,决不"带病"工作.
2.
如有电器失火,应立即切断电源,用沙子或灭火器扑灭.
在未切断电源前,切忌用水或泡沫灭火机灭火.
3.
遇有人身触电事故,应立即切断电源,及时进入人工呼吸,急送医院救治.
第二节、分子生物学常用研究技术一、核酸分离纯化核酸分子是分子生物学技术所涉及的主要对象,核酸分离纯化的质量好坏直接关系到后续实验的成败,所以核酸的分离提取是分子生物学研究中的一项重要的基本技术.
核酸包括DNA和RNA两种分子,在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在.
真核生物的DNA包括染色体DNA与细胞器DNA,前者位于核内,约占95%,分子量大,是双链线性分子;后者位于线粒体或叶绿体,约占5%,分子量较小,为双链环状分子.
原核生物除了双链环状的染色体DNA外,还有双链环状的质粒DNA.
在DNA病毒颗粒中,DNA的分子构型多种多样,有双链环状、双链线状、单链环状、单链线状等形式.
在RNA病毒中,RNA的分子构型有双链线状和单链线状的差异.
基因组DNA的总长度在不同的生物之间差异很大,一般随生物的进化程度而增大.
与DNA相比,RNA要小的多,它的种类、大小和结构具有多样化,主要存在于细胞质中,约占75%,另有10%在细胞核内,15%在细胞器中,RNA以rRNA的数量最多(80%~85%),tRNA及核内小分子RNA占10%~15%,而mRNA分子大小不一,序列各异.
DNA在碱性条件下相对稳定,而RNA在酸性条件下相对稳定,但强酸、强碱均可导致两者的变性与降解.
DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的分离与纯化条件是不同的.

分子生物学实验中最经常进行的是基因组DNA、质粒DNA以及细胞总RNA的分离提取.
真核细胞基因组DNA分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒缠绕法等;质粒DNA分离提取的方法有碱裂解法、煮沸裂解法及SDS裂解法等.
总RNA的提取方法主要是最常用的异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法.
另外,近年来世界各大商业公司也纷纷投入巨资开发新的更为简便的核酸分离纯化试剂盒,从而使核酸的分离纯化更为方便、快捷、高效和自动化.

尽管核酸分离纯化的方法很多,但无论采取何种方法,其基本原则均为:①保证核酸一级结构的完整性,因为完整的一级结构是进行核酸结构与功能研究的基本前提;②排除其它分子的污染,保证核酸制品的纯度,以满足后续实验的要求.
因此,核酸分离纯化的基本步骤,无外乎破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其它不需要的核酸分子,沉淀核酸,去除盐类,有机溶剂等杂质,纯化核酸等.
不同的核酸分离纯化方法分别具有不同的特点及适用范围,因此,在实际应用中,应根据具体生物材料、待提取的核酸分子的特点和研究目的对核酸完整性、纯度、产量的要求而选择不同的方法.

二、聚合酶链反应技术聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)技术,是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术,应用这一技术可以将特定的微量靶DNA片断于数小时内扩增至十万乃至百万倍.
PCR技术的创立对于分子生物学的发展具有不可估量的价值,它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法,极大的推动了分子生物学学科本身以及整个生物医学的发展.
PCR技术当之无愧是生物医学领域中的一项革命性技术创举和里程碑.
PCR技术由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的K.

Mullis等于二十世纪八十年代中期发明创立,K.
Mullis也因此贡献而获得了1993年度的诺贝尔化学奖.
PCR技术的基本原理类似于DNA的体内复制过程,即以拟扩增的DNA分子为模板、以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的寡核苷酸片断为引物、以四种dNTP为原料、由DNA聚合酶按照半保留复制的机制沿着模板链延伸而合成新的DNA,不断重复这一过程,即可使目的DNA分子得到扩增.
PCR反应体系的基本成分包括有:模板DNA、引物、四种dNTP、耐热性DNA聚合酶以及含有mg2+的缓冲液.
PCR的基本反应步骤包括变性、退火和延伸三个基本反应:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链变性解离成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,将反应体系的温度下降至适宜温度,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:与DNA模板结合的引物在DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的新链.
上述三个步骤称为一个循环,新合成的DNA分子继续作为下一轮反应的模板,经多次循环(25次~40次),即可达到扩增DNA片断的目的.
近年来,随着分子生物学的快速发展,PCR技术本身也不断发展,操作也更为精细和自动化,如高保真PCR、热启动PCR、长距离PCR、巢式PCR和梯度PCR技术的出现.
同时,PCR技术也和已有其它分子生物学技术结合,进而形成多种PCR衍生技术.

常见的PCR衍生技术有:1.
逆转录PCR,或者称反转录PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR),是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术.
即首先以RNA为模板,在反转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因.
该技术目前已经成为基因定性和定量分析的最常用技术之一.

2.
原位PCR(insituPCR),该技术是在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应,然后用特异性探针进行原位杂交,即可检测出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在.
该技术由Hasse等于1990年建立,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.

3.
实时定量PCR(realtimequantitativePCR)技术,该技术是在20世纪90年代末期发展起来的一种全新技术,它将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起,通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时检测PCR反应进行的情况,因为反应管内的荧光信号强度到达设定阈值所经历的循环数(即Ct值)与扩增的起始模板量存在线性对数关系,所以可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和/或相对定量.
而常规的PCR技术只能对PCR扩增的终产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量,也无法对扩增反应实时监测.
作为一种新型的PCR技术,实时定量PCR技术不仅解决了传统PCR技术难以对扩增起始模板的量进行测定的难题,并具有快速、灵敏度高和避免交叉污染等特点,已经广泛应用于基础研究中基因表达水平的分析和临床实践中基因诊断等领域.

三、分子杂交技术分子杂交(molecularHybridazytion)技术是目前生物医学研究中最为常用的基本分子生物学技术之一.
分子杂交技术最早可追溯至二十世纪六十年代Hall和Bolton等人的开拓性工作,但直到二十世纪七十年代,随着限制性内切酶、核酸自动合成的发展和应用,一系列成熟的分子杂交技术才得以建立完善和广泛应用.

分子杂交技术可按作用环境大致分为液相杂交和固相杂交两种类型.
液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,是一种最早建立的杂交类型,其主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难,同时误差较高且操作繁琐复杂,因此其应用较少.
固相杂交是将参加反应的核酸等分子首先固定在硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等固体支持物上,然后再进行杂交反应,也称为膜上印迹杂交.
固相杂交后,未杂交的游离探针片段可容易地漂洗除去,同时还具有操作简便、重复性好等优点,故该法最为常用.
固相杂交技术按照操作方法不同可分为:原位杂交(insituhybridization)、印迹杂交(blottinghybridization)、斑点杂交(Dotblotting)和反向杂交等.
其中原位杂交包括有菌落原位杂交(Colonyinsituhybridization)和组织原位杂交(Tissueinsituhybridization)等方法,印迹杂交则包括有Southern印迹杂交、Northern印迹杂交和Western印迹杂交等方法.
菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA.
将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位.

组织原位杂交简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同.
菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA,然后进行杂交.
而组织原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交.
因此组织原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义.
例如,对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示特定的序列的位置;对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布;与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布.
此外,原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术.

Southern印迹杂交技术是由E.
MSouthern于1975年建立的,故称为Southern杂交.
其基本原理和方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后变性处理后将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜等固相载体上,烘干固定后与标记的核酸探针进行杂交,最后通过放射自显影等方法显示杂交信号,从而可以确定被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度.
作为分子生物学的经典实验方法,该项技术已经被广泛应用于生物医学基础研究、遗传病检测、DNA指纹分析等临床诊断工作中.

继分析DNA的Southern杂交方法出现后,1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术,科学家们则将这种RNA印迹杂交方法趣称为Northern杂交,而后来的与此原理相似的蛋白质印迹杂交方法则也相应地趣称为Western杂交.

与Southern杂交相似,Northern印迹杂交也采用琼脂糖凝胶电泳,将分子量大小不同的RNA分离开来,随后将其原位转移至固相支持物(如尼龙膜、硝酸纤维膜等)上,再用放射性(或非放射性)标记的DNA或RNA探针,依据其同源性进行杂交,最后进行放射自显影(或化学显影),以目标RNA所在位置表示其分子量的大小,而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量(即目标RNA的丰度).
但与Southern杂交不同的是,总RNA不需要进行酶切,即是以各个RNA分子的形式存在,可直接应用于电泳;此外,由于碱性溶液可使RNA水解,因此不进行碱变性,而是采用甲醛等进行变性电泳.
Northern杂交技术自出现以来,已得到广泛应用,成为分析mRNA最为常用的经典方法,用于检测目的基因的表达水平和分子量大小.

Western免疫印迹是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.
与Southern或Northern杂交方法类似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,"探针"是抗体,"显色"用标记的二抗.
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变.
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白.
作为分子生物学的经典实验方法,该技术已经被广泛应用于检测蛋白水平的表达.

斑点杂交是先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交.
该法的特点是耗时短,操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可做半定量分析,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂交的结果,可以推算出杂交阳性的拷贝数.
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差,有一定比例的假阳性.

与上述的分子杂交技术不同,反向杂交则是用标记的样品核酸与未标记的固化探针DNA杂交,故称为"反向杂交".
这种杂交方法的优点是在一次杂交反应中,可同时检测样品中几种核酸.
这种杂交方式主要用于进行中的核酸转录试验和多种病原微生物的检测.

由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选、酶切图谱的制作、基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等.
四、分子克隆技术基因克隆(Genecloning)是指在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接,转入宿主细胞获得大量拷贝的过程,也称为DNA克隆、分子克隆或DNA重组技术.
该技术建立的理论基础源于人们在对自然界基因转移和重组现象的认识.

基因克隆技术的基本流程包括:①获取目的基因;②选择合适的载体并用相应的限制性内切酶切割目的基因和载体;③用DNA连接酶连接酶切后的目的基因和载体,获得重组DNA分子;④将重组DNA分子导入宿主细胞;⑤筛选、鉴定出含有重组DNA分子的转化细胞;⑥目的基因在宿主细胞中扩增和表达.

基因克隆技术不仅是分子生物学实验中一项重要的基本技术,也是基因工程的核心技术.
对基因进行结构与功能研究,首先必须克隆相应的目的基因;另一方面,在基因工程中,要想获得某一基因的表达产物,也必须首先将目的基因克隆在一合适的表达载体中.
该技术在疾病基因的发现、表达有药用价值的蛋白质、DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值,并促进了当代分子医学的诞生和发展.

五、其它新技术分子生物学是生命科学中发展最为迅速的一门基础学科之一,它的理论和技术也不断着其它生物医学学科的发展.
分子生物学也是一门注重实验操作的学科,在其发展历史上,每一次重大理论的发现都离不开新技术、新方法的支撑.
近年来,新的分子生物学技术不断涌现,层出不穷,并很快得到广泛应用.

如最近发展起来的RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)技术,RNA干扰现象于1998年发现,很快便被发展成为一个成熟的分子生物学研究技术广泛应用生物医学各个领域的研究,它不仅在基因功能的研究方面是一个强有力的研究工具,同时在基因治疗上也具有巨大的应用前景.

另外,随着人类基因组计划(humangenomicproject,HGP)的完成,生物医学的研究也由此进入后基因组学时代,相应的一批在整个组学(-omics)水平上进行的全面、系统、大规模、高通量的系统生物学研究技术也得以建立完善和广泛应用,极大的促进推动了生物医学的研究.
代表性的技术有:(1)在基因组学水平上,有对肿瘤组织细胞中的染色体异常进行全面分析的基因组错配扫描(GenomicMismatchScanning,GMS)和比较基因组杂交(ComparativeGenomicHybridization,CGH)技术,以及对肿瘤表观遗传学进行系统分析的甲基化组学技术等.
(2)在转录组学水平上,cDNA微阵列技术、消减抑制杂交(SubtractiveSuppressionHybridization,SSH)和差示反转录PCR(DifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR,DD-RT-PCR)技术则可以对正常和肿瘤组织的mRNA表达水平进行全面的分析.
(3)在蛋白质组学水平上,以双向电泳和生物质谱技术为核心的蛋白组学研究技术可以对正常和肿瘤组织的基因表达水平在蛋白质水平上进行全面的分析.

第三节、常用仪器使用一、离心机离心机的种类很多,根据转速不同,可以分为低速离心机、高速离心机和超速离心机.
一般来说,转速少于6,000rpm的为低速离心机,低于20,000rpm的为高速离心机,超过20,000rpm的是超速离心机;根据用途不同,还可以将离心机分为分析离心机和制备离心机.
一般实验室装备的离心机其最大转速约为4,000rpm左右的台式或落地式离心机,现简要叙述一般离心机的使用方法.
1.
将待离心的液体置于离心管中.
2.
装有待离心液体的离心管分别放入两个完整的并且配备了橡皮软垫的离心套管之中.
置天平两侧配平,向较轻一侧离心套管内用滴管加水,直至平衡.
3.
检查离心机内有无异物和无用的套管,并且运转平稳.
将已配平的两个套管对称地放置于离心机的离心平台上.
盖好上盖,开启电源.
4.
调节定时旋纽于所需要的时间(分钟).
5.
慢慢转动转速调节旋纽,增加离心机的转速.
当离心机的转速达到要求时,记录离心时间.
6.
达到离心时间后,应将调速旋扭档逐档旋回至"0",然后让它自行停转,当离心机自然停止后,取出离心管和离心套管.
不允许用手或其他物件迫使离心机停转.
严禁在还未停转的状态下和开机运转的状态下打开机盖.

7.
倒去离心套管内的平衡用水并将套管倒置于干燥处晾干.
注意事项:(1)离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上,不允许倾斜.
严格按操作规程使用离心机.
(2)离心管必须平衡后才能启动离心机.
(3)离心机启动后,如有不正常噪音及震动,应立即切断电源,分析原因,排除故障.
(4)在使用过程中,应尽量避免试液洒在机器上面及转头里面,用毕及时清理,擦拭干净.
二、分光光度计1.
分光光度计的基本构造无论哪一类分光光度计都包括:光源、单色器、吸收池、光电转换装置和测量仪表.
(1)光源:分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯.
(2)单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.
在分光光度计中多用作为色散元件.
光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同,因而能将不同波长的光分开,玻璃对紫外线的吸收力强,故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计;石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用.
在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15,000~30,000条),由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱.
光源照到棱镜或光栅以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.
透过棱镜的光再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图.
如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就可以从出射狭缝射出所需要的单色光.
整个装置称为"单色器".

(3)吸收池:吸收池又称比色杯、比色皿、比色池.
一般由玻璃、石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.
在低于350nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池.
吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.
此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.
比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗.

(4)光电转换装置:常用光电池、光电管和光电倍增管三种.
光电池:装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.
第一层是一种导电性良好的金属,这是光电池的负极,中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁,这是光电池的正极.
当光电池受光照射以后,半导体硒的表面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路连通时即产生电流光电管:光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.
阴极的凹画上有一层光电发射材料,此种物质经光照射可发射电子.
当在两极间加有电位时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.
对于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.
由于光电管具有很高的电阻,所以产生的电流容易放大.

光电倍增管:它比普通的光电管优越,它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍.
当电子打在兼性阳极上时,能引起更多的电子自表面射出.
这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子.
此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子,这些电子最后被收集在阳极上.
所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量.

(5)测量装置:—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.
现代的仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线.
2.
常用分光光度计的使用(1)721型分光光度计:721型分光光度计的基本构造见下图1-1:图1-1721分光光度计的基本构造仪器的外观如下见图1-2:图1-2721型分光光度计1.
电源开关2.
比色皿座架拉杆3.
光亮细调旋钮4.
"0"电位器旋钮5.
波长调节器旋钮6.
光亮粗调旋钮7.
波长刻度窗8.
比色皿暗箱盖9.
读数表1)预热仪器:为使测定稳定,将电源开关打开(1),使仪器预热20~30min,为了防止光电管疲劳,不要连续光照.
预热仪器时和在不测定时应将比色皿暗箱盖打开(8),使光路切断.
2)选定波长:根据实验要求,转动波长调节器旋钮(5),使指针指示所需要的单色光波长(7).
3)调节"0"点:轻轻旋动调"0"电位器旋钮(4),使读数表头指针恰好位于透光度为"0"处(此时,比色皿暗箱盖是打开的,光路被切断,光电管不受光照)(9).
4)调节T=100%:将盛蒸馏水(或空白溶液或纯溶剂)的比色皿放入比色皿座架中的第一格内,有色溶液放在其它格内,把比色皿暗箱盖子轻轻盖上(8),转动光量调节器旋钮("6"为粗调旋钮,"3"为细调旋钮)使透光度T=100%,即表头指针恰好指在T=100%处(9).

5)测定:轻轻拉动比色皿座架拉杆(2),使有色溶液进入光路,此时表头指针所示为该有色溶液的吸光度A(9).
读数后,打开比色皿暗箱盖.
6)关机:实验完毕,切断电源,将比色皿取出洗净,并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净.
注意事项:1)为了防止光电管疲劳.
不测定时必须将比色皿暗箱盖打开,使光路切断,以延长光电管使用寿命.
2)比色皿的使用方法:A.
拿比色皿时,手指只能捏住比色皿的毛玻璃面,不要碰比色皿的透光面,以免沾污.
B.
清洗比色皿时,一般先用水冲洗,再用蒸馏水洗净.
如比色皿被有机物沾污,可用盐酸-乙醇混合洗涤液(1∶2)浸泡片刻,再用水冲洗.
不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗比色皿,以免损坏.
也不能用毛刷清洗比色皿,以免损伤它的透光面.
每次做完实验时,应立即洗净比色皿.

C.
比色皿外壁的水用擦镜纸或细软的吸水纸吸干,以保护透光面.
D.
测定有色溶液吸光度时,一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次,以免改变有色溶液的浓度.
另外,在测定一系列溶液的吸光度时,通常都按由稀到浓的顺序测定,以减小测量误差.
E.
在实际分析工作中,通常根据溶液浓度的不同,选用液槽厚度不同的比色皿,使溶液的吸光度控制在0.
2~0.
7.
(2)722型光栅分光光度计:722型光栅分光光度计的基本构造见下图1-3:图1-3722光栅分光光度计的基本构造仪器外形如下图1-4:图1-4722光栅分光光度计外形图1.
电源开关2.
波长旋钮3.
波长刻度窗4.
比色皿暗箱盖5.
试样架拉手6.
100%T旋钮7.
0%T旋钮8.
灵敏度调节旋钮9.
数字显示窗10.
吸光度调零旋钮11.
T/A/C选择开关12.
浓度旋钮1)在接通电源前,应对仪器的安全性进行检查,电源线接线应牢固,接地线通地要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确,然后再接通电源.
2)将灵敏度调节旋钮调至"1"档(8).
调波长调节器(2)至所需波长.
3)开启电源开关(1),指示灯亮,将T/A/C选择开关(11)置于"T",调节透光度"100%"旋钮(6),使数字显示"100.
0"左右,预热20分钟.
4)打开比色皿暗箱盖(4)(光门自动关闭),调节"0"旋钮,使数字显示为"0.
00"(9),盖上比色皿暗箱盖(4),将参比溶液置于光路,使光电管受光,调节透光度"100%"旋钮(6),使数字显示为"100.
0".

5)如果显示不到"100",则可适当增加灵敏度调节旋钮档数(8),但应尽可能使用低档数,这样仪器将有更高的稳定性.
当改变灵敏度后必须按④重新校正"0"和"100".
6)按④连续几次调整"00.
0"和"100"后,将T/A/C选择开关(11)置于A,调节吸光度调零旋钮(10),使数字显示"0.
00".
然后将待测溶液推入光路,显示值即为待测样品的吸光度值A.

7)浓度C的测量.
选择开关由"A"旋至"C",将标准溶液推入光路,调节浓度旋钮.
使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值.
将待测样品溶液推入光路,即可读出待测样品的浓度值.
8)如果大幅度改变测试波长时,在调整"00.
0"和"100"后稍等片刻(因光能量变化急剧,光电管受光后响应缓慢,需一段光响应平衡时间),当稳定后,重新调整"00.
0"和"100"即可工作.

注意事项1)使用前,使用者应该首先了解本仪器的结构和原理,以及各个旋钮之功能.
2)仪器接地要良好,否则显示数字不稳定.
3)仪器左侧下角有一只干燥剂筒,应保持其干燥,发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用.
4)当仪器停止工作时,切断电源,电源开关同时切断,并罩好仪器.
(3)7200型分光光度计:UNICO7200型可见光分光光度计的外形见图1-5:图1-5UNICO7200型可见光分光光度计1.
波长选择旋钮2.
波长刻度窗3.
比色皿暗箱盖4.
试样架拉手5.
数字显示窗6.
键1)仪器基本操作A.
连接仪器电源线,确保仪器供电电源有良好的接地性能.
B.
接通电源,使仪器预热20分钟(不包括仪器自检时间)(电源开关位于仪器背面).
C.
用键设置测试方式(6):透射比(T),吸光度(A),已知标准样品浓度值方式(C)和已知标准样品斜率(F)方式.
D.
用波长选择旋钮(1)设置您所需的分析波长(2).
E.
将您的参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中,打开样品室盖(3),将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中,盖上样品室盖.
一般情况下,参比样品放在第一个槽位中.
比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹,被测溶液中不应有气泡,悬浮物,否则将影响样品测试的精度.

F.
将%T校具(黑体)置入光路中,在T方式下按"%T"键,此时显示器显示"000.
0"(5).
G.
将参比样品推(拉)入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时显示器显示的"BLA"直至显示"100.
0"%T或"0.
000"A为止.
H.
当仪器显示器显示出"100.
0"%T或"0.
000"A后,将被测样品推(拉)入光路,这时,您便可从显示器上得到被测样品的透射比或吸光度值.
2)样品浓度的测量方法A.
已知标准样品浓度值的测量方法A)用键将测试方式设置至A(吸光度)状态B)用波长设置样品的分析波长,根据分析规程,每当分析波长改变时,必须重新调整0A/100%和0%T.
C)将参比样品溶液,标准样品溶液和被测样品分别倒入比色皿中,打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿插入比色皿槽中,盖上样品室盖.
一般情况下,参比样品放在第一个槽位中.
比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹,被测溶液中不应有气泡、悬浮物,否则将影响样品测试的精度.

D)将参比样品推(拉)入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时显示器显示的"BLA"直至显示"0.
000"A为止.
E)用键将测试方式设置至C状态.
F)将标准样品推(或拉)入光路中.
G)按"INC"或"DEC"键将己知的标准样品浓度值输入仪器,当显示器显示样品浓度值时,按"ENT"键.
浓度值只能输入整数值,设定范围为0-l999H)将被测样品依次推(或拉)入光路,这时,您便可从显分别得到被测样品的浓度值.
B.
已知标准样品浓度斜率(K值)的测量方法A)用键将测试方式设置至A(吸光度)状态.
B)用波长旋钮设置样品的分析波长,根据分析规程,每当分析波长改变时,必须重新调整0A/100%和0%T.
C)将您的参比样品溶液和被测样品分别倒入比色皿中,打开样品室盖,将盛有溶液的比色皿插入比色皿槽中,盖上样品室盖.
一般情况下,参比样品放在第一个槽位中.
比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹,被测溶液中不应有气泡、悬浮物,否则将影响样品测试的精度.

D)将参比样品推(拉)入光路中,按"0A/100%T"键调0A/100%T,此时显示器显示的"BLA",直至显示"0.
000"A为止.
E)用键将测试方式设置至F状态.
F)按"INC"或"DEC"键输入己知的标准样品斜率值,当显示器显示标准样品斜率时,按"ENT"键.
这时,测试方式指示灯自动指向"C",斜率只能输入整数.
G)将被测样品依次推(或拉)入光路,这时,您便可从显示器上分别得到被测样品的浓度值3)使用注意事项A.
仪器应放置在室温在5-35℃,相对湿度不大于85%的环境中工作.
B.
放置仪器的工作台应平坦,牢固,不应有振动或其他影响仪器正常工作的现象.
C.
强烈电磁场,静电及其他电磁干扰,都可能影响仪器正常工作,放置仪器时应尽可能远离干扰源.
D.
仪器放置应避开有化学腐蚀气体的地方,如硫化氢、二氧化硫,氨气等.
E.
仪器应避免阳光直射.
F.
仪器使用在额定电压的±10%范围内,频率变化在±1Hz范围内,并要有良好的接地.
G.
仪器通电前检查A)接通电源,让仪器预热至少二十分钟,使仪器进入热稳定工作状态.
B)仪器接通电源后,即进入自检状态,首先显示"UNICO",数秒后显示为:0.
***A(或-0.
***A),即自检完毕.
三、PCR仪聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法,已广泛应用于分子生物学研究与临床诊断中.
虽然PCR基因扩增仪的生产厂家、型号很多,工作原理不尽相同,使用方法也不尽一致,但都具有向自动化和智能化发展的趋势,这对于使用者来说比较方便,只要参考说明书轻轻触动键钮,输入或改变扩增程序、反应时间、温度等,置入扩增样品,扩增仪就会自动完成整个扩增过程.
这里仅以PE公司的PCR仪480为例,简单介绍该型机的使用.

1.
打开主机电源,进入主菜单MainMenu;2.
按箭头键←↑→↓选择文件File菜单,对原有程序进行编辑,或新建新程序;3.
新建扩增程序:开机后,屏幕显示版本信息后,出现steptoeditfile#3.
SOAKfile#1的编辑:file#1是在某一温度下持续无限长时间,即只可修改温度.
按file→1→Enter键;显示SOAKtemperature(0-100)25℃;可根据实验需要修改温度,如要30℃,按3、0,再按Enter键,显示Endoffile,RUN-STORE-PRINT,按NO,使光标至store的下方,按Enter或yes键显示:FilestoreEnteruser#选择自己的数码代号,按数字键盘后,按Enter键,显示:filestoreEnterfile#选择空白程序号,按数字键盘,按Enter键,显示YestostoreUser#***file#***按yes键,此号即为用户存储程序.
TimedelayFile#2的编辑:Timedelayfile#是在某一温度下保温有限时间,按file→2→Enter键,显示:TimedelayFileSteptoeditfile#2按step键,显示delaytime(0-999)7min0sec按要求修改后按enter键,调好min,sec后,显示beepwhiledelayNO-YES,按NO→Enter,显示linktoastoredfile,若无需连接,按0→Enter,按NO,让光标停留在store下方,按Enter,按自己的数码代号,按Enter,按程序代号,按yes(yestostore).
File#3的编辑:File#3是温度循环,温度上升和下降比File#4慢,编此程序大致同File#4.
File#4的编辑:File#4是程序循环,温度上升和下降快.
按File→4→Enter,显示step-cyclefileSteptoeditFile#4,按step,显示:seg1targettemperature94℃,如需修改则按数字键后,按enter,否则直接按enter,显示:seg1segmenttime(0-999)1min0sec修改好min,sec后,按enter,显示:seg2targettemperature37℃温度时间修改方法同上,完成后按enter,显示:seg3targettemp72℃,温度时间修改同上,seg4全部按0,按enter,显示:autosegextensionNO-YES,按NO,显示:autosegextension,NO-YES,按enter(step/yes)回答yes,显示:extensionpercycle(0-59)1如果每个循环是延长1sec,按enter,否则修改后按enter键,显示:cyclecount(1-99)25,修改后,按enter键,显示linktostorefile(0-99,0=shutoff)0,若不与其它程序连接则按0,enter.
若与其它程序连接则按程序号,按enter,endoffileRUN–STORE-PRINT按NO,光标至STORE下方,按ENTER,显示:filestoreenterfile#按程序代码,按enter,显示yestostoreUser#***file#***按YES.
清除程序:按file→所要清除的程序号→enter,按file→clear,显示file#**deleted,enternewfile#,这样你所需要清除的程序被清楚,这一空白程序则可编入新程序.
4.
设置一个PCR体系:一般包括7步:(1)预变性:可用94~95℃,2~10min,一般用5min.
(2)变性:一般用94℃,30s~2min,一般45s~1min.
(3)退火:温度自定,30s~2min.
(4)延伸:70~75℃,一般72℃,对于〈2kb,2kb,每增加1kb加1min.
(5)循环数:一般25~35个循环.
(6)最终延伸:72℃,5~15min.
(7)保存:10℃,时间设为0.
5.
按Start,运行程序;6.
运行程序结束后,取出扩增管,冷却热盖装置,关闭电源;7.
清理台面,认真做好仪器使用记录第四节、如何撰写实验报告实验报告是做完每个实验后的总结.
通过汇报本人的实验过程与结果,分析总结实验的经验和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,同时也是学习撰写研究论文的过程.
实验报告基本格式如下:实验(编号)实验名称年级专业姓名日期页数(一)目的和要求(二)原理(三)试剂和仪器(四)操作方法(五)实验结果(六)讨论书写实验报告应注意以下几点:(1)书写实验报告最好用练习本.
也可以用单篇报告纸,为避免遗失,实验课全部结束后可装订成册以便保存.
(2)简明扼要地概括出实验的原理,涉及化学反应,最好用化学反应式表示.
(3)应列出所用的试剂和主要仪器.
特殊的仪器要画出简图并有合适的图解,说明化学试剂时要避免使用未被普遍的商品名或俗名.
(4)实验方法步骤的描述要简洁,不要照抄实验指导书或实验讲义,但要写得明白,以便他人能够重复.
(5)为了能重复以前的某些实验结果,或此次的结果能在今后再现,因此应记录实际观察到的实验现象而不是照抄实验指导书所列应观察到的实验结果.
并记录实验现象的所有细节.
如只报告一个特殊实验中生成一种黄色沉淀是不够的.
沉淀的真实颜色是什么,亮黄、橘黄或其他沉淀是多,是少,是胶状还是颗粒状什么时候形成沉淀,立即生成、缓慢生成、热时生成还是冷却时生成所有这些都是显而易见的,但常常被忽视.
报告在实验中的真实发现对学生将是非常重要的科学研究训练.
在科学研究中,仔细观察,特别注意未预期的实验现象是十分重要的,这些观察常常引起意外的发现,而且为了重复工作也需要准确的实验报告.
在实验报告中只写"处死大鼠并取肝"是十分不合适的,必须给出鼠的品种、性别、年龄和体重.
鼠是饥饿的还是饱食的,…它是否用某种方式处理过是如何处死它的在评价实验结果时,上述各种因素都可能十分重要,因此必须记录.

(6)讨论不应是实验结果的重述,而是以结果为基础的逻辑推论.
如对定性实验,在分析实验结果基础上应有一简短而中肯的结论.
讨论部分还可以包括关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题,如实验异常结果的分析,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等.

第五节核酸分离纯化技术实验一、基因组DNA的提取制备与检测【实验目的】了解基因组DNA的概念及其结构特点掌握基因组DNA提取的基本原理和实验方法掌握DNA琼脂糖凝胶电泳检测的方法掌握DNA浓度检测的方法【实验原理】基因组(genome)泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质,也即来自一个遗传体系的一整套遗传信息.
基因组DNA(genomicDNA)即代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA.
对所有原核生物(如细菌)和噬菌体而言,它们的基因组就是单个的环状染色体所含的DNA.
对真核生物而言,基因组就是指一个生物体的染色体所包含的全部DNA,通常又称为染色体基因组.
染色体基因组是真核生物主要的物质遗传基础,除此之外,真核细胞还有线粒体或叶绿体,分别含有线粒体或叶绿体DNA,属于核外遗传物质,相应分别称为线粒体或叶绿体基因组.

在分子生物学研究中,获得相当纯度和完整性的基因组DNA,是在基因组DNA水平上进行研究和分析的基本前提,基因组DNA样品质量的好坏将直接关系到后续实验的成败.
基因组DNA通常用于构建基因组文库、Southern杂交、多态性分析以及用PCR方法扩增克隆目的基因组片断等方面的研究.

DNA的分离纯化技术是建立在其结构性质的基础之上的,DNA的一级结构就是指四种脱氧核苷酸的组成和排列顺序,主要由3',5'-磷酸二酯键维持.
生物遗传信息就编码贮存于其一级结构之中,同时一级结构也决定其高级结构形式,所以为了保证DNA结构功能的研究,完整的一级结构是最基本的要求,这也是核酸分离纯化的一个总的原则.
物理、化学等多种因素均可导致对其一级结构的破坏,这在分离纯化过程中均应尽力避免.
真核基因组DNA的分子量大,在分离纯化尤其要注意对其一级结构的保护.
在真核细胞内,DNA与组蛋白盘绕形成核小体,并进一步折叠包装压缩为染色体.
因此,在DNA分离纯化时,首先还要将核蛋白做解聚处理,以释放出DNA.
另外,进行DNA分离纯化时还必须排除蛋白质、RNA等其它分子的污染,保证DNA制品的纯度,以满足后续实验的要求.

因此,尽管DNA分离纯化的方法有很多,但根据上述原则,分离纯化的步骤基本一致,无外乎破碎细胞,去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类、RNA等生物大分子,沉淀DNA,去除盐类、有机溶剂等杂质,纯化DNA等.
不同的分离纯化方法分别具有不同的特点及适用范围,因此,在实际应用中,应根据具体生物材料和研究目的对核酸完整性、纯度、产量的要求而选择不同的方法.

常用的真核细胞基因组DNA分离提取的主要方法有酚抽提法、甲酰胺解聚法及玻璃棒缠绕法等.
酚抽提法的原理主要在于通过用蛋白酶K、SDS、RNA酶消化裂解细胞和解聚核蛋白后,再通过交替使用酚和氯仿这两种不同的蛋白质变性剂,以达到有效去除蛋白质的作用.
实际操作中常常依次使用饱和酚、酚/氯仿和氯仿三种溶液来去除蛋白质,最后在在高盐存在下用乙醇沉淀收集DNA.
通过酚抽提法可以得到100~200kb左右的基因组DNA片段,经适当剪切后,适用于基因组文库的构建.
该法也是目前真核基因组DNA分离提取的普遍使用和经济实用的方法.
在本实验中,我们即主要采用酚抽提来进行基因组DNA的分离纯化.

甲酰胺解聚法则主要利用了甲酰胺的特殊化学性质.
甲酰胺是一种离子化溶剂,既可裂解DNA与蛋白质的复合物,又可变性沉淀释放的蛋白质,但对蛋白酶K的活性无显著影响.
该方法裂解细胞和消化蛋白质的步骤与酚抽提法相同,但不进行酚抽提,而是利用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,然后使用火棉胶袋进行充分透析处理DNA样品.
由于提取过程操作步骤少,DNA分子量一般可达到200kb,经适当处理后,适用于高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段DNA.

玻棒缠绕法主要利用了真核基因组分子量大的特点,该方法将基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面上,然后将沉淀的大分子基因组DNA缠绕到一个Shepherd钩上.
本法提取的DNA分子约为80kb,不适合于构建基因组文库,但适用于用于Southern杂交和PCR反应.

另外,近年来世界各大生物技术商业公司也纷纷投入巨资开发新的更为简便的商业化基因组DNA分离纯化试剂盒,从而使基因组DNA的分离纯化更为方便、快捷、高效和自动化.
如Promega、QIAGEN、Invitrogene等公司均有种类繁多的基因组DNA分离纯化试剂盒,研究人员可以根据自己的经济实力和研究目的去选择合适的试剂盒.

基因组DNA分离纯化完成后,还需要对得到的DNA样品进行DNA浓度检测、纯度鉴定和完整性检测.
只有在通过这些检测分析确认得到高质量的DNA样品后,方可进行下一步的后续实验研究.
DNA浓度的测定一般使用紫外分光光度计来进行检测.
核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线,其最大吸收波长为260nm.
在波长260nm紫外线下,1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50g/ml;单链DNA为40g/ml,可以此来计算核酸样品的浓度.
另外,因为蛋白质的最大吸收波长为280nm,所以在用紫外分光光度计对DNA浓度进行测定时,还可以同时检测280nm处的光密度值,通过计算A260/A280比值来推断DNA的纯度.
在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280比值约为1.
8,比值升高提示有RNA的污染,而比值降低则提示有蛋白质的污染.

基因组DNA完整性则主要通过琼脂糖凝胶电泳来进行检测.
基因组DNA片段的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果发生降解,电泳图谱中的基因组DNA条带则呈拖尾状.
【实验材料】仪器:恒温水浴箱,台式冷冻高速离心机,紫外分光光度计,电泳仪,电泳槽,50ml离心管,1.
5mlEppendorf管,剪刀,牙签,宽口移液管(5ml、10ml),移液器,吸头,锥形瓶,微波炉,简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等.
试剂:磷酸盐缓冲液(PBS):NaCl8g,KCl0.
2g,Na2HPO41.
44g,KH2PO40.
24g,800ml蒸馏水溶解,用HCl调节pH至7.
4,加水定容至1L,高压蒸气灭菌20min,保存于室温.
DNA提取缓冲液:10mmol/LTis.
Cl(pH8.
0),0.
1mol/LEDTA(pH8.
0),20μg/ml胰RNase,0.
5%SDS.
前三种成分可预先混合并于室温保存,RNase在用前加入.
苯酚:熏蒸后,用0.
5mol/LTisCl(pH8.
0)平衡.
TE缓冲液(pH8.
0):10mmol/LTrisCl(pH8.
0),1mmol/LEDTA(pH8.
0).
酸性柠檬酸葡萄糖(acid-citrate-dextrose,ACD)抗凝剂:柠檬酸0.
48g,柠檬酸钠1.
32g,右旋葡萄糖1.
47g,加水至100ml溶解.
使用时,每6ml血液加入1mlACD抗凝剂.
5*TBE电泳缓冲液:54gTris碱,27.
5g硼酸,20ml0.
5mol/LEDTA(pH8.
0),800ml蒸馏水溶解,加水定容至1L.
其他试剂:蛋白酶K(20mg/ml),溴化乙锭溶液,氯仿,异戊醇,琼脂糖,95%乙醇,75%乙醇,1kb梯度DNA分子量参照物,加样缓冲液,3mol/L乙酸钠等.
组织和细胞:贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织或血样.
【实验步骤】(一)DNA的提取(酚/氯仿抽提法)样品的预处理:细胞样本:用培养细胞提取基因组DNA时,应尽可能收集生长状态良好的正在培养的细胞即行抽提,不能及时提取时,则须将细胞放于液氮或-80℃冰箱保存.
对于悬浮培养细胞,经1000g离心5min收集细胞,然后加入DNA提取液混悬细胞沉淀,37℃水浴1h温育.
对于贴壁培养细胞,则需倒出培养皿中的培养液,用预冷的PBS洗2次,将DNA提取液直接加入培养皿中,晃动培养皿至液体变粘稠,然后将其移入离心管,37℃水浴1h温育.
DNA提取液的使用量为5*106个细胞/ml.

组织样本:取1g新鲜组织,液氮中速冻,用锡箔纸包裹,在用液氮预冷的研钵中迅速将组织磨碎.
液氮挥发后,将组织粉末一点点地加入含10mlDNA提取液的离心管中,晃动均匀,37℃水浴温育1h.
血液样本:收集10ml新鲜血液于含ACD抗凝剂的离心管中,1300g4℃离心15min,吸去上清,小心吸取淡黄色层,移至一新的离心管中并再次离心,弃去红细胞沉淀.
用7mlDNA提取液悬浮细胞,37℃水浴温育1h.
对于冻存血液,在解冻后加入等体积PBS混匀,室温3500g离心15min,弃去含有裂解红细胞的上清,用7mlDNA提取液悬浮细胞,37℃水浴温育1h.
消化:加入蛋白酶K至终浓度100g/ml~300g/ml,上下颠倒离心管混匀,使溶液至粘稠状.
50℃水浴保3h,以裂解细胞、消化蛋白,其间应不时轻轻上下颠倒离心管混匀粘稠的溶液,以使消化充分.
酚/氯仿抽提纯化DNA:将上述反应液冷却至室温后,加入等体积的饱和酚,轻轻地上下颠倒离心管5min~10min,直至水相与酚相混匀呈乳浊状.
室温5000g离心15min,小心地用宽口吸管将粘稠的水相转移至另一新离心管中.
加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),轻轻颠倒混匀,室温5000g离心15min,用宽口吸管小心地吸取上层水相,转移至另一新离心管中.
再用等体积的氯仿抽提一次.
沉淀DNA:加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积室温或预冷的无水乙醇,轻轻颠倒混匀离心管,即可观察到乳白色云絮状DNA的出现.
用牙签小心挑取絮状DNA,转移至一新的离心管中.
如果DNA沉淀为碎片,则在室温5000g离心5min收集DNA沉淀.
洗涤DNA:加入75%乙醇1ml,5000g离心5min,小心弃去上清.
将离心管倒置于滤纸上空干,室温或真空干燥以使残留的乙醇挥发.
但注意不要使DNA完全干燥,否则难以融解.
DNA样品的溶解:加入适量TE溶解DNA样品,可过夜放置以使DNA完全溶解.
4度保存备用.
(二)DNA的浓度及纯度检测取适量DNA样品,用TE进行稀释,TE溶液作为空白对照,在紫外分光光度计上测定A260和A280值,并计算A260/A280比值.
按照下面公式计算DNA样品的浓度:DNA浓度(g/l)=A260*50*稀释倍数/1000经上述方法制备的DNA样品,A260/A280比值应在1.
7~2.
0之间.
如比值过高提示有RNA的污染,而比值过低则提示蛋白质没有得到有效去除.
(三)DNA的琼脂糖凝胶电泳检测凝胶制备:称取0.
8g琼脂糖于锥形瓶中,加入100ml1*TBE电泳缓冲液.
微波炉加热使琼脂糖完全溶解.
同时准备凝胶模具并插上梳子.
待胶液冷却至60℃左右后,将琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中,避免气泡产生,若有气泡产生可用移液器吸头移去.
凝胶厚度一般为0.
3cm~0.
5cm.
室温下静置20min~30min左右,待琼脂糖胶液完全凝固.
胶凝之后,轻轻移去梳子,凝胶置于1*TBE电泳缓冲液中备用.
上样:将凝胶置于胶板模具上,放在电泳槽内,注入适量的1*TBE电泳缓冲液,液面应高于胶面5mm左右.
取适量的DNA样品与加样缓冲液混合,然后用微量移液器将DNA样品加入加样孔中,同时加入1kb梯度DNA分子量参照物.
电泳:加样完毕后,连接电泳槽与电源之间的电源线,正极为红色,负极为黑色,凝胶的加样端应置于负极.
设置电压和时间,电压一般为80伏~100伏,时间一般约40min~50min.
打开电源,若连接良好,负极附近的铂丝会有气泡产生.
电泳时间的选择取决于胶的长度和电压的大小,胶越长,电压越低,所需时间就越长,但电压过高时,会降低大分子DNA片断的分辨率.
最终应根据上样缓冲液中指示剂溴酚蓝迁移的位置(溴酚蓝和500bp大小DNA的迁移率相近),判断是否终止电泳,切断电源.
染色与观察:电泳结束后,取出凝胶,放入EB染色液中染色5min~10min.
染色后,用水冲洗凝胶,使用简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统观察凝胶电泳的结果并拍照记录.
注意和1kb梯度DNA分子量参照物对比,推测提取的DNA样品的分子量大小,并注意观察DNA样品条带的强度、锐利程度和有无拖带等现象.
【注意事项】液氮的使用:液氮操作时应戴保暖手套和防护目镜,以防溅出的液氮冻伤皮肤.
血液抗凝剂的选择:抗凝剂的种类很多,但用于提取DNA时,使用ACD抗凝剂抗凝比用其它抗凝剂能更好地保存大分子DNA.
经过抗凝处理的血液在DNA制备前可以在-70℃长期保存,也可以在2℃~8℃放置数天至2个月,但DNA的产率会随放置时间的延长而有所降低.

样本的预处理:对于组织细胞的破碎处理,也可以采用匀浆或者超声等物理破碎方法,但这些方法会对大分子DNA有剪切作用.
蛋白酶K的使用:不同批次的蛋白酶K的活性有差异,因此在正式实验前应做预实验确定合适的使用浓度.
新购买的蛋白酶K应分装成小份于-20℃长期贮存,避免反复冻融.
避免物理剪切作用对大分子DNA的损伤:基因组DNA分子量很大,易受剪切力作用而发生断裂,所以在操作过程中应轻柔,提取步骤中的混匀操作,动作不可剧烈,应缓慢的上下颠倒离心管进行混匀.
移液器的吸头也应剪去前面的部分,以避免DNA溶液快速通过狭长的通道而受损伤.

DNA的溶解:75%乙醇洗涤DNA后晾干时,注意不要让DNA沉淀完全干燥,否则极难溶解.
加入TE溶解DNA时,可置于4℃过夜,或者置于旋转混合仪上缓慢旋转混合以尽快完全溶解.
关于细胞样品的处理:用培养细胞提取基因组DNA时,应尽可能新鲜收集即行抽提,不能及时提取时,必须将细胞放于液氮或-80℃中.
酚提取水相的吸取:酚抽提离心后,溶液会分为上层的水相、下层的酚有机相和中间的交界面,DNA位于上层的水相中,交界面含有蛋白.
因此在吸取上层水相时应非常小心,以免将混有交界面的蛋白质也吸入上层水相.
如不慎吸取到交界面的蛋白,可再进行一次酚抽提以去除蛋白.
另外,Tris.
Cl饱和酚的pH值应接近8.
0,过酸或过碱都会造成酚抽提离心后,水、酚两相交界面不清楚,交界面有DNA滞留,进而转移水相时带动界面中的蛋白质.

琼脂糖凝胶电泳:倒胶时注意不能有气泡留在胶层,电泳时注意正负极的方向不能接反.
用于凝胶染色的溴化乙锭为致癌物,操作时一定要戴乳胶或一次性手套.
溴化乙锭可在制备凝胶时直接加入凝胶中,或者加入电泳槽中的电泳缓冲液中,这样在电泳结束后可直接观察;也可以等电泳结束后单独进行溴化乙锭染色.

【思考题】什么是基因组DNA常用的三种基因组DNA提取方法的原理是什么紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度原理是什么酚/氯仿法抽提DNA时,酚为什么要进行饱和酚、氯仿、异戊醇和蛋白酶K分别起什么作用实验二、总RNA的提取制备与检测【实验目的】了解RNA分子的种类、分布及其结构特点掌握总RNA提取的基本原理和实验方法掌握总RNA浓度检测的方法掌握总RNA完整性检测的方法【实验原理】RNA是生物体内除DNA之外的另一大类核酸,其结构与DNA十分类似,也是由核苷酸单元以3',5'-磷酸二酯键连接而成的长而无分枝的大分子.
然而与DNA相比,RNA分子量则较小,通常由几十至几千个核苷酸单元组成.
除某些病毒外,生物体内的RNA通常以单链的形式存在,但单链的RNA可以通过局部区域内的自身配对形成双螺旋结构,不能配对区域则形成环状突起.
生物体内的RNA主要分为rRNA、tRNA、mRNA和其它一些小RNA分子等几大类,其中rRNA的含量最高,约80%~85%,其次为tRNA,约为10%~15%,mRNA的含量较低,约为1%~5%.
RNA分子在细胞内也是以核蛋白的形式存在,故而也要在抽提时先进行解聚处理.

RNA作为细胞内一类重要的核酸分子和分子生物学研究的一个主要对象,进行完整的RNA的提取和纯化是进行RNA方面研究工作的基本前提,如Northern杂交、mRNA分离、RT-PCR、基因表达水平检测、cDNA合成及体外转录和翻译等实验均需要首先得到高质量的RNA样品.

RNA提取的基本策略和步骤与DNA的提取也基本类似,只不过在提取RNA时,DNA则作为一种杂质被除去.
RNA提取的基本步骤为首先破碎细胞,然后去除与RNA结合的蛋白质以及多糖、脂类、DNA等生物大分子,沉淀RNA,去除盐类、有机溶剂等杂质,纯化RNA等.
一般方法提取的都仅仅是组织细胞内的总RNA,但个别研究工作中还要获取纯的mRNA,则需进行进一步的分离纯化.

总RNA的分离提取方法目前主要有两种,即酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法和异硫氰酸弧-CsCl超速离心法.
异硫氰酸弧-CsCl超速离心法提取出的总RNA质量较高,但该法费时且需要高速离心.
酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法则是最为经典的RNA分离纯化方法,于1987年由Chomczynski等人建立,故也称Chomczynski一步分离法,该法以含有异硫氰酸胍、β-巯基乙醇和SDS的变性溶液裂解细胞,然后在pH4.
0的酸性条件下,再加入酚和氯仿,经离心分离后DNA与蛋白质进入有机相而RNA则留在水相,从而将总RNA抽提出来,最后吸取水相用异丙醇沉淀获得总RNA.
与其它方法相比,Chomczynski一步分离法具有简便、经济、快速和高效等特点,且用该法制备的总RNA适用于绝大多数分子生物学实验如Northern杂交等的要求,因此成为目前使用最为广泛的RNA提取方法,适用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA.
在该方法的基础上,很多生物技术公司也开发出了更加便于使用的用于RNA分离的商品溶液,从而使得RNA的分离纯化变得更为快捷和容易.
如Invitrogen公司的TRIZOL试剂就是在Chomczynski一步分离法基础上进行改进的复合试剂,含有异硫氰酸胍和酚等化学试剂,可迅速破坏细胞结构,使RNA核蛋白解离并将RNA分子释放到溶液中.

另外,在RNA的提取过程中,我们最关心的便是其一级结构的稳定性,尤其是来自于细胞内外环境中的RNase对其一级结构的降解.
与DNase相比,RNase分布广泛,耐热耐酸耐碱,不需要辅助因子,蛋白质变性剂也只能暂时抑制它的活性.
所以,RNA分离纯化的关键问题就是创造一个无RNase的环境.
创造一个无RNase的环境主要包括两方面的工作:即极力避免外源RNase的污染和尽力抑制内源性RNase的活力.
外源RNase主要来源于操作者的手、实验器皿和试剂,故而口罩、手套、实验器皿、试剂要高温高压灭菌处理,或焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC)处理.
内源性RNase来源于样品中的组织细胞,细胞破碎的同时,RNase也随即释放出来,所以原则上要尽可能早的去除细胞内蛋白,联合使用各种不同的强有力的RNase抑制剂.

本实验中我们将主要介绍如何使用Chomczynski一步分离法来分离总RNA,同时考虑到TRIZOL试剂的广泛使用,也提供TRIZOL试剂的使用方法作为可选方案.
【实验材料】仪器:恒温水浴箱,台式冷冻高速离心机,紫外分光光度计,电泳仪,电泳槽,1.
5mlEppendorf管,剪刀,牙签,移液器,吸头,锥形瓶,微波炉,简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等.
试剂:磷酸盐缓冲液(PBS):NaCl8g,KCl0.
2g,Na2HPO41.
44g,KH2PO40.
24g,800ml蒸馏水溶解,用HCl调节pH至7.
4,加水定容至1L,高压蒸气灭菌20min,保存于室温.
变性液:4mol/L异硫氰酸胍,25mmol/L柠檬酸钠(pH7),0.
5%(m/V)SDS.
5*MOPS溶液:20.
9gMOPS[3-(N-玛琳代)丙磺酸,3-(N-morpholinc)propanesulonicacid],溶于500mlDEPC处理过的水中,加0.
5mol/LEDTA(pH8.
0)10ml,混匀后加入3mol/L乙酸钠(pH5.
2)25ml,定容至1L,避光保存于4℃,若溶液变黄则丢弃.
苯酚:熏蒸后,用0.
5mol/LTisCl(pH8.
0)平衡.
49:1(V/V)氯仿/异戊醇TRIzol试剂其它试剂:DEPC,氯仿,异丙醇,2mol/L醋酸钠(pH4),95%乙醇,75%乙醇(DEPC处理水配制),溴化乙锭溶液,甲醛,甲酰胺,琼脂糖,RNA分子量参照物,RNA加样缓冲液等.
组织和细胞:贴壁或悬浮培养的哺乳动物细胞、新鲜组织.
【实验步骤】(一)RNA的提取(Chomczynski一步分离法)组织细胞样品的处理:组织样本:将组织适当剪碎,按照每100mg组织加入1ml变性液,然后在玻璃匀浆器中将组织匀浆.
或者使用液氮在研钵中研碎组织后再加入变性液.
细胞样本:应尽可能收集生长状态良好的正在培养的细胞即行抽提,不能及时提取时,则须将细胞放于液氮或-80℃冰箱保存.
对于悬浮培养细胞,经1000g离心5min收集细胞,然后加入变性液混悬细胞沉淀.
对于贴壁培养细胞,则需倒出培养皿中的培养液,用预冷的PBS洗2次,将变性液直接加入培养皿中.
变性液的使用量为1*107个细胞/ml.
取500l经过变性液处理过的组织细胞裂解物移至另一新管中,然后加入50l2mol/L的醋酸钠、500l的饱和酚,50l的氯仿/异戊醇(49:1),混匀后冰上放置15min.
12,000g4℃离心15min.
将上层含RNA的水相转移至一新的离心管中,然后加入与500l的异丙醇,充分混合,置于-20℃30min或-70℃5min以沉淀RNA.
12,000g4℃离心10min,收集RNA沉淀.
离心后轻轻倒出异丙醇,加入200l的变性液溶解RNA沉淀.
然后加入200l的异丙醇和60l的2mol/L的乙酸钠,置于-20℃30min或-70℃5min以沉淀RNA.
12,000g4℃离心20min,收集RNA沉淀.
加入75%乙醇重悬洗涤RNA沉淀,然后12,000g4℃离心5min再次收集RNA沉淀.
晾干或真空干燥RNA沉淀,然后加入50lDEPC处理过的水以溶解RNA.
溶于水的RNA贮存于-70℃备用.
(二)RNA的提取(备选方案:TRIzol试剂法)组织细胞的匀浆处理组织样品:按照每50mg~100mg组织样品加入1mlTRIzol试剂,用玻璃匀浆器或者电动匀浆器破碎组织细胞;细胞样品:对于贴壁细胞,吸去培养基后,用PBS洗涤一次,以洗去残留的培养基,然后按照每10cm2面积加入1mlTRIzol试剂的比例将TRIzol试剂直接加至培养皿,用移液器上下吹打几次以裂解细胞;对于悬浮细胞,首先应收集细胞沉淀,然后按照每106个细胞加入1mlTRIzol试剂的比例加入TRIzol试剂,用移液器上下吹打几次以裂解细胞.
将上述经TRIzol处理的组织细胞裂解液转移至一新的1.
5ml离心管中.
对于多糖、蛋白质、脂肪或者细胞外基质等含量高的组织细胞样品,需将经TRIzol处理的组织细胞裂解液进行离心处理以去除这些物质,12,000g于2~8℃离心10min,收集上清.
对于一般的组织细胞样品,可省略该步骤直接进入下一步.
将上述经TRIzol处理的组织细胞裂解液于室温下放置5min.
然后按照每1mlTRIZOL试剂加入0.
2ml氯仿的比例加入氯仿,剧烈振荡15秒,于室温下放置2min~3min.
4℃下12000g离心15min.
将水相转移至一新离心管中.
每1mlTRIzol中加入0.
5ml异丙醇沉淀RNA.
混匀,将样品置于室温下10min.
于4℃,12000g离心10min.
凝胶样沉淀物为RNA.
弃去上清液并用75%乙醇洗涤RNA沉淀一次,随后于4℃下7500g离心5min.
晾干RNA沉淀,然后用适量DEPC水溶解沉淀.
分别取出2μl测定浓度、纯度及质量,剩余的RNA加入1/10体积乙酸钠和1ml无水乙醇重新沉淀,保存在-70℃备用.
(三)RNA的浓度和纯度检测取适量RNA样品,用DEPC处理水进行稀释,DEPC处理水作为空白对照,采用紫外分光光度计测定A260和A280值,同时计算A260/A280比值以推测RNA样品的纯度.
按照下面公式计算DNA样品的浓度:RNA浓度(g/l)=A260*40*稀释倍数/1000纯的RNA制品的A260/A280比值应接近2.
0.
如低于1.
7,表明可能存在蛋白质污染,可以通过重复酚/氯仿抽提以去除蛋白质.
(四)RNA的完整性检测――甲醛变性琼脂糖凝胶电泳甲醛变性胶的制备:称取1g琼脂糖于锥形瓶中,在73ml蒸馏水中溶解后稍冷却,加入20ml5*MOPS缓冲液,17ml甲醛.
微波炉加热使琼脂糖完全溶解.
同时准备凝胶模具并插上梳子.
待胶液冷却至60℃左右后,将琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中,避免气泡产生,若有气泡产生可用移液器吸头移去.
凝胶厚度一般为0.
3~0.
5cm.
室温下静置20~30min左右,待琼脂糖胶液完全凝固.
胶凝之后,轻轻移去梳子.
RNA样品的制备:RNA5.
5μl5*MOPS2.
0μl37%甲醛3.
5μl甲酰胺10.
0μl总体积20μl65℃温育15min使RNA变性,然后迅速置于冰上冷却,稍离心.
上样:将凝胶置于胶板模具上,放在电泳槽内,注入适量的1*MOPS电泳缓冲液,液面应高于胶面5mm左右.
取上述制备好的RNA样品与加样缓冲液混合,然后用微量移液器将RNA样品加入加样孔中,同时加入1kb梯度RNA分子量参照物.
电泳:加样完毕后,连接电泳槽与电源之间的电源线,正极为红色,负极为黑色,凝胶的加样端应置于负极.
设置电压和时间,电压一般为80伏~100伏,时间一般约40min~50min.
打开电源,若连接良好,负极附近的铂丝会有气泡产生.
持续电泳直至溴酚蓝到达凝胶的底部,终止电泳,切断电源.
染色与观察:电泳结束后,取出凝胶,放入EB染色液中染色5min~10min.
染色后,用水冲洗凝胶,使用简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统观察凝胶电泳的结果并拍照记录.
注意和RNA分子量参照物对比,观察RNA样品28S和18S条带的强度、锐利程度和有无拖带等现象.

RNA完整性的判定:总RNA中以rRNA的含量最高,真核细胞如人体的总rRNA包含有28S、18S、5.
8S和5S四种分子,因此通常通过观察28S和18SrRNA条带的强弱和锐利程度来判定RNA的完整性.
来源于人体组织细胞的28S和18SrRNA条带的大小分别约为5.
0kb和1.
9kb,两者的强度比约为2:1.
如果电泳后没有发现28S和18SrRNA条带、或者条带不够锐利、或者出现明显的拖带现象,则提示RNA不够完整,有降解现象的出现.
【注意事项】在实验的整个操作过程中,应时刻注意采取防止RNA酶污染和RNA降解的措施,实验人员应戴手套和口罩,并避免谈话聊天等,所有的实验器具均应进行无RNase处理.
用于RNA提取实验器具处理:玻璃制品,可于180℃烘烤8h.
塑料制品最好直接选用新的无RNase的制品.
或者将上述器具用0.
1%DEPC浸泡过夜,高压蒸汽灭菌30min,烤干后再用.
RNA电泳槽的处理:按照常规实验洗干净后,先用乙醇擦洗,然后用3%H2O22浸泡处理10min后,最后用DEPC处理水冲洗即可.
溶液的配制及处理:所有用于RNA分离提取的溶液均应加入0.
1%的DEPC于37℃过夜处理,然后高压灭菌15min.
但由于DEPC可与胺类发生化学反应,因此不能用DEPC来处理含有Tris一类的缓冲液.
RNA的溶解:75%乙醇洗涤RNA后晾干时,注意不要让RNA沉淀完全干燥,否则极难溶解.
RNA样品也可以用去离子甲酰胺溶解.
关于细胞样品的处理:用培养细胞提取RNA时,应尽可能新鲜收集即行抽提,不能及时提取时,必须将细胞放于液氮或-80℃中.
RNA水相的吸取:酚/氯仿抽提离心后,溶液会分为上层的水相、下层的酚/氯仿有机相和中间的交界面,RNA位于上层的水相中,交界面含有蛋白.
因此应小心吸取上层的RNA水相,以免将交界面的蛋白质也吸入上层水相.
如不慎吸取到交界面的蛋白,可再进行一次酚抽提以去除蛋白.

个别组织譬如脾脏通常含有比其它组织更多的RNase,因此从这些组织细胞中分离提取RNA时应采取更为严格的防止RNA酶污染和RNA降解的措施.
【思考题】Chomczynski一步法分离提取RNA的原理是什么紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度原理是什么请简述甲醛变性胶检测RNA样品完整性的原理,其判定标准是什么如果要分离提取mRNA,那么应该采取何种方案实验三、质粒DNA的提取制备与检测【实验目的】了解质粒的基本特性及其应用掌握碱裂解法提取质粒DNA的基本原理和实验方法掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA完整性原理及其方法【实验原理】几乎所有的细菌中,除了染色体之外,细胞中还存在一些环状的DNA分子,叫做质粒(plasmid).
不同的质粒大小有很大的差别,最小的约长1kb,而最大的可达250kb.
质粒上常带有一些特殊的基因,如抗生素的抗性基因.
质粒具有自己的复制起始区,能自主复制.
质粒在细胞中的拷贝数也不尽相同,有的拷贝数很少,只有一、二个拷贝,称为严紧型质粒,另一些具有较高的拷贝数,约有10个以上,称为松弛型质粒.
有些质粒不能共存于一个细菌的细胞,这种特征称为质粒的不相容性.
在此基础上,人们进一步对其进行改造,除了保留其具有自主复制和具有抗性基因等筛选标记外,还特意添加了具有多个单一的限制型酶切位点区域即多克隆位点,以便于插入外源DNA片断,从而使得质粒作为一种外源基因的载体用于基因克隆等实验研究中.
与病毒等载体相比,质粒具有分子量小和易于操作等显著特点,从而成为一种应用最为广泛的载体.

由于质粒的独特特性,所以质粒提取的策略和方法也明显不同于常规基因组DNA和总RNA的提取制备,质粒提取制备的过程主要在于必须将细菌质粒DNA与染色体DNA分开,同时去除菌体蛋白、残片等物质,最终获取纯的高质量质粒.
质粒的提取方法多种多样,目前常用的有碱裂解法、煮沸法、氯化铯密度梯度离心法等,每种方法都各有利弊,具体使用时应根据菌株类型、质粒种类、分子大小及下游应用等具体情况选择实施.
目前最为常用的方法为碱裂解法,本实验即着重对此方法进行介绍,由此法制备得到的质粒可用于下游的酶切、连接、转化、测序、PCR等常规的分子生物学实验.

碱裂解法抽提质粒DNA的原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的.
首先使用溶液I将细菌悬浮于葡萄糖等渗溶液中,然后加入含有SDS的碱性极强的溶液II,使细菌裂解,在pH高达12.
6的碱性条件下,使染色体DNA与质粒DNA均发生变性,此时染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离;然后再加入pH4.
8的高盐缓冲液即溶液III,将分离体系的pH调节至中性,此时变性的闭合环状的两条单链质粒DNA则可以复性而恢复原来的构象,但变性的单链染色体DNA由于互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子而不能复性,通过离心,则可将染色体DNA和蛋白质沉淀下来除去而获得质粒DNA.
由于细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA,因此对初步分离的质粒DNA还必须进行纯化以将这些物质除去.
RNA可用RNase分解除去;蛋白质可通过酚/氯仿抽提除去,氯仿在除去蛋白质的同时也可去除脂类杂质;最后乙醇沉淀纯化的质粒DNA.

需要指出的是,近年来,各大生物技术公司纷纷开发推出各自的商品化质粒DNA提取纯化试剂盒,这些试剂盒具有方便、快速和重复性好等特点,因此在分子生物学研究工作中得到了广泛的应用.
这些试剂盒多采用改进的SDS碱裂解法,与传统手工碱裂解法提取制备质粒DNA不同的地方主要是其纯化方法,无需酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等,而是结合制备膜或树脂选择性地吸附DNA,从而达到快速纯化质粒DNA的目的.
目前已很少有实验室还采用手工碱裂解法来提取纯化质粒.

【实验材料】仪器:恒温摇床,台式高速离心机,紫外分光光度计,10ml离心管,1.
5mlEppendorf管,电泳仪,电泳槽,移液器,吸头,锥形瓶,微波炉,简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等.
试剂:LB液体培养基:分别称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,琼脂15g,加入约900ml去离子水,搅动使溶质完全溶解,用5mol/LNaOH调至pH7.
0(约需0.
2ml),定容至1L,高压蒸气灭菌.
待溶液冷却后,加入适量抗生素如氨苄青霉素制成抗性培养基,混匀.
4℃贮存备用.
LB固体培养基和琼脂平板的制备:分别称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加入约900ml去离子水,搅动使溶质完全溶解,用5mol/LNaOH调至pH7.
0(约需0.
2ml),定容至1L,高压蒸气灭菌.
待冷却至55℃左右时,加入抗生素.
混匀后立即于超净工作台内将其倒入事先准备好的培养皿中,待培养基凝固后,即可将平板倒置存放于4℃备用.
氨苄青霉素(Amp):用去离子水配制成100mg/ml,-20℃贮存.
使用浓度为50g/ml~100g/ml.
溶液Ⅰ:葡萄糖50mmol/L,Tris-C1(pH8.
0)25mmol/L,EDTA10mmol/L,可成批配置,高压灭菌后4℃贮存.
溶液Ⅱ:NaOH0.
2mol/L,SDS1%,该溶液应于临用前配制.
注:实验室如果经常使用可分别配制0.
4mol/LNaOH和2%SDS溶液,临用时等体积新鲜配制.
溶液Ⅲ:5mol/LKAc60ml,冰醋酸11.
5ml,水28.
5ml.
苯酚:熏蒸后,用0.
5mol/LTisCl(pH8.
0)平衡.
24:1(V/V)氯仿/异戊醇TE缓冲液(pH8.
0):10mmol/LTrisCl(pH8.
0),1mmol/LEDTA(pH8.
0).
5*TBE电泳缓冲液:54gTris碱,27.
5g硼酸,20ml0.
5mol/LEDTA(pH8.
0),800ml蒸馏水溶解,加水定容至1L.
RNaseA:10mg/ml,-20℃贮存.
其他试剂:溴化乙锭溶液(10mg/ml),氯仿,异戊醇,琼脂糖,95%乙醇,75%乙醇,1kb梯度DNA分子量参照物,加样缓冲液,3mol/L乙酸钠等.
菌株:携带合适载体的大肠杆菌菌株如DH5α或JM109等.
【实验步骤】(一)质粒DNA的提取挑取琼脂培养板上的含有质粒的单菌落,接种至3ml~6mlLB培养液(含Ampl00μg/m1),37℃振荡培养过夜.
取出1ml培养液至1.
5mlEppendorf管中,4000g室温离心5min,弃去上清.
将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,用枪头或者振荡器充分悬浮细菌.
加入200μl新配制的溶液Ⅱ,盖严管盖,上下轻轻颠倒离心管4次~6次,使细菌裂解充分,放置冰上2min~5min,至裂解液变澄清.
加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖严管盖,立即轻轻上下颠倒离心管5次~10次,使之充分混合,此时会出现白色絮状沉淀,放置冰上2min~5min.
溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
12,000g4℃离心10min,取上清至一个新的无菌的1.
5m1Eppendorf管中.
加入RNaseA,终浓度20μg/m1,50℃水浴30min.
加入等体积酚/氯仿(1:1),振荡混匀,12,000g室温离心10min.
上清转移至另一个新Eppendorf管中.
加人等体积氯仿/异戊醇(24:1),振荡混匀,12,000g室温离心10min,上清转移至另一个新Eppendorf管中.
加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.
2),2倍体积预冷无水乙醇,室温放置2~5min.
12,000g室温离心10min,弃去上清,沉淀用70%乙醇洗涤一次,空气中晾干.
加入20μl~50μlTE溶解质粒DNA,检测后即可于-20℃或4℃保存.
(二)质粒DNA的浓度与纯度检测取适量质粒DNA样品,用TE进行稀释,TE溶液作为空白对照,在紫外分光光度计上测定A260和A280值,并计算A260/A280比值.
按照下面公式计算质粒DNA样品的浓度:质粒DNA浓度(g/l)=A260*50*稀释倍数/1000经上述方法制备的质粒DNA样品,A260/A280比值应在1.
7~2.
0之间.
如比值过高提示有RNA的污染,而比值过低则提示蛋白质没有得到有效去除.
(三)琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA凝胶制备:称取0.
8g琼脂糖于锥形瓶中,加入100ml1*TBE电泳缓冲液.
微波炉加热使琼脂糖完全溶解.
同时准备凝胶模具并插上梳子.
待胶液冷却至60℃左右后,将琼脂糖胶液倒入准备好的凝胶模具中,避免气泡产生,若有气泡产生可用移液器吸头移去.
凝胶厚度一般为0.
3cm~0.
5cm.
室温下静置20min~30min左右,待琼脂糖胶液完全凝固.
胶凝之后,轻轻移去梳子,凝胶置于1*TBE电泳缓冲液中备用.
上样:将凝胶置于胶板模具上,放在电泳槽内,注入适量的1*TBE电泳缓冲液,液面应高于胶面5mm左右.
取适量的DNA样品与加样缓冲液混合,然后用微量移液器将DNA样品加入加样孔中,同时加入1kb梯度DNA分子量参照物.
电泳:加样完毕后,连接电泳槽与电源之间的电源线,正极为红色,负极为黑色,凝胶的加样端应置于负极.
设置电压和时间,电压一般为80伏~100伏,时间一般约40min~50min.
打开电源,若连接良好,负极附近的铂丝会有气泡产生.
电泳时间的选择取决于胶的长度和电压的大小,胶越长,电压越低,所需时间就越长,但电压过高时,会降低大分子DNA片断的分辨率.
最终应根据上样缓冲液中指示剂溴酚蓝迁移的位置(溴酚蓝和500bp大小DNA的迁移率相近),判断是否终止电泳,切断电源.
染色与观察:电泳结束后,取出凝胶,放入EB染色液中染色5min~10min.
染色后,用水冲洗凝胶,使用简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统观察凝胶电泳的结果并拍照记录.
注意和1kb梯度DNA分子量参照物对比,推测提取的DNA样品的分子量大小,并注意观察DNA样品条带的强度、锐利程度和有无拖带等现象.
质粒DNA质量的判定:质粒DNA是环状的双链DNA分子,通常有三种构型.
第一种是共价闭合环状的DNA,通常呈超螺旋构型;第二种是开环DNA,它的双链中的一条保持完整的环状结构,另一条单链上有一到几个切口;第三种是线状DNA,这种质粒的双链断裂呈线状.
这三种构型的同一种质粒DNA在琼脂糖凝胶中电泳时,迁移速率明显不同,走得最快的是超螺旋构型,其次是线性构型,最慢的是开环构型.
因此提取的质粒DNA经电泳分离、EB染色后,在紫外线灯下可观察到三个条带,自前往后分别为:超螺旋、线性及开环质粒DNA,其中以超螺旋构型的质粒DNA的质量为最好,故而由此可以根据质粒DNA的电泳图谱来推测判定质粒DNA的质量.

【注意事项】加入溶液Ⅱ时的操作:溶液Ⅱ为变性液,可使DNA与蛋白质的变性和细菌的充分裂解,所以在加入溶液Ⅱ后,应轻柔地上下颠倒离心管4次~6次,使细菌裂解、DNA变性充分,但不应涡旋振荡,否则易导致基因组DNA的剪切.

加入溶液Ⅲ时的操作:溶液Ⅲ为复性液,可使变性的质粒DNA复性.
所以加入溶液Ⅲ后,应立即轻柔地上下颠倒离心管5次~10次以充分混匀,此时溶液中会出现白色的含有基因组DNA、蛋白质和细菌碎片的絮状物,溶液也变得不粘稠,如果溶液仍然粘稠,则可适当增加混匀的时间.

转移上清的操作:加入溶液Ⅲ处理并离心后,应将上清转移至一个新的Eppendorf管中,此时应小心操作,注意避免同时转移絮状沉淀.
质粒DNA的保存:溶解于TE缓冲液中的质粒DNA,可暂时保存于4℃或者长期保存于-20℃.
质粒DNA也可以通过菌种保存.
如果将生长在琼脂平板上的菌种置于4℃,可保存1个月左右.
如长期保存,则可以在菌液中加入15%(V/V)的灭菌甘油,然后分装于Eppendorf管中于-70℃保存.
实际操作中,大多数研究人员习惯将质粒溶解于TE中保存.
因为使用菌种保存时,理论上来讲,菌种复苏时质粒具有丢失、重排或者突变等潜在的危险,但目前并没有这方面的确切的实验报道.

质粒DNA的使用:由此法制备得到的质粒可用于下游的酶切、连接、转化、测序、PCR等常规的分子生物学实验,但对于其它对质量要求较高的实验如真核细胞转染、显微注射等则需采用其它方法来提取制备.

【思考题】为什么质粒能否作为载体使用与其它类型的载体相比,有何优缺点请简述碱裂解法提取质粒DNA的基本原理琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA完整性的原理是什么,其判定标准是什么第六节PCR技术PCR技术从1983年的第一代的手动/机械手式水浴基因扩增到第四代的实时定量PCR,PCR技术已经经历了四代的发展历程.
PCR技术以其快速高效的体外扩增特性,一经问世,立刻引起了分子生物学研究的一场革命,人们利用这种技术很快就把微观领域的生物学研究大大地往前推了一步.
现在PCR技术已经广泛渗透到生命科学和医学研究的各个领域,被广泛地应用于生命科学研究、医疗及环境监测等诸多方面.

本小节安排了最基本的常规PCR实验和逆转录PCR(RT-PCR)实验,培养学生对PCR的操作要领和用途有一个基本的了解,在此基础上,为有条件的专业和院校设置了荧光适时定量PCR实验(qRT-PCR),进一步提高学生的理论和实践技能.

实验四、常规PCR技术【实验目的】1.
学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则2.
了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响3.
掌握PCR的基本操作【实验原理】PCR(polymerasechainreaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应.
在分子生物学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面,是分子生物学中一项极为常用的技术.

PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应.
两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的3'端互补,由此限定扩增片段.
PCR反应由一系列的变性-退火-延伸反复循环构成[图2-X],即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低的温度下同过量的引物退火,再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸.
由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加.
理论上,经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率不可能达到100%,实际上要少些,通常经25~30次循环可扩增106倍(图7-1),这个量足够分子生物学研究的一般要求.

(一)PCR引物设计1.
Tm值Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数,是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50%的引物与模板配对,而另外50%的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55℃.
合适的引物选择应需考虑到以下因素,如Taq酶的最适温度(TE)和Tm值等.
最常用的Taq酶的最适温度范围为70℃~74℃,根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta).
这个温度范围应不高于酶的最适反应温度,也不能比TE-25℃更低.
这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时,酶的合成反应会非常缓慢,但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增.
所以Ta的选择应满足TE-25℃G=C>A.
即当引物3′末端为A时,即使有错配碱基也最不易延伸,所以引物设计时可将3′末端设计为A,以提高复制精确性.
另一种理论是3′末端应设计为G或C,因为G和C的氢键多于A与T,能更好地与模板结合开始DNA合成,当然对错配延伸效率方面就不能苛求了.
总而言之,引物的3′末端不要考虑使用T.

5.
引物无发卡结构引物自身应无发卡结构.
6.
二引物自身之间不能配对二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基,特别是在引物的3′末端.
二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同,若发生这种情况会形成引物二聚体,造成扩增失败.
一般引物自身配对形成茎环结构,茎的碱基对数不大于3,两条引物间配对碱基数小于5个.

7.
二引物的Tm值引物设计时应注意使二引物的Tm值相近,否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度,将会影响PCR扩增效果.
能同时达到最佳退火温度,将会影响PCR扩增效果.
由于影响引物设计的因素比较多,所以常利用计算机来辅助设计,通常可用Primer5.
0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计.
(二)PCR反应条件1.
PCR缓冲液常用的1*PCR缓冲液为10mmol/LTris-HClpH8.
3(常温),50mmol/LKCl,1.
5mmol/LMgCl2.
由试剂公司与Taq酶一起提供.
(1)Mg2+离子浓度:Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大,因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关.
Mg2+一般使用浓度为0.
5mmol/l~2.
5mmol/l,必要时可以0.
5mmol/L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验.
(2)dNTP:常用dNTP浓度为20μmol/L(可用范围为20μmol/l~200μmol/l).
dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关,dNTP量过少时合成的产物减少.
(3)K+离子浓度:PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火,一般使用浓度是50mmol/L,但当K+离子浓度高于50mmol/L时会抑制Taq酶活力.
(4)pH值:PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统.
Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数(0.
021pH/℃),20℃时pH为8.
3的缓冲液在72℃延伸反应时,实际pH值降低至7.
2.
而Tricine的温度系数较高,在扩增长片段时用Tricine系统.
(5)保护剂:由于PCR反应体系中蛋白的含量极低,所以加人的酶非常容易变性,通常需加入一定量的保护剂.
如5mmol/l的二硫苏糖醇(DTT),100μg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)或0.
01%的明胶.
加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显.
2.
模板PCR模板可以是DNA或RNA,RNA需反转录后再扩增.
模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA,当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大.
每个PCR反应中加入的模板数量可在102~105分子之间,必要时可低至50个分子,模板的量少时应酌情增加循环次数.
小于100ng的哺乳动物细胞基因组DNA(相当于约104个细胞),经30个循环,10%的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带.
使用较大量的模板时,循环数可减少;如果模板量很少,可能需要增加至45个循环反应.

3.
引物浓度常用引物浓度为0.
1μmol/l~0.
5μmol/l.
随着引物浓度的降低,PCR反应的特异性提高但产物得率降低;随着引物浓度的升高,情况正好相反.
4.
PCR反应中的酶Taq酶最早是从水生嗜热菌(thermusaquaticus)中分离得到的,该酶的最适温度是72℃,在94℃时相当稳定,半衰期长达38min.
由于这种酶使用最早最广泛,文献中所列各项最适反应条件都是针对此酶优化的,使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作.
【实验材料】1.
仪器PCR仪,微型水平电泳槽,电泳仪,微量移液器、PCR管、台式离心机、微波炉或电炉等.
2.
试剂(1)50*TBE电泳缓冲液:Tris242g,乙酸57.
1ml,0.
5mol/LEDTA(pH8.
0)100ml,加H2O到1000ml,高压灭菌后备用.
(2)10*PCR缓冲液:KCl500mmol/l,Tris-HCL(pH8.
3)100mmol/l,MgCl215mmol/l,明胶,0.
1%.
(3)5*溴酚蓝上样缓冲液.
(4)PCR反应物:Primer,模板,Taq酶,4种dNTP混和液2.
5mmol/l.
【实验步骤】1.
在PCR仪上设置好程序.
2.
在两个灭菌的0.
5ml离心管中,按加样表的顺序加样,建立50μl反应体系.
管1:模板DNA.
管2:对照DNA(阳性对照或空白对照).
表2-29PCR实验加样表成分体积终浓度10*PCRBuffer5μl1*dNTP(4种混合物)5μl每种0.
2mmol/l10μmol/lPrimerl(上游)2.
5μl0.
5μmol/l10μmol/lPrimer2(下游)2.
5μl0.
5μmol/l模板DNA1μl~10μl~1μgTaqDNA聚合酶0.
5μl2.
5UddH20至50μl3.
94℃变性5min.
4.
短暂离心,加0.
5μlTaqDNA聚合酶(2~2.
5U/μl),混匀.
(用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖一滴液体石蜡油,改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖.
)5.
放在PCR仪上进行PCR反应.
Step194℃,1minStep255℃,1minStep372℃,1min循环25~30次,Step472℃最后延伸5min.
6.
取2~3μlPCR反应液及1μl上样缓冲液混合,进行琼脂糖电泳(5V/cm),选择适当大小的DNA分子量标准,检查扩增产物.
紫外观察,必要时拍照.
【注意事项】1.
PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的,因此,在进行PCR前,模板的纯化和引物设计尤为重要.
2.
Mg2+对TaqDNA聚合酶的活性影响很大,有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时,不妨适当增加Mg2+的浓.
3.
模板和引物的浓度要适量,并不是越多越好,否则,会出现非特异条带.
【思考题】1.
PCR中怎样预防出现假阳性结果2.
什么是Tm值有何用途如何计算3.
引物设计应遵循什么原则4.
你会使用哪种引物设计软件实验五、定量PCR技术【实验目的】1.
了解定量PCR的原理2.
学习定量测定基因表达量的PCR技术【实验原理】所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
在使用荧光进行PCR定量时,荧光信号与产物模板数成一一对应的关系,检测荧光的信号就可以对PCR产物定量.
实时PCR的原理是利用循环阈值(cyclethreshold,Ct)进行定量.
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小[图7-2].
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值[图7-3].
因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.

Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
而所设阈值都很低.
换言之,Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析.
由于是低浓度,影响因素小,误差没被放大,所以具有良好的重现性.
固定循环数后,荧光信号与模板数成正比,但当固定荧光信号值后,模板数就与循环数成反比.

实时PCR荧光技术分2个基本类型:基于荧光探针的方法和基于双链DNA分子结合荧光染料的结合法,后者相对简单、经济,本实验采用荧光结合法.
其原理是:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步(图7-4).

【实验材料】1.
仪器微量移液器(加样枪),实时荧光定量PCR仪(ABI7000或其它型号),水平电泳槽、电泳仪、紫外分析仪(或凝胶成像系统).
2.
试剂(1)含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒或cDNA.
(2)内参照通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定,受环境因素影响小.
(3)SYBR、引物、dNTP、Taq酶、10*PCRbuffer、ddH2O、MgCl2.
(4)琼脂糖.
【实验步骤】SYBRGreenI-标准曲线法-相对定量(一)标准品和内参照:将标准品和内标准品做10倍系列稀释.
(二)RealtimePCR扩增:1.
配MasterMix,管家基因、目的基因各一管.
表2-30定量PCR实验加样表成分体积终浓度Buffer5μl1*MgCl24μl2mmol/ldNTPs4μl每种200nmol/lPrimer(Sp+As)1μl0.
4μmol/lPrimer(As)1μl0.
4μmol/lTaq聚合酶0.
3μl1.
5USYBR2.
5μl1*ddH2O到50μl如果要做N管,在一个1.
5mL或更大体积的管子中,依次加入从ddH2O到SYBR的每个试剂,体积为:N*单份体积.
充分振荡,使成分均匀.
2.
在PCR管中加入模板DNA和MasterMix,振荡,离心.
标准品2μl,cDNA1μl.
3.
把反应管放入仪器,操作ABI7000软件.
(1)选择样品的位置和类型.
打开"File"→"new",点击下方的"next"→选择探针SYBR→Add→选择样品的位置→在JYX-2前打"√"→选择样品的类型:"Task"中对应不同样品选择"standard"(标准品)、"unknown"(待测样品)、"NTC"(notemplatecontrol无模板对照).
(2)打开主机电源,点击对话框下方"Finish".
(3)给标准样品设值:"Quantity",比如:1.
0e-1,1.
0e-2,1.
0e-3,1.
0e-4,1.
0e-5.
(4)点击"Instrument"编辑热学过程,一般是:Stage1:94℃2minStage2:94℃45sec60℃45sec40循环Stage3:62℃-92℃缓慢升温,产生熔点曲线"samplevolume"中输入样品体积.
"datacollection"中选择荧光收集步骤.
(5)保存文档设置,接着点击"start",realtimePCR整套设备开始自动运行.
PCR开始并且荧光数据被收集.
(6)查看结果,简单分析.
点击Result/"AmpPlot"选项卡,看扩增曲线.
在扩增曲线界面中设定Baseline范围和Threshold数值.
在Analysis菜单选择"analyze",出现对扩增曲线的分析.
点击Result/"standardCurve"选项卡,出现标准曲线.
4.
琼脂糖电泳PCR产物,看扩增子的纯度.
5.
更为详细的数据处理,包括误差分析.
根据标准曲线,求出待测cDNA中各种基因(模板)的原始数量(浓度)对标准品的比值.
归一化(标准化处理):每份cDNA中目的基因量除以管家基因量.
计算一个目的基因(转录水平)在不同cDNA样品中相差的倍数公式为:Folds=[C1(处理样本,待测基因)/C2(处理样本,内参基因)]÷[C3(对照样本,待测基因)/C4(对照样本,内参基因)]C1-C4:根据标准曲线把Ct转换为原始模板浓度【注意事项】1.
在冰上操作,保持试剂的活性.
2.
因为SYBR荧光染料的缘故,要避免中强光照射.
3.
在移液准确的前提下,尽量缩短操作时间,减少非特异扩增.
【思考题】1.
实时荧光定量PCR的原理是什么2.
查文献,看看除了SYBR外还有哪些方法或试剂可以用于qRT-PCR的荧光信号检测其作用机理是什么第七节分子克隆技术分子克隆(molecularcloning)又称基因克隆(genecloning)或DNA重组(recombinantDNA)技术,是指应用酶学的方法,在体外将一个基因或基因片段剪切并与载体连接,组装成一个新的DNA分子,再将这个重组DNA分子导入适当的宿主细胞,使其在宿主细胞中复制,形成大量的子代分子的过程.
利用DNA重组技术可以获得特定DNA片段的大量拷贝,以便分析基因的结构与功能,达到人为改造细胞遗传与性状的目的.

自1973年美国斯坦福大学Berg领导的研究小组建立第一个重组DNA以来,该技术便得到了突飞猛进的发展,如今已成为包括基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等众多分子生物学研究领域中最基本的技术手段.
DNA重组技术基本步骤包括:①目的基因的获得;②目的基因与载体的连接;③重组DNA分子导入受体细胞;④筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆.
其中限制性内切酶与DNA连接酶的发现与应用是DNA重组技术得以建立的关键.
具体涉及的实验包括DNA的限制性酶切;限制性酶切DNA片段的纯化回收;外源DNA与载体的连接;感受态细胞的制备;重组DNA转化与筛选.
本节就分子克隆技术所涉及的这些实验进行介绍和说明.

实验六、DNA的限制性酶切与电泳【实验目的】了解限制性内切酶的概念及其在生物工程技术中的应用.
掌握限制性内切酶酶切DNA分子的基本原理和实验方法.
掌握凝胶电泳分离纯化DNA的基本原理和实验方法.
【实验原理】(一)DNA的限制性切酶限制性内切酶(restrictionendonuclease,RE),简称限制酶,是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸内切酶,为原核生物特有,用于抵抗外来DNA的侵袭.
这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展,是体外剪切DNA片段的主要工具,DNA序列测定、探针的制备及杂交、基因诊断等皆离不开限制酶的应用.
酶切目的不同、基因片段插入位点的不同,可选择不同的酶切反应.
小量的酶切反应主要用于质粒DNA的酶切鉴定;大量的酶切反应主要应用于大量制备基因片段;若基因片段插入位点两端的酶切位点不同,则需要进行双酶切反应.
双酶切要注意酶切缓冲液是否一致,如果两种酶的缓冲液不同,原则上由低盐缓冲液的限制酶先进行酶切,待酶切结束后再补加高盐缓冲液和相应酶继续切割工作.

现已从不同的细菌中提取出二千多种限制酶,很多已商品化.
分子克隆中常用的是Ⅱ型酶,都以双链DNA为底物,以Mg2+为辅助因子,并要求有一定的盐离子浓度.
Ⅱ型酶有高度特异的碱基识别序列和切割点,例如,EcoRⅠ酶的识别序列和切割点为:G↓AATTC;HindⅢ酶的识别序列和切割点为:A↓AGCTT;ScaⅠ酶的识别序列和切割点为AGT↓ACT,分别能产生粘末端或平末端的DNA片段.
用EcoRⅠ和HindⅢ同时酶切含两个单一酶切位点的环状双链DNA分子,就产生两条带相应酶切位点的线性DNA分子.
一般在反应缓冲液中加入二硫苏糖醇(DTT)防止限制酶氧化,保持酶活性.
反应结束后,经琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果,用EDTA螯合Mg2+或加入0.
1%SDS使酶变性而终止反应,也可加热或用酚/氯仿抽提.
(二)电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳.
其中,凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法.
与蛋白质分子类似,核酸分子也是两性解离分子.
在pH3.
5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电荷,在电场中向负极泳动;在pH8.
0~pH8.
5时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动.
不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开.
所以采用适应浓度凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离的目的.
值得注意得是,等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等.

1.
影响电泳的四大因素(1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质:包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构.
一般来说颗粒带电荷的密度越大,泳动速率愈快;颗粒物理形状愈大,与支持物介质摩擦力越大,泳动速度越小.
即泳动率与颗粒的分子大小,介质粘度成反比;与颗粒所带电荷成正比.
在检测未知DNA分子量时,DNA分子的空间构型不同,即使相同的分子量其迁移率也不同.
如质粒DNA存在闭环(Ⅰ型,CC),单链开环(Ⅱ型,OC)和线型(Ⅲ型,L).
三者之间的迁移率,一般为Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型,但是有时也会出现相反的情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度及溴乙锭染料含量有关.
当胶浓度较高或电场强度较大时,Ⅰ型DNA与Ⅲ型DNA互换位置,而Ⅱ型DNA总是迁移最慢.

(2)支持物介质:DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料:琼脂糖和聚丙稀酰胺凝胶.
通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛孔大小,分离不同分子量的核酸片段.
聚丙稀酰胺凝胶的孔径小,分离小片段(5bp~500bp)DNA,效果最好,其分辨率极高,相差1bp的DNA片断也能分开,采用垂直装置在恒定电场下电泳.
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分辩范围广,用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分辩长度为200bp至近50kb的DNA,琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳.
因此,选用不同的凝胶种类和浓度可以分辨大小不同的DNA片段.
(3)电场强度:电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度.
电场强度愈大,带电颗粒的泳动速率愈快,但凝胶的有效分离范围随电压的增加而减小.
在低电压时,线性DNA分子的泳动率与电压成正比.
一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm;对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.
5V/cm~1.
0V/cm电泳过夜,以取得较好的分辨率和整齐的带型.
电压1000V~2000V,电场强度20V/cm~600V/cm的电泳为高电压电泳,必须用聚丙稀酰胺做介质.
(4)电泳缓冲液离子强度:缓冲液是电泳中的导体,它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率.
Tris-Cl缓冲体系中,由于Cl-的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以常利用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系.
缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度,缓冲液pH值与DNA样品等电点相距越远,样品所携带电荷量越多,泳动速度越快.
DNA电泳缓冲液,常采用偏碱性或中性条件,使核酸分子带负电荷,向正极泳动.
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比,电泳的最适离子强度一般在0.
02~0.
2之间.

2.
指示剂电泳过程中,常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程.
核酸电泳常用的指示剂有溴酚蓝和二甲苯青,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的移动速率为二甲苯青的2.
2倍,而与琼脂糖浓度无关.
以0.
5*TBE作电泳缓冲液时,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的泳动速率约与300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长度4kb的双链线状DNA相同.
在琼脂糖浓度为0.
5~1.
4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不明显.
指示剂一般加在凝胶加样缓冲液中,为了使样品能沉入胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重,以确保DNA均匀进入样品孔内.

3.
染色剂核酸需要经过染色才能显示出带型,最常用的是溴乙锭染色法.
溴乙锭(ethidiumbromide,EB)是一种荧光燃料,这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光.
EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍,因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型.
通常可以在凝胶中加入终浓度为0.
5μg/ml的EB,这样在电泳过程中可以随时观察核酸的迁移情况,这种方法适用于一般性的核酸监测.
也可以在电泳结束后用0.
5μg/ml的EB溶液染色10min~15min后进行紫外观察,由于EB在可见光下易分解,故应存棕色瓶中于4℃条件下保存.
[注意]:EB有潜在的致癌危险,操作时必须戴乳胶手套或一次性手套.
以下介绍DNA片断的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶1.
DNA片断的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖,其结构单元是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖.
大量琼脂糖依靠氢键等次级键相互盘绕形成绳状琼脂糖束,构成大网孔型凝胶.
当其加热至90℃左右时,即形成清亮、透明的液体,在40℃~45℃凝固.
将溶化胶液倒入胶模中,固化后形成一种固体基质.
接通电源后,在中性pH条件下,带负电荷的DNA分子可通过琼脂糖凝胶从负极向正极泳动.
除电荷效应外,凝胶介质还有分子筛效应,泳动迁移率与分子大小及构象有关.
线状DNA分子在电场中的迁移率与分子量的对数值成反比,分子量越大,摩擦阻力越大,越难在凝胶孔隙中穿行,因而泳动迁移越慢.
据此,DNA分子可在凝胶中获得有效分离并测得其分子量的大小.

不同浓度的琼脂糖凝胶有不同大小的孔径,为使迁移率与DNA分子的碱基对数目的对数成反比,从而比较准确地测出分子量,应根据需要选择不同浓度的凝胶,一般分子量越大,选用低浓度越小.
表2-31琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围凝胶中琼脂糖含量[%(W/V)]线状DNA分子的有效分离范围(kb)0.
35.
0~600.
61.
0~200.
70.
8~100.
90.
5~71.
20.
4~61.
50.
2~42.
00.
1~3用荧光染料溴化乙锭(EB)对凝胶染色,通过与已知浓度的标准品比较,可确定DNA在凝胶中的位置,并估计出待测样品的浓度.
2.
DNA片断的聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是通过丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在一个适当的游离基催化下,丙烯酰胺聚合成链并交联,共聚而成的高分子多孔化合物.
通常用过硫酸铵作催化剂,四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂.
聚丙烯酰胺凝胶孔径大小与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度有关,这种孔径与琼脂糖凝胶的密度不同,只有小分子DNA能够进入.
一般用于分离小于1kb的DNA片断,也须根据分离物质的分子量范围选择适当的凝胶浓度表2-32聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的有效范围丙烯酰胺浓度[%(W/V)]有效分离范围(bp)二甲苯青FF*溴酚篮*3.
5100~10004601005.
080~500260658.
060~4001604512.
040~200702015.
025~150601520.
06~1004512*二甲苯青FF和溴酚蓝两种指示剂在同样迁移率时相当于双链DNA分子的大小常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用垂直进行,原因是空气中的氧能抑制丙烯酰胺的聚合反应,故在封闭的双玻璃平板夹层中灌胶后,与氧接触的部位大大减少,仅顶层部分的凝胶受到氧的抑制.
聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶比较有3个主要的优点:①分辨力很强,长度仅仅相差1bp的DNA也可以分开;②所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶:多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽(1cm*1mm)而不至于显著影响分辨率;③从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高,可适用于要求最高的实验.
【实验材料】1.
仪器:台式离心机,恒温培养箱,微波炉,水平式凝胶电泳槽,垂直式凝胶电泳槽,稳流稳压电泳仪,紫外透射仪,凝胶成像系统,点样梳,微量加样器,Eppendorf管,吸嘴,胶带纸.
2.
试剂:(1)纯化的pUC18质粒DNA(0.
2mg/ml).
(2)限制性内切酶(EcoRⅠ酶;ScaⅠ酶).
(3)10*限制性内切酶缓冲液(购酶时随附).
(4)双蒸水.
(5)琼脂糖(电泳级).
(6)5*TBE(电泳时稀释10倍):称取54gTris碱,27.
5g硼酸,加蒸馏水约900ml使完全溶解,再加入0.
5mol/LEDTA(pH8.
0)溶液20ml,定容至1L.
(7)λDNA/HindⅢ分子量标准参照物.
(8)溴化乙锭(EB,10mg/ml)(贮存液):在100ml蒸馏水中加入1g溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中,室温保存.
(9)6*凝胶加样缓冲液:0.
25%溴酚篮,0.
25%二甲苯青FF,30%甘油.
(10)1mol/L二硫苏糖醇(DTT)(贮存液):用20ml0.
01mol/L乙酸钠溶液(pH5.
2)溶解3.
09gDTT,过滤除菌后分装成1ml/管,贮存于-20℃.
(11)0.
5mol/LEDTA(pH8.
0)(贮存液):在800ml蒸馏水中加入186.
1g二水乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Na2·2H2O),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调pH值至8.
0(约20gNaOH颗粒)后定容至1L,分装后高压灭菌用备.
(12)30%丙烯酰胺:将29g丙烯酰胺和1gN,N'-甲叉双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的蒸馏水中,加热至37℃溶解,补加蒸馏水至100ml(pH≤7.
0),过滤除菌,置棕色瓶中于4℃保存,一般可使用两个月.
(13)10%(W/V)过硫酸胺:将1g过硫酸铵溶解于10ml双蒸水中,4℃保存备用.
(14)TEMED.
【实验步骤】(一)质粒DNA的限制性酶切1.
设计pUC18质粒EcoRⅠ酶和ScaⅠ酶单切及双酶切反应:在灭菌的三支新的0.
5mlEppendorf管中按下表依次加入下列试剂(总体积20μl)表2-33pUC18质粒的酶切反应体系EcoRⅠ单酶切管ScaⅠ单酶切管EcoRⅠ和ScaⅠ双酶切管ddH2O12μl12μl11μl10*限制酶切缓冲液2μl2μl2μl质粒DNA5μl5μl5μlEcoRⅠ酶1μl(1~2U)1μl(1~2U)ScaⅠ酶1μl(1~2U)1μl(1~2U)混匀,快速离心5秒,以集中样品.
2.
酶切:37℃,1h~2h.
3.
鉴定:用等量未酶切的DNA作对照,琼脂糖凝胶电泳检测以上各酶反应管酶切完全程度,决定是否终止反应.
4.
终止:加入10mmol/LEDTA或65℃加热20min以终止反应,也可以用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀DNA.
各种酶切过的pUC18质粒DNA于-20℃保存,备后面实验用.
(二)DNA片断的凝胶电泳1.
DNA片断的琼脂糖凝胶电泳(适用于分离200bp~50kb的DNA分子)(1)用胶带纸将洗净、干燥的凝胶模具两端口封好,插好点样梳.
(2)称取一定量的琼脂糖,用电泳缓冲液(0.
5*TBE)配制适当浓度,微波炉加热溶解.
(3)待凝胶冷却至50℃左右(手感能耐受),在凝胶中加入EB至终浓度0.
5μg/ml,摇匀后将凝胶缓慢倒入模具中,厚度为3mm~5mm,检查有无气泡.
室温放置30min~50min,使其凝固.
若为低浓度凝胶,应放入4℃冰箱加速凝固,增强硬度.
(4)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色.
(5)小心移去点样梳,撕去胶带纸,将模具放入电泳槽中,加样孔在负极端.
(6)加入0.
5*TBE电泳缓冲液,液面高出凝胶表面1mm~2mm,注意加样孔不可有气泡,以免影响加样.
(8)在DNA样品中加入1/6体积的6*凝胶加样缓冲液并混匀.
(9)用微量加样器将DNA样品加入梳孔中.
电泳样品为:酶切样品;酶切前的对照样品;分子量标准参照物.
(10)接通电源线,开启电源开关,调电压,开始时可先采用高压(10V/cm,按两极间距离),待指示剂移入凝胶后,再以1V/cm~5V/cm继续电泳,至溴酚篮移到凝胶前沿约1cm处,停止电泳,一般需要30min.
若要制备较好的电泳图谱,采用小电压,长时间电泳(甚至过夜),可取得较好分辨率和整齐的带型.
(11)切断电源后,含EB的胶可以直接于紫外灯下观察结果或拍照记录;不含EB的胶用含EB为0.
5μg/ml的电泳缓冲液染色10min~15min后再观察结果或拍照记录.
2.
DNA片断的聚丙烯酰胺凝胶电泳(适用于分离5bp~500bp的小分子DNA)(1)准备:准备好用于灌胶的玻璃板、有机玻璃垫片和点样梳,用洗涤剂清洗,自来水、双蒸水依次冲洗、烘干或晾干,将两块玻璃板和垫片压好,用胶带纸封上,尤其要注意玻璃板的转角处.
(2)配胶:根据玻璃板的大小和垫片厚度计算所需丙烯酰胺溶液的体积,依所分离的DNA大小确定凝胶的浓度,按下表操作,配好胶后每100ml加35μl的TEMED,混匀.
表2-34制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积试剂制备不同浓度(%)凝胶所用试剂量3.
5%5.
0%8.
0%12.
0%20.
0%30%丙烯酰胺11.
616.
626.
640.
066.
6蒸馏水67.
762.
752.
739.
312.
75*TBE20.
020.
020.
020.
020.
010%过硫酸胺0.
70.
70.
70.
70.
7(3)灌胶:配好胶液后,用50ml注射器吸取胶溶液,排除气泡,插入两块玻璃板空隙处,连续注入,不时轻敲玻璃板,让气泡上浮,直至灌满模具顶部.
若有气泡产生或渗漏,则将凝胶倒出,把平板洗净后重新灌胶.
灌胶时将模具放置成10°角,以减少泄漏并最大限度减少凝胶的变形.

(4)插梳:立即插入合适的点样梳,密切注意不要让梳齿将气泡带入,且点样梳不要全部插入胶内,约留2mm以免拔梳时破坏胶孔桥,检验有无凝胶泄漏.
(5)聚合:室温下放置约放置30min聚合完全.
(6)固定:拔出梳子,立即以水冲洗样品孔,去掉胶带纸,将凝胶板放入垂直电泳槽中固定好,加1*TBE于上下两电泳槽中,用湾头吸管驱除凝胶底部的气泡,用1*TBE再次冲洗加样孔,去出可能存在的未聚合的丙烯酰胺和气泡.

(7)加样:在DNA样品中加入1/6体积的凝胶加样缓冲液,混匀,用微量注射器小心加入加样孔内,速度要快,避免样品扩散,不要产生气泡以免冲散样品.
(8)电泳:接通电极(正极接下槽,负极接上槽),开启电源,以1V/cm~8V/cm电压电泳,至指示剂迁移到所需位置,停止电泳.
(9)接胶染色:取下玻璃板,小心撬起一角,移取未附着凝胶的玻璃板和垫片,用EB染色凝胶中的DNA分子.
(10)拍照或放入胶带中保存.
【注意事项】(一)质粒DNA的限制性酶切1.
整个操作必须严谨,所用物品全部高压灭菌,吸液要准确,避免交叉污染.
2.
不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度,但不同的酶达到最佳酶切效率的盐浓度不同.
如果盐离子浓度使用不当,会使酶的识别位点发生改变,例如当盐离子浓度低于50mmol/L时,EcoRⅠ内切酶的专一性就降低,只能识别中间的四个核苷酸序列(称该酶为EcoRⅠ*).
即每种限制酶都有其最佳反应条件,应严格遵照产品说明书操作.
3.
用于酶切的质粒DNA纯度要高,溶液中不能含有痕量酚、氯仿、乙醇、EDTA等内切酶抑制因子,否则会导致DNA切割不彻底.
4.
样品加入的次序为水、缓冲液、质粒DNA,混匀后最后加酶,不应颠倒.
加酶步骤要在冰浴中进行,且加酶操作要迅速,用后立即放回低温冰箱中;加酶后要避免剧烈振荡,否则易使限制酶变性.
5.
尽可能地降低反应总体积,增大酶与底物间的碰撞机会,增加反应速度.
严格控制内切酶的用量在总反应体积的1/10以内,否则,甘油浓度过高会抑制酶活性.
6.
酶切要完全,在37℃,绝大多数酶切反应时间为60min~2h.
一般说来,如酶的纯度不佳,酶切时间不能太长,以免产生一些非专一性切割.
7.
内切酶一般都保存在50%甘油的缓冲液中.
当保存在10%甘油中时,酶活力丧失更快.
8.
酶解的数量要适当,在设计酶解DNA的数量时,除了根据连接与转化的要求外,同时还要考虑到DNA每经一步处理,就得重新纯化,这样DNA浓度的损失量几乎达到50%.
并且每经一步操作后,都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品.
因此,在设计酶解数量时,不能用量太少,但是酶解数量过多,势必要消耗大量限制性内切酶和DNA,这也是不必要的.

9.
至于酶的用量,一般的做法是控制1U酶在15μl~20μl中酶解1μgDNA,但具体地分析应该对不同的DNA,酶的用量有所不同,如EcoRⅠ酶对4.
3kb的pBR322有一个切点,而对14.
5kb的pXZ6有两个切点,如果不考虑其他构型的影响,则每微克pBR322的酶用量与每微克pXZ6的用量之比应该为1.
69:1(酶单位).
10.
双酶切时需要注意以下几点:①如果所用两种酶的反应条件完全相同(温度、盐离子浓度等),那么,可以将它们同时加到一个试管中进行酶切.
②如果所用的两种酶对温度要求不同,那么要求低温的酶先消化,即在第一个反应结束后,加入第二个酶,升高温度后继续进行酶切.
③如果两种酶对盐离子浓度要求不同,则要求低盐的酶先消化,要求高盐的酶后消化,具体方法是:在低盐缓冲液中加入第一个酶,反应结束后,补加1/10体积的高盐缓冲液,加入第二个酶再消化,或第一个反应结束后抽提DNA,再用高盐缓冲液酶切.
目前,各试剂商都提供了双酶切缓冲液或通用缓冲液,可以根据说明书进行操作.

11.
酶切反应后,若不需进行进一步的酶学反应,加EDTA灭活限制酶;若仍需进行下一步反应(如连接、限制酶切等),可采用65℃保温20min,方法简单但对某些酶灭活不彻底;用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀,最有效且有利于下一步DNA的酶学反应.
(二)DNA片断的凝胶电泳1.
DNA片断的琼脂糖凝胶电泳(1)加热溶解琼脂糖最好在微波炉中进行,既可使瓶壁上的琼脂糖颗粒完全溶解,又可防止水分蒸发过多而改变琼脂糖浓度.
但加热时间不可过长,一般2min左右,容器最好用三角瓶,以1/3以下容器体积的液体为好.
加热时用滤纸塞于瓶口,留出缝隙,以防瓶盖在加热时被蒸气冲开.
(2)灌胶时要避免产生气泡,若有气泡用吸管吸去;加样时吸嘴不必插入孔中(切不可破坏凝胶孔壁,否则DNA带型不整齐),对准加样孔在上方加样即可,样品会自动下沉,否则会插入凝胶中而阻塞管头;上样量不可过多,过多会溢出而导致交叉污染,影响分析结果.

(3)电泳槽中的缓冲液与配胶的缓冲液应为同一批次,否则易引起离子强度和pH不一致而影响核酸的迁移.
(4)电泳时注意去除模具两端的胶带和正负极的对接.
(5)EB为强诱变剂,有毒性,操作时必须戴手套,注意防护;沾有EB的物品不能随意丢弃,需投入制定地点,处理后才可舍弃!
(6)紫外线对眼睛有伤害,观察时要注意防护.
(7)目前在琼脂糖凝胶电泳中一般采用水平电泳槽,其优点是:①从底部支持凝胶,即使低浓度凝胶也可方便使用,不易破裂;②可制备不同形状大小的胶体;③两电极间电泳槽相通,缓冲液不会有太大的差异.

(8)电泳槽有大、中、小之分,大型槽电泳时间较长,但上样量较多,可分析较多的样品,且分离效果较好,适用于酶谱分析.
(9)常用电泳缓冲液有TAE、TBE、TPE三种缓冲体系,都能保证较稳定的pH值,且都加有EDTA螯合二价离子,抑制DNA酶而保护DNA.
但TAE缓冲能力较弱,TPE中的磷酸盐会混入DNA中而影响后续步骤,故TBE为首选.

(10)加入凝胶加样缓冲液的目的是①增加样品密度,确保DNA均匀进入点样孔;②使样品显现颜色,从而更有利于加样操作;③作为前沿指示剂,决定何时停止电泳(溴酚篮在不同浓度凝胶中迁移率基本相同,与300bp双链DNA分子迁移速度相近).
(11)EB染料直接放入凝胶中,其优点是随时观察DNA的迁移情况,极为便利,但会有EB污染电泳槽.
此外,也可在电泳后染色(凝胶中不放EB,取出凝胶在含0.
5μg/mlEB的电泳缓冲液中染色20min~30min,这种方法更能确切测出DNA分子量大小.
(12)提取的质粒DNA样品,若还有染色体DNA、RNA或蛋白质,通过琼脂糖凝胶电泳也可观察到.
如蛋白质与DNA结合,在点样孔会产生荧光亮点;RNA未处理完全,在DNA条带前会有云雾状的亮带,由此可分析样品的纯度.

(13)琼脂糖凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可鉴别分子量相同但构型不同的DNA分子.
在通常情况下,电泳后质粒DNA常存在闭环、线性和开环三种构型,迁移率依次递碱.
2.
DNA片断的聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)清洗玻璃板时一定要冲洗干净,否则残留洗涤液可能导致染色背景偏深,影响结果观察,同时应避免手指上的油污污染干净的玻璃板.
(2)为减少灌胶时产生气泡,防止凝胶与玻璃板的粘连,减少电泳后揭胶时凝胶发生撕裂,可在灌胶前硅化玻璃,即用Sigmacote硅化油涂布玻璃板,目的是减少灌胶时的气泡,防止凝胶与两块玻璃板的过分粘连,电泳后撤除玻璃板时不至于撕裂凝胶.

(3)凝胶中不能有气泡,因电泳时DNA遇到气泡会绕道迁移挤压旁边的区带,从而影响DNA分子区带的形状和迁移方向.
故玻璃板一定要清洗干净,灌胶操作一定要连续,灌胶前胶液可抽真空以去除溶液中的气泡.
胶一般制成0.
5mm~2mm厚,过厚的凝胶因产热而导致DNA带型的不整齐.
(4)丙烯酰胺有强烈的神经毒,可经皮肤吸收,其作用具累积性,故称取时必须戴手套和面具,取用含上述化学药品溶液时也应戴手套.
聚丙烯酰胺一般认为无毒,但为防止可能含少量未聚合的丙烯酰胺,还是应小心操作.

(5)拔出梳子后,用水冲洗样品孔的步骤不能少,因梳子取出后,梳子上吸附的和胶顶部未聚合完的丙烯酰胺会流入样品孔,再聚合而使样品孔底形状不整齐,最终导致电泳带型的不整齐.
(6)聚丙烯酰胺凝胶会粹灭EB的荧光,不能检出少于10ng的DNA区带,故采用银染法灵敏度更高.
【思考题】1.
什么是星号活性2.
DNA的酶切实验要注意哪些问题3.
双酶切缓冲液应满足什么条件如何解决4.
使用EB时应注意什问题5.
DNA凝胶电泳常用哪几种缓冲液,为何不用Tris-Cl缓冲体系6.
DNA样品为何要与凝胶加样缓冲液混合后再加入加样孔中7.
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳各有何特点在电泳时各应该注意些什么问题8.
如果DNA样品中残留有蛋白质或RNA,电泳后会出现什么结果实验七、凝胶中DNA片断的纯化回收【实验目的】1.
了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法.
2.
掌握低熔点琼脂糖胶法纯化回收DNA片段的原理,并根据实际情况选用合适的方法,从琼脂糖凝胶中回收待连接的载体及外源DNA片段.
【实验原理】DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术,可收集特定酶切片段用于克隆或制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等.
回收实验两个最重要的技术指标是产物的纯度与回收率:纯度未到达时会严重影响以后的酶切、接连、标记等酶参与的反应;回收率不理想时往往会大大增加前期工作量.
以下是三种常用的从琼脂糖凝胶中纯化回收DNA片断的方法.

1.
低熔点胶法:低熔点胶是向普通琼脂糖的多肽链上引入羟乙基形成的,这一变化会使凝胶的熔化与凝固点均降低.
低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化,这一温度尚不足以使DNA分子变性.
操作时可先灌一块普通胶,然后用低熔点胶取代其中的回收部分.
割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化,再加入等体积的酚抽提去除凝胶.
低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切、连接、标记等酶反应.
因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质,并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态.

2.
玻璃粉(乳)法:将胶条割下移入离心管并加入NaI溶液浸泡,剧烈振荡数分钟促使溶胶.
向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉(乳),室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上.
离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温,洗脱吸附于玻璃粉上的DNA,再次离心收集含DNA的上清液即可.
玻璃粉法适用于回收0.
4kb-1kb的小分子片段,可达80%的回收率.
3.
QIAgenDNA片断回收试剂盒:由于凝胶溶于含NaI的溶液,DNA能转一地与离心柱中纤维素结合.
结合后的DNA经洗涤除去杂质,最后在低盐缓冲液中经离心从纤维素上洗脱下来.
【实验材料】1.
仪器:水平式凝胶电泳槽,稳流稳压电泳仪,制胶模具,点样梳,紫外透射仪,台式离心机,恒温水浴锅,微波炉,手术刀片,微量移液器,Eppendorf管,吸嘴,胶带纸.
2.
试剂:(1)琼脂糖,低熔点琼脂糖.
(2)0.
5*TBE电泳缓冲液.
(3)6*凝胶加样品缓冲液:0.
25%溴酚篮,0.
25%二甲苯青FF,30%甘油.
(4)无菌水.
(5)质粒pUC18的双酶切(EcoRⅠ+ScaⅠ)产物.
(6)溴化乙锭(EB,10mg/ml).
(7)凝胶平衡缓冲液:20mmol/LTris-Cl(pH8.
0),1mmol/LEDTA(pH8.
0).
(8)饱和的酚(用pH8.
0的0.
1mol/LTris-Cl缓冲液饱和).
(9)氯仿.
(10)10mol/L醋酸铵:将770g醋酸铵溶解于800ml水中,加水定容至1L后过滤除菌.
(11)无水乙醇.
(12)TE(pH7.
6)缓冲液:10mmol/LTris-Cl(pH7.
6),1mmol/LEDTA(pH8.
0).
(13)DNA片断回收试剂合.
【实验步骤】1.
低熔点胶回收法(1)先灌制普通凝胶,然后在离加样孔适当距离处切下一定大小的普通凝胶,用相应浓度的低熔点琼脂糖填充,室温中凝固,凝胶中含0.
5μg/ml溴化乙锭.
(2)将待分离的DNA样品上样电泳,当感兴趣的DNA片段迁移至低熔点凝胶内时,停止电泳、电泳最好在4℃下进行,以防止低熔点胶熔化.
(3)在长波长紫外灯下(365nm),切下含所需要DNA片段的低熔点凝胶,移入1.
5ml的Eppendorf管中.
(4)加入凝胶条5倍体积的凝胶平衡缓冲液,65℃水浴中加温5min熔化凝胶.
(5)冷却到室温,加入等容积的0.
1mol/LTris-Cl(pH8.
0)饱和的酚,强烈振荡混匀20s,室温下4000g,离心10min,有机相与水相交界面为白色的低熔点琼脂糖粉末.
(6)用等容积的酚/氯仿、氯仿各抽提1次.
(7)上层水相转移至1个清洁的1.
5mlEppendorf管中,加入0.
2倍容积的10mol/L醋酸铵,2倍容积预冷的无水乙醇,混匀后,室温下放置10min.
4℃,12000rpm,离心5min,去乙醇,干燥后加适当容积TE溶解.
2.
柱回收法(按试剂合操作说明)(1)割下含DNA的琼脂糖块,使它尽可能小,放入1.
5mlEppendorf管中.
(2)按每100mg琼脂糖加入300μlS1液的比例加入S1液,置55℃水浴10min.
每两分钟颠倒混匀一次.
(3)加入1/3倍S1液体积的异丙醇并混匀,55℃温浴1min.
(4)将熔化后的琼脂糖液移入吸附柱,高速离心1min.
倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入同一个收集管中.
(5)在吸附柱中加入450μlW1液,静置1min后,高速离心30s.
倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中.
(6)在吸附柱中加入450μlW1液,静置1min后,高速离心30s.
倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管中.
(7)高速离心1min.
(8)将吸附柱放入一个干净的1.
5mlEppendorf管中,在吸附膜中央加入30μlT1液,静置1min后,高速离心1min.
将此1.
5mlEppendorf管(DNA)储存于-20℃.
【注意事项】1.
切胶时,尽量切除不含DNA的多余凝胶,保证样品凝胶尽可能地小.
2.
低熔点胶的电泳最好在4℃下进行,以防低熔点凝胶熔化.
也可在很低的电压下较长时间电泳.
3.
酚和氯仿对皮肤有伤害,使用时要小心并戴乳胶手套或一次性薄膜手套.
4.
DNA片断回收试剂合可从多个公司购买,使用时应严格按照说明书进行操作.
【思考题】1.
低熔点琼脂糖有何特点在分子生物学研究中有何用处2.
为何要在长波长(365nm)紫外灯下切胶实验八、DNA连接实验【实验目的】了解DNA连接反应中各因素对连接效率的影响.
掌握克隆工作中常用的粘端、粘-平末端的连接方法,并将酶切回收的目的DNA片断与载体连接.
【实验原理】DNA的连接就是在一定的条件下,由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5'端磷酸和3'端羟基之间形成磷酸二酯键的过程.
连接反应在DNA重组技术中是非常关键的一步,纯化切割后的目的基因只有与带有自主复制起使点的载体连接,方能转化成功得到真正克隆.

在进行DNA重组时,选择适当的限制酶消化目的DNA片断和载体,可使两者产生同源末端,包括粘末端和平末端.
具有同源粘末端的DNA分子比较容易连接在一起,因为相同的粘末端容易通过碱基配对氢键形成一个相对稳定的结构,行使间隙修复,就可以使两个DNA分子连接在一起.
目的DNA片断与载体存在同源粘末端,这将是最简单的克隆途径.
同源粘末端包括单酶切产生的粘末端和双酶切产生的粘末端.
对于单酶切来说,载体与供体的同一片段上具有相同的末端,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连产物.
为了减少自环的高本底,可对载体进行5'末端除磷处理,原理是连接酶只能连接DNA片段的3'OH末端与5'P末端,所以除磷后载体不会自环.
一旦有外源片段插入时,外源片段提供的5'P末端就能与载体进行连接.
通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底.
对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都具有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自连,能使有效连接产物大大增加.
双酶切的另一个优点是能将供体分子定向连接到载体上.

有些限制性内切酶只能产生平末端,另外在某些情况下,外源DNA粘末端与拟克隆进的载体上难以找到匹配的位点.
利用T4噬菌体DNA连接酶可以催化平末端片断连接的特性能够解决这些DNA分子的连接问题.
因为除内切酶酶切和机悈剪切DNA直接产生平末端外,3'突出和5'突出的粘末端通过一定的修饰也能产生平末端,所以理论上讲,任何两种DNA都可由T4噬菌体DNA连接酶催化彼此连接.
外源DNA和载体分子一侧为相互匹配的粘末端,另一端为平末端,则外源DNA片断只能以一个方向插入载体,这就是粘-平末端连接.
该法适用于在目的DNA与载体上只有一个匹配位点.
在粘-平末端连接中,限制性内切酶酶解产生的目的DNA和载体5'突出的不互补粘末端,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片断酶(Klenow酶)填平后,可以直接在DNA反应混合物中用T4噬菌体DNA连接酶进行连接反应而无需去除dNTP来纯化DNA,因为dNTP并不抑制T4噬菌体DNA连接酶的活性.

在制定酶切与连接策略时,除了要考虑单/双酶切、粘末端连接、粘-平末端连接等情况外,连接过程还有一个因素要考虑,这就是载体与供体的比例.
一般来说,如果载体的自环转化子能被筛选掉而供体又非常宝贵的情况下,可考虑使用相对较多的载体,以提高供体的利用率.
相反,当载体的自环转化子无法被筛选掉而供体又非常充足时,可考虑使用相对较多的供体,以减少载体自环的可能性.
但插入片段较多时易造成双插入转化子的增加.
一定大小的供体与载体都有一固定的最适DNA总浓度,形成最适总浓度的原因是,DNA浓度过稀时不能频繁碰撞造成有效连接减少;而浓度过高时又因形成很多多聚体而使有效的环化重组子减少.
在可以对载体的自环转化子进行有效筛选时,推荐使用的载体与供体的比例为3:1.
完善的克隆方案应该是:可使用方便的方法筛选掉载体自环转化子,例如特定宿主菌pUC系列可通过加入IPTG和X-gal进行蓝白筛选.
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但在这个温度下,粘末端的氢键结合是不稳定的,如EcoRⅠ酶所产生的末端,仅仅通过四个碱基对相结合,这不足以抵抗该温度下的分子热运动.
因此在实际操作时,DNA分子粘末端的连接反应,其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度,为12℃~16℃,连接时间为12h~16h(过夜);或7℃~8℃,2d~3d.
【实验材料】1.
仪器:恒温水浴箱,台式高速离心机,微波炉,水平式凝胶电泳槽,稳流稳压电泳仪,紫外透射仪,紫外分光光度计,磁力搅拌器,手术刀片,点样梳,微量加样器,Eppendorf管,吸嘴,胶带纸.
2.
试剂:(1)pUC18质粒DNA,pBR322质粒DNA.
(2)λDNA.
(3)限制性内切酶:EcoRⅠ,HindⅢ,StyⅠ.
(4)10*限制性内切酶缓冲液(购酶时附带).
(5)6*凝胶加样缓冲液:0.
25%溴酚篮,0.
25%二甲苯青FF,30%甘油.
(6)溴化乙锭(EB,10mg/ml).
(7)5*TBE(电泳时稀释10倍):称取54gTris碱,27.
5g硼酸,加蒸馏水约900ml使完全溶解,再加入0.
5mmol/LEDTA(pH8.
0)溶液20ml,定容至1L.
(8)低溶点琼脂糖.
(9)DNA片断回收试剂合.
(10)Klenow酶.
(11)10*Klenow酶缓冲液(购酶时附带).
(12)4*dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP各4μmol/L.
(13)T4噬菌体DNA连接酶.
(14)10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液(购酶时附带).
【实验步骤】(一)粘末端连接1.
载体和插入片段的酶切消化:分别在两支灭菌的0.
5mlEppendorf中酶切消化pUC18质粒DNA和λDNA.
表2-36pUC18质粒DNA和λDNA的酶切消化ddH2OpUC18质粒λDNA10*HindⅢ缓冲液HindⅢ酶管17μl10μl(1μg)2μl1μl管211μl6μl(10μg)2μl1μl于37℃保温3h.
2.
载体和插入片段的回收与纯化:(1)保温结束后,在两管中分别加入6*凝胶加样缓冲液4μl,混匀后作低熔点琼脂糖凝胶电泳.
(2)在紫外灯下观察结果并拍照记录,用手术刀片小心地将pUC18质粒的2.
7kb条带和λDNA的564bp条带从琼脂糖凝胶中切下,分别移入1.
5mlEppendorf管中.
(3)用实验三十中的任选方法回收pUC18质粒的2.
7kb片断和λDNA的564bp片断.
3.
插入片段与载体的连接:(1)按摩尔数为3:1将纯化的带有HindⅢ酶切粘末端的λDNA564bp片断和pUC18质粒2.
7kb片断加入0.
5mlEppendorf管中,另加入10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液2μl,T4噬菌体DNA连接酶2μl(5U),最后加入无菌蒸馏水补至20μl,置15℃保温14h~16h.
(2)取出连接物,稍加离心,-20℃保存,备作转化实验.
(二)粘-平末端连接1.
在灭菌的0.
5mlEppendorf管中加入pUC18质粒DNA5μg(10μl),10*EcoRⅠ酶切缓冲液2μl,无菌双蒸水5.
5μl,EcoRⅠ酶1μl(10U),HindⅢ酶1.
5μl(10U),于37℃保温3h.
2.
在另一灭菌的0.
5mlEppendorf管中加入pBR322质粒DNA5μg(10μl),10*EcoRⅠ酶切缓冲液2μl,无菌双蒸水6μl,EcoRⅠ酶1μl(10U),StyⅠ酶1μl(10U),于37℃保温3h.
3.
酶解结束后各管加入6*凝胶加样缓冲液4μl,混匀后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳(同粘端连接法).
4.
电泳完毕后,在紫外灯下将pUC18质粒酶切后的大片断(2.
7kb)与pBR322质粒酶切后的小片断(1.
3kb)条带切下,分别移入1.
5mlEppendorf管中.
5.
DNA片断的回收纯化:用实验三十中的任选方法回收pUC18质粒酶切后2.
7kb的大片断与pBR322质粒酶切后1.
3kb的小片断.
6.
互补粘端连接:分别取以上两个DNA片断纯化液15μl混合于一0.
5mlEppendorf管中,加入10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液4μl,T4噬菌体DNA连接酶4μl(10U),无菌双蒸水2μl,于15℃保温14h~16h.
7.
非互补粘端补平:在0.
5mlEppendorf管中加入以上互补粘端连接物30μl,10*Klenow酶缓冲液4μl,Klenow酶1μl(5U),无菌双蒸水5μl,室温下放置2h.
8.
置70℃水浴10min,使Klenow酶失活.
9.
加10*T4噬菌体DNA连接酶缓冲液5μl,T4噬菌体DNA连接酶5μl,于15℃保温24h.
10.
置70℃水浴10min,使T4噬菌体DNA连接酶失活.
-20℃贮存,备用作转化实验.
【注意事项】(一)粘末端连接1.
在粘端连接时,除重组体外,还有一定数量的载体自身环化分子,这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景.
2.
用一种限制性内切酶切割载体和外源DNA,连接时插入片断可以从两个方向插入载体.
3.
粘末端连接时还有一个问题是片断的多拷贝插入.
欲筛选出含有正确插入方向和单拷贝插入片断的重组体,需要将重组体进行内切酶谱分析.
4.
一般情况下,酶浓度高,反应速度越快、产量也高,而连接酶是保存于50%甘油中,当连接反应系统中甘油含量过高时,则会影响连接效果,建议使用适当的酶量,一般连接酶的体积不超过总体积的1/10.

5.
载体上应具备两个以上的容易检测的遗传标志,以区分阳性重组子和阴性重组子.
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷性基因及形成噬菌斑的能力等.
6.
载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点,以便从中选出一种酶,使它在目的基因上没有切点,保存目的基因的完整性.
载体上的酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因内,这样目的基因是否连进载体就可以通过这一表型的改变与否而得知,便于筛选重组体.

(二)平末端连接1.
平末端DNA片断之间在T4噬菌体DNA连接酶的催化下,可以直接连接,但是连接效率很低,主要是由于T4噬菌体DNA连接酶对于平末端的Km值比粘末端的Km值高约1000倍.
平末端连接效率很低,它要求以下四个条件以增加连接产物:①低浓度的ATP(0.
5mmol/L);②不存在亚精胺的一类多胺;③及高浓度的连接酶(50U);④高浓度的平末端.
2.
平末端连接没有粘末端的碱基互补限制,只要是平末端均能连接,所以平末端外源DNA片断在载体中插入方向有两种可能性,在重组子筛选后,应该利用内切酶谱对阳性重组子中外源DNA片断的插入方向进行鉴定.

3.
为了减少载体DNA的自身环化,连接前线性载体DNA最好进行5'端脱磷酸处理.
4.
由于平末端连接得到的连接产物可能会失去结合处的原酶切位点,这时就不能再用切割外源DNA和载体的限制性内切酶来切割重组质粒,而需要寻找其它限制性内切酶来酶切重组体.
【思考题】1.
如何实现定向克隆它有什么优点2.
如何克服单酶切时载体自身环化的问题3.
为何粘端连接得到的重组体可以用原切割内切酶将插入片断从重组体上完整地切割下来.
实验九、感受态细胞的制备【实验目的】1.
使细菌细胞成为感受态的方法.
2.
CaCl2法制备细菌感受态细胞的原理和实验方法,为重组体的转化作准备.
【实验原理】通常情况下,细菌细胞很难接受外源DNA分子,但是当用物理或化学方法处理后,细菌细胞对摄取外源DNA分子变得敏感了,这种经过处理而容易接纳外源DNA分子的细胞称为感受态细胞(competentcell).
常用的使细菌成为感受态细胞的方法有化学法和电穿孔法.
化学法中最经典的是CaCl2方法,其基本原理是,当细菌处于0℃、低渗的CaCl2溶液中时,细菌细胞壁和膜的通透性增强,菌体膨胀成球形.
外源DNA与Ca2+结合形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,42℃短暂的热冲击处理(热休克)促进细菌细胞吸收外源DNA复合物.
然后在营养丰富的培养基中生长1h左右,细菌细胞形态恢复正常,获得了外源DNA的细菌称为转化子(Converter).
转化子中的抗性基因得以表达,随后将菌液涂布于含某种抗生素的选择性培养基平板上,转化子可分裂、增殖,形成菌落.

电穿孔法的基本原理是利用高压脉冲,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,外源DNA乘隙而入,脉冲过后,微孔复原,在丰富培养基中生长数小时后,获得了外源DNA的细菌增殖,质粒复制.
具体操作方法见相关仪器的说明.

【实验材料】1.
仪器:恒温培养箱,恒温水浴摇床,分光光度计,低温高速离心机,冰箱,制冰机,超净工作台,扭力天平,高压灭菌锅,培养皿,微量加样器,Eppendorf管,0.
22μm滤膜,0.
45μm滤膜,各种规格量筒,冰盒.
2.
试剂:(1)LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取液5g,NaCl10g,加去离子水800ml,搅拌使其完全溶解,用5mol/LNaOH调节pH至7.
4,加入去离子水至总体积为1000ml.
15lbf/in2(1.
034*105Pa)高压灭菌20min.
(2)LB固体培养基:试剂1中加入琼脂15g后,15lbf/in2高压灭菌20min.
(3)50mg/ml氨苄青霉素:用无菌水配制并过滤(0.
22μm)除菌,滤液于-20℃贮存.
(4)含氨苄青霉素的LB平板:配方同试剂2,高压灭菌后,冷却至65℃左右加入氨苄青霉素(终浓度为50μg/ml~100μg/ml),立即铺板.
(5)5mol/LNaOH:在100ml去离子水中溶解20gNaOH.
(6)1mol/LCaCl2:在200ml去离子水中溶解54gCaCl2·6H2O,用0.
22μm滤膜过滤除菌,分装成10ml小份,贮存于-20℃.
(7)0.
1mol/LCaCl2:制备感受态时,取出1mol/LCaCl2一小份解冻并用去离子水稀释至100ml,用0.
45μm滤膜过滤除菌,然后骤冷至0℃.
(8)10%甘油:高压灭菌后贮存于4℃.
【实验步骤】1.
受体菌的培养:将甘油贮存的受体菌在LB平板上划线,37℃培养16h~20h,然后从LB平板上挑取单菌落接种于1mlLB液体培养基,37℃振荡过夜.
次日,将上述培养菌液转入50mlLB液体培养基中,37℃300rpm,强烈振荡培养2.
5h~3h,使细胞的浓度达5*106个/ml,此时为对数生长期或对数生长前期.
2.
感受态细胞的制备(CaCl2法):将上述培养菌液冰上放置10min,然后转移到适宜的离心管中,4000rpm、4℃离心10min.
弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,使剩余的液体流尽.
加入10ml预冷的0.
1mol/LCaCl2使沉淀轻轻悬浮,然后冰浴30min.
4000rpm、4℃离心10min,回收细胞,弃上清.
每50ml原培养物再加入2ml冰冷的0.
1mol/LCaCl2溶液悬浮细胞,此时为感受态细胞.
3.
感受态细胞保存:在上述新制得的CaCl2溶液悬浮的感受态细胞中加入终浓度为10%的灭菌甘油,按每份200μl分装在Eppendorf管中,置-70℃冻贮.
【注意事项】1.
制备感受态细胞前的受体菌应处于对数生长期.
转化时菌体浓度应控制在不超过107/ml,过浓说明菌体生长已过了对数生长期;过稀则菌数太少,这段时间只有1%~10%的细菌能成为感受态.

2.
为了提高转化率,最好将配制好的0.
1mol/LCaCl2致敏缓冲液避光贮存于4℃冰箱.
此外,CaCl2必须为分析纯.
3.
感受态细胞可以在-70℃保存,但贮存时间过长将导致转化率下降.
一般环化重组子分子愈小转化率愈高,环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高.
4.
整个操作过程要在洁净的环境中进行,防止污染杂菌.
【思考题】什么是感受态细胞CaCl2法制备感受态细胞的原理为何要用对数生长期的细菌制备感受态细胞实验十、重组DNA转化与篮白斑筛选【实验目的】1.
掌握CaCl2法转化细菌细胞的基本原理和实验方法.
2.
掌握α互补蓝白斑筛选重组体的原理和实验方法.
3.
掌握影响转化率的关键因素和步骤,将目的基因片段与载体连接的连接产物转化感受态细菌,通过蓝白斑筛选法筛选出含目的基因插入到载体的重组体转化菌.
【实验原理】(一)转化在基因克隆技术中,转化(transformation)是指质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入细菌细胞的过程.
目前,常用的转化方法有两类:化学法和电穿孔法.
化学法中最经典的是CaCl2方法,其基本原理是:当细菌处于0℃、低渗的CaCl2溶液中时,细菌细胞壁和膜的通透性增强,菌体膨胀成球形.
外源DNA与Ca2+结合形成抗DNase的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面,42℃短暂的热冲击处理(热休克)促进细菌细胞吸收外源DNA复合物.
然后在营养丰富的培养基中生长1h左右,细菌细胞形态恢复正常,获得了外源DNA的细菌称为转化子(Converter).
转化子中的抗性基因得以表达,随后将菌液涂布于含某种抗生素的选择性培养基平板上,转化子可分裂、增殖,形成菌落.

电穿孔法的基本原理是利用高压脉冲,在宿主细胞表面形成暂时性的微孔,外源DNA乘隙而入,脉冲过后,微孔复原,在丰富培养基中生长数小时后,获得了外源DNA的细菌增殖,质粒复制.
具体操作方法见相关仪器的说明.

转化率是衡量转化方法的一个重要指标,一般定义为1μg环状质粒DNA在感受态细胞过量的情况下产生转化子的个数.
Ca2+处理的感受态细胞,转化率可达(105~106)个转化子/1μg环化DNA;电穿孔法的转化率为(109~1010)转化子/1μgDNA.
影响转化率的关键因素有:①生长时期:实验发现在对数中期的大肠杆菌易生成感受态细胞.
②CaCl2法0℃放置时间的影响:细菌经0℃CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加,24h达到最高,之后转化率逐渐下降.
③化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上,联合其他二价金属离子(如Mn2+,Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,可使转化率提高100~1000倍.
④质粒大小、构型的影响:通过构建相同复制起使点的不同大小质粒进行转化时发现,从2kb到3.
2kb转化效率上升,此后到6.
6kb转化率线性下降.
同时,开环状质粒只有超螺旋质粒转化率的75%,线性质粒的转化率更要低100~1000倍,线性质粒转化率低是因菌体中核酸外切酶将进入的线性DNA降解的原因.
⑤菌株基因型recA+与recA-的影响:recA基因是rec系列中最主要的基因,编码同源重组蛋白.
考虑到质粒DNA在recA+菌中存在与细菌染色体DNA整合的可能,因而,通常在转化实验中都选用recA-菌株作为宿主菌.

(二)篮白斑筛选现在使用的许多质粒载体(如pUC系列、pBluescript、pGem和它们的衍载体)都含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ基因)的调控序列和前146个氨基酸的编码信息.
在这个编码区中插入了一个多克隆位点,它不破坏阅读框,但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的N端,而不影响功能.
这种类型的载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞.
尽管宿主与载体编码的片断都没有活性,但当它们融为一体,形成具有酶活性的蛋白质.
这样,LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补,这种互补现象称为α互补.
由α互补而产生的lac+细菌落易于识别,因为它们在生色底物X-gal存在的情况下,形成篮色菌落,然而外源DNA片断插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免的导致产生无α互补能力的N端片断.
因此,携带重组质粒的细菌形成白色菌落.
这一简单的颜色试验大大简化了在这种构建质粒载体中鉴定重组子的工作,仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落.
然后通过小量制备质粒DNA,进行限制酶酶切分析或其它方法就可以确定这些质粒的结构.

α互补的常用菌种并不产生明显数量的lac抑制子.
因此,一般不需要诱导β-半乳糖苷酶的N端和C端片断的合成来进行组织化学分析.
如有必要,用IPTG可诱导两种片断的合成.
IPTG是非发酵性乳糖类似物,具有失活lacZ抑制子的功能.

【实验材料】1.
仪器:恒温培养箱,恒温水浴摇床,分光光度计,低温高速离心机,冰箱,制冰机,超净工作台,扭力天平,高压灭菌锅,微量加样器,Eppendorf管,0.
22μm滤膜,0.
45μm滤膜,各种规格量筒,冰盒.
2.
试剂:(1)感受态细菌JM109或DH5α等.
(2)质粒pUC18和相应的重组质粒(3)LB液体培养基:胰蛋白胨10g,酵母提取液5g,NaCl10g,加去离子水800ml,搅拌使其完全溶解,用5mol/LNaOH调节pH至7.
4,加入去离子水至总体积为1000ml.
15lbf/in2(1.
034*105Pa)高压灭菌20min.
(4)LB固体培养基:试剂1中加入琼脂15g后,15lbf/in2高压灭菌20min.
(5)LB顶层胶:试剂1中加入琼脂7g后,15lbf/in2高压灭菌20min.
(6)50mg/ml氨苄青霉素:用无菌水配制并过滤(0.
22μm)除菌,滤液于-20℃贮存.
(7)含氨苄青霉素的LB平板:配方同试剂2,高压灭菌后,冷却至65℃左右加入氨苄青霉素(终浓度为50μg/ml~100μg/ml),立即铺板.
(8)5mol/LNaOH:在100ml去离子水中溶解20gNaOH.
(9)20%IPTG溶液:IPTG异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(分子量为238.
3Da),在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后,用蒸馏水定容至10ml,用0.
22μm滤膜过滤除菌,分装成1ml小份贮存于-20℃.
(10)2%X-gal溶液:5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷,用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的贮存液.
保存于玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔包裹以防因受光照而被破坏,并贮存于-20℃.
X-gal溶液无须过滤除菌.
【实验步骤】(一)质粒转化感受态细菌JM109.
1.
取3支1.
5mlEppendorf管,按下表2-37加入试剂和操作:表2-37质粒pUC18转化感受态细菌JM109管1管2管3质粒载体pUC181μl连接产物10μlH2O9μl10μl感受态细胞JM109200μl200μl200μl2.
冰浴中放置30min.
3.
42℃热冲击90s后,立即放回冰浴.
4.
每管加入新鲜LB培养液1ml.
5.
37℃振荡培养60min.
6.
取各管反应物100μl~200μl,分别涂布于含氨苄青霉素的LB平板,加入的菌液用玻棒均匀推开.
以上操作均需在无菌条件下进行.
平板在37℃温箱内培养过夜.
次日观察平板上菌落生长情况,并算出转化率即每微克DNA能转化多少出个菌落.

(二)篮白斑筛选1.
在含有适当抗菌素预制的90mm培养板中央滴加40μl2%X-gal和7μl20%IPTG.
如用150mm培养板,则加100μl2%X-gal和20μl20%IPTG.
2.
用一个无菌的涂布器拨散X-gal和IPTG溶液,使之分散于培养板整个表面.
于37℃温育至全部液体消失(由于二甲基甲酰胺的挥发性低,如用新鲜琼脂板这一过程要持续3h~4h).
3.
取重组DNA(连接产物)转化菌悬液100μl~200μl铺板.
4.
待菌液完全吸收后,颠倒培养板于37℃培养过夜.
5.
取出培养板于4℃放置数小时,使蓝色在这一时期充分显色.
7.
鉴定所带重组质粒的克隆,携带野生型质粒的克隆含β-半乳糖苷酶活性,菌落的中央呈淡篮色,外周呈深篮色.
携带重组质粒的克隆无β-半乳糖苷酶活性,菌落呈奶白色(以鲜黄色为背景观察可增强眼的辨别篮色和白色的能力).

8.
筛选和培养携带重组质粒的克隆.
【注意事项】1.
42℃热处理时间很关键,转移速度要快,且温度要准确.
2.
菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率.
3.
实验用的玻璃器皿、吸嘴及Effendorf管等,应彻底洗净并进行高压消毒,表面去污剂及其他化学试剂的污染往往大幅度降低转化率.
【思考题】涂布菌液时应注意什么影响CaCl2法转化率的关键因素有哪些如何提高转化率什么是α互补为何白色菌落含有重组子第八节分子杂交技术待测核酸序列在体外与探针杂交一般采用将待测核酸凝胶电泳分离后转移到膜上进行印迹杂交,待测序列为DNA的印迹杂交称为Southern印迹杂交(Southernblot),待测序列为RNA的印迹杂交称为Northern印迹杂交(Northernblot),也可以根据实际情况不进行电泳分离而将待检测核酸直接用斑点或狭缝点样的方法转移到膜上进行杂交,称为斑点杂交或狭缝杂交(Dot-blot).
在细胞内直接进行核酸分子杂交的技术称为细胞原位(insitu)杂交.
实验十一、Southern印迹杂交【实验目的】通过实验了解和掌握DNA凝胶电泳转移的方法【实验原理】通常用Southern(1975)提出的转移技术进行基因组DNA特定序列定位.
用一种或多种限制酶消化基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片段,随后使DNA在原位发生变性,并从凝胶转移至一固相支持体(通常是硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上.
DNA转移至固相支持体的过程中,各个DNA片段的相对位置保持不变,用放射性标记的DNA或RNA与固着于滤膜上的DNA杂交,经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置.
以下介绍的技术适于分析哺乳动物基因组DNA的限制酶切消化物.
不过,这些技术稍经变通,便可用于质粒,粘粒及噬菌体的限制酶切消化物.

能产生可检杂交信号所需要的DNA量取决于几个因素,包括基因组中与探针互补的部分所占比例、探针的大小和比活度,以及转移至滤膜上的基因组DNA的量.
在最佳条件下,经放射自显影曝光数天后,这一方法的灵敏度足以检测出不到0.
1pg的与高比活度的32P标记探针互补的DNA.
如果有10μg基因组DNA被转移至滤膜上,与数百核苷酸长的探针杂交,那么经曝光过夜即可检测出在该哺乳动物基因组中只出现一次的1000bp序列(即三百万分之一).
由于信号的强度与探针的比活度成正比,与其长度成反比,所以,当用非常短的探针时,Southern杂交的灵敏度可达到上限.
因此要使用寡核苷酸探针得到可检信号,必须使用高比活度的标记探针,并应增加滤膜上靶DNA的量.
进行放射自显影时应曝光数天.

【实验材料】1.
仪器(1)琼脂糖凝胶电泳装置(2)真空泵(3)真空烤箱(4)其它试验室常规仪器2.
试剂(1)适当的限制性核酸内切酶(2)琼脂糖(3)变性液:1.
5mol/lNaCl;0.
5mol/lNaOH.
(4)中和液:1mol/lTris·Cl(pH8.
0);1.
5mol/lNaCl.
(5).
转移液(20*SSC)pH7.
0:3mol/lNaCl;0.
3mol/l柠檬酸钠.
(6)硝酸纤维素滤膜(Schleicher&SchuellBA85或MilliporeHAHY)或尼龙膜(AmershamHybond-N,Bio-RadZeta-probe或PhasmaciaGeneBind).
【实验步骤】(一)虹吸印迹法1.
取一定量的待测DNA样品,用适当的限制性内切酶酶切.
DNA的量根据样品的种类及目的不同而异,对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析,取0.
1~0.
5μg即可;而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因顺序,则需要10~20μg;当采用寡核苷酸探针或探针的比放射活性较低时,则需要多至30~50μg.
酶切完毕,在琼脂糖凝胶中电泳,在其中一孔中加入适当的DNA分子量标准参照物.
电泳结束后,溴乙锭(EB)染色,长波紫外线下观察电泳结果.
用一张保鲜膜覆盖在凝胶上,复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置.
在凝胶旁置一厘米尺照像.

2.
切除无用的凝胶部分.
将凝胶的左下角切去,以便于定位.
然后将疑胶置于一搪瓷盆中.
3.
将凝胶浸泡于适量的变性液中,置室温1小时,不间断地轻轻摇动.
注意不要让凝胶漂浮起来,可用滴管等物将之压下.
对于较大的DNA片段(如大于15kb),可在变性前用0.
2mol/lHCl预处理10分钟使脱嘌呤后,再进行碱变性处理.
4.
将疑胶用去离子水漂洗一次,然后浸泡于适量的中和液中30分钟,不间断地轻轻摇动.
换新鲜中和液,继续浸泡15分钟.
5.
如图2-27所示,在一塑料或玻璃平台上铺一层Whatman3MM滤纸,此平台要求比凝胶稍大.
将此平台置于一搪瓷盆或玻璃缸中,搪瓷盆中盛满20*SSC或10*SSC(也可用10*或20*SSPE代替).
滤纸的两端要完全浸没在溶液中.
将滤纸用20*SSC湿润,用一玻璃棒将滤纸推平,并排除滤纸与玻璃板之间的气泡.

6.
裁剪下一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜.
注意操作时要戴手套,千万不可用手触摸,否则油腻的膜将不能被湿润,也不能结合DNA.
.
7.
将硝酸纤维素滤膜漂浮在去离子水中,使其从底部开始向上完全湿润.
然后置于20*SSC中至少5分钟.
注意如果滤膜不能被湿润则不能用.
8.
将中和后的凝胶上下颠倒后,置于上述铺了一层Whatman3MM滤纸的平台中央.
注意两者之间不要有气泡.
9.
在凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严,以防止在转移过程产生短路(转移液直接从容器中流向吸水纸而不经过凝胶),从而使转移效率降低.
10.
将湿润的硝酸纤维素膜小心覆盖在凝胶上,膜的一端与凝胶的加样孔对齐.
排除两者之间的气泡.
相应地将膜的左下角剪去.
注意膜一经与凝胶接触即不可再移动,因为从接触的一刻起,DNA已开始转移.

11.
将两张预先用2*SSC湿润过的与硝酸纤维素膜大小相同的Whatman3MM滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排除气泡.
12.
裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸,约5-8cm厚.
将之置于Whaunan3MM滤纸之上.
在吸水纸之上置一玻璃板,其上压一重约500g的物品(图2-5).
转移液将在吸水纸的虹吸作用下从容器中转移到吸水纸中,从而带动DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上.
13.
静置8~24小时使其充分转移.
其间换吸水纸1~2次.
14.
弃去吸水纸和滤纸,将疑胶和硝酸纤维素膜置于一张干燥的滤纸上.
用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置.
15.
凝胶用溴乙锭染色后紫外线下检查转移的效率.
硝酸纤维素膜浸泡在6*SSC溶液中5分钟以去除琼脂糖碎块.
16.
硝酸纤维素膜用滤纸吸干.
然后置于两层干燥的滤纸中,真空下80℃烘烤2小时,此过程使DNA固定于硝酸纤维素膜上.
17.
此硝酸纤维素膜即可用于下一步的杂交反应.
如果不马上使用,可用铝箔包好,室温下置真空中保存备用.
(二)电转法当使用硝酸纤维素滤膜为固相支持体时,这一方法行不通.
因为核酸结合到这些滤膜上,要求缓冲液的离子强度要高.
这些缓冲液传导电流的效率极高,必须采用大体积来保证该系统的缓冲容量不因电解而耗尽.
此外,克服欧姆热效应也需要充分的外冷却.
因此,直至最近,电转移仍用重氮苄氧甲基(DBM)一纤维素或氨基苯硫醚(APT)一纤维素一类的支持体进行,因为这些固相支持体在极低的离子强度下能有效地结合核酸.
尽管这些固相支持体己不再常用,然而带电荷尼龙膜的出现最近使电转移法又获生机.
在离子强度极低的缓冲液中,小至50bp的核苷酸也可结合于这些尼龙膜上.
虽然单链DNA和RNA可直接转移,但双链DNA片段则须原位进行变性.
随后中和凝胶,再将其浸于电泳缓冲液后,夹放于大电泳槽内平行电极间的多孔板之间.
完全转移所需的时间取决于DNA片段的大小、凝胶的孔隙度及外加电场的强度.
然而,因为即便高分子量核酸也从凝胶上迁移得较快,所以无须进行脱嘌呤及水解处理,一般2~3小时内可转移完毕.
由于电转移要求比较大的电流,故往往难以使电泳缓冲液维持在一定的温度,以适于DNA的有效转移.
许多商业化的电转仪附有冷却设备,但亦有一些只可在冷室中应用.
由于这样或那样的问题,我们建议只有在利用毛细管作用或在真空条件下进行转移时,例如:必须分析经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的DNA片段时,方采用电转移.

(三)真空转移法在真空条件下,DNA和RNA可从凝胶中快速并定量地转移.
目前有商品供应的真空转移装置有数种.
在这些装置内,硝酸纤维素滤膜或尼龙膜置于真空室上方的一多孔屏之上,而凝胶则放在与膜相接触的位置.
从装置上部一贮液槽中吸流出来的缓冲液将核酸从凝胶中洗脱,并使核酸聚积在滤膜或尼龙膜上.

真空转移较之毛细管转移更为有效,而且极为快捷.
经碱处理后不完全脱嘌呤和变性的DNA,30min内即可从具正常厚度(4~5mm)和正常琼脂糖浓度(9kb)的从凝胶上转移的效率很高,通常不必进行RNA的分级分离.
通常认为变性RNA吸咐至硝酸纤维素滤膜是一种非共价结合,这种结合基本上为不可逆过程.
因此有可能在确保滤膜所结合的核酸分子不发生明显丢失的情况下,用一系列放射性标记的探针连续与固定在硝酸纤维素滤膜上的RNA进行杂交.
遗憾的是硝酸纤维素滤膜通常不能耐受2轮以上的杂交和洗膜操作.
用带正电荷的尼龙膜替代硝酸纤维素滤膜可以弥补上述不足,尼龙膜可以从容耐受多轮杂交而放射性信号并不减弱.
然而许多型号的尼龙膜,其杂交背景均较硝酸纤维素滤膜相对为高,因此我们建仪尼龙膜只用于以许多探针对RNA进行连续杂交的实验;每个生产厂家对其特定型号的带电荷尼龙膜均提供专门的操作指南,以指导核酸转移实验,研究人员应严格遵守这些规定才能获得理想的结果.

研究人员可以用众多类型的探针对转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的RNA进行杂交.
这些探针包括:用切口平移法标记的双链DNA、通过延伸与重组M13噬菌体相退火的寡核苷酸引物而制备的单链DNA探针,放射性标记的合成寡核苷酸、用原核细胞依赖于DNA的RNA聚合酶(如SP6、T7或T3噬菌体RNA聚合酶)在体外合成的RNA探针.

基本原理与Southern印迹相同.
但RNA变性方法与DNA不同,不能用碱变性,因为碱会导致RNA的水解,以下将介绍三种RNA变性电泳方法.
【实验材料】1.
仪器电泳仪、电泳槽、磁力搅拌器、蠕动泵.
2.
试剂(1)DEPC(2)6mol/lglyoxal(聚乙二醛):使用前,必须用混合床阴阳离子交换树脂(Bio-RadAG501-X8)去离子,直至其pH大于5.
0.
然后小分装、密闭,置-20℃保存.
(3)DMSO(二甲基亚砜,dimethylsulfoxide)(4)0.
1mol/l磷酸钠缓冲液(pH7.
0),用DEPC预处理.
(5)琼脂糖(6)碘乙酸钠(sodiumiodoacetate)(7)载样缓冲液(用DEPC预处理):50%蔗糖,10mmol/l磷酸钠(pH7.
0),0.
25%溴酚蓝,0.
25%二甲苯青(xylenecyanolFF).
(8)5*甲醛胶电泳缓冲液:0.
1mol/LMOPS(pH7.
0),40mmol/l乙酸钠,5mmol/lEDTA(pH8.
0)制备方法:20.
6gMOPS(3-[morpholino]propanesulfonicacid)溶于800mi用DEPC预处理过的50mmol/l乙酸钠液中.
用2mol/lNaOH调节pH至7.
0.
然后加入10ml0.
5mol/lEDTA.
用DEPC预处理过的蒸馏水调节体积至1000ml.
通过0.
2μm的微孔滤膜过滤.
室温下避光保存.
(9)37%甲醛(10)甲酰胺:一般不须特殊处理,但如呈现黄色,可用混合床阴阳离子交换树脂(Bio-RadAG501-x8)处理,然后小量分装,密闭置-70℃保存.
(11)载样缓冲液(用DEPC预处理):(12)50%蔗糖(13)1mmol/lEDTA(pH8.
0)(14)0.
25%溴酚蓝(15)0.
25%二甲苯青(16)甲基氢氧化汞(methylmercurichydroxide)(17)1*甲基汞凝胶电泳缓冲液:50mmol/l硼酸,5mmol/lNa2B4O2·10H2O,10mmol/lNa2S04,调节pH至8.
1.
(18)2*上样缓冲液:lmol/l甲基氢氧化汞25μl4*甲基汞凝胶电泳缓冲液500μ1100%甘油200μl水275μl溴酚蓝0.
2%(19)分子量标准参照物【实验步骤】(一)聚乙二醛和二甲基亚砜变性电泳1.
在一消毒的微量离心管中加入下列试剂并混匀:6mol/l聚乙二醛5.
4μlDMSO16.
0μl0.
1mol/l磷酸缓冲液(pH7.
0)3.
0μlRNA5.
4μlRNA的加入量取决于mRNA的丰度.
对于mRNA丰度较高的,可加入10μg-20μg细胞总RNA,对于低丰度mRNA的检测,则每孔中应追加0.
5μg~3.
0μgpoly(A)+RNA.
2.
置50℃保温1小时.
然后迅速置冰水浴中.
稍稍离心.
3.
根据RNA分子量的大小制备相应浓度的琼脂糖凝胶(对于小于lkbRNA,用1.
4%琼脂糖凝胶;大于lkbRNA,用1%琼脂糖凝胶).
琼脂糖溶于10mmol/l磷酸钠缓冲液(pH7.
0)中,冷却至70℃后,加入固体碘乙酸钠,其终浓度为10mol/L,以灭活核酸酶.
注意:由于溴乙锭会与聚乙二醛起反应,因此凝胶及电泳液中不能含有溴乙锭.
电泳槽必须用去污剂洗干净,蒸馏水冲洗,乙醇干燥,然后用3%双氧水处理10min,最后用DEPC处理过的蒸馏水彻底冲洗.
4.
在RNA样品中加入4μl载样缓冲液.
然后上样于凝胶加样孔中.
在另一孔中加入分子量标准参照物.
5.
在10mmol/l磷酸钠缓冲液(pH7.
0)中电泳,恒压3V/cm~4V/cm.
用磁力搅拌器不间断地搅拌,并用蠕动泵使阴阳极电泳液不断循环对流.
6.
电泳结束后,切下分子量标准参照物条带,溴乙锭染色,紫外线下照像.
7.
此凝胶可用于进行Northern印迹.
(二)甲醛变性胶电泳法1.
将琼脂糖在一定量的水中溶化,冷却至60℃后,加入一定量的5*甲醛胶电泳缓冲液和甲醛,使其终浓度分别为l*和2.
2mol/l(37%甲醛为12.
3mol/l).
然后灌注电泳胶.
电泳槽必须用去污剂洗干净,蒸馏水冲洗,乙醇干燥,然后用3%双氧水处理10分钟,最后用DEPC处理过的蒸馏水彻底冲洗.
2.
在一微量离心管中加入下列试剂并混匀:RNA4.
5μl5*甲醛胶电泳缓冲液2.
0μl37%甲醛3.
5μl甲酰胺10.
0μl置65℃保温15min,然后迅速置冰浴中.
稍稍离心.
此法每孔中可加入30μgRNA.
RNA的加入量取决于mRNA的丰度.
对于mRNA丰度较高的,可加入10μg~20μg细胞总RNA,对于低丰度mRNA的检测,则每孔中应追加0.
5μg~3.
0μgpoly(A+)RNA.
3.
加入2μl载样缓冲液.
4.
上样前凝胶预电泳5分钟.
然后将RNA样品立即上样于加样孔中,同时在另一样品孔中加入分子量标准参照物.
5.
在l*甲醛胶电泳缓冲液中电泳,恒压3V/cm~4V/cm.
每1h~2h将阴阳极电泳液混合一次.
6.
电泳结束后,切下分子量标准参照物条带,溴乙锭染色,紫外线下照像.
7.
此凝胶可用于Northern印迹.
(三)甲基氢氧化汞电泳法1.
琼脂糖溶于1*甲基汞凝胶电泳缓冲液中.
冷却至55℃,然后加入甲基氢氧化汞,使终浓度为5mmol/l.
2.
在一微量离心管中等量混合RNA溶液与2*上样缓冲液.
每孔可加入10μgRNA.
3.
RNA样品上样于凝胶中.
在l*甲基汞凝胶电泳缓冲液中电泳,恒压5V/cm~6V/cm,12h~16h.
【注意事项】1.
RNA极易被环境中存在的RNA酶所降解,因此须特别注意RNA酶的污染问题,请参考核酸提取实验.
2.
上述转膜方法也基本适应于将RNA转移到尼龙膜上.
但在印迹前,含甲醛的凝胶必须用水将甲醛冲洗掉.
尼龙膜的缺点是杂交本底较高,特别是对于RNA探针.
一般此问题可用提高杂交液中封闭物质的量来加以克服.

【思考题】1.
回答Northern与Southern印迹杂交最大区别.
2.
在Northern印迹实验中最应注意的是什么实验十三、Western印迹【实验目的】了解和掌握蛋白质凝胶电泳转移及抗原-抗体印迹的技术和方法【实验原理】对DNA有Southern印迹法;而对蛋白质,则同样有Western印迹法.
这两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相支持体,并均以针对特定氨基酸(Western印迹法)或核苷酸(Southern杂交法)序列的特异性试剂作为探针检测之.
对于蛋白质来说,通常使用的探针是抗体,它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应.
因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量时,Western印迹法极有用场.
这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记.
此外,由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行,因此,溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题全部烟消云散.

Southern印迹法与Western印迹法之间的关键区别在于探针的性质.
核酸探针进行杂交的特异性及速率可以通过简单方程式进行预测,而相比之下抗体反应方式的独特个性则要鲜明得多.
一种免疫球蛋白可优先识别其靶表位的某一特定构象(例如变性构象或天然构象).
因而,并非所有单克隆抗体都适合作为探针用于Western印迹法,因为在这一实验中靶蛋白是彻底变性的.
而另一方面,多克隆抗血清是由单一免疫球蛋白组成的不确定混合物,通常对其特异性,亲和力以及浓度都一无所知.
因而不可能预言用特定多克隆抗血清来测定某一固定化变性靶蛋白上的不同抗原表位的效果.

采用不确定试剂来测定可能同样知之甚少的靶蛋白,显然有一定的危险性,但Western印迹法在实际应用中遇到的大多数问题都可以通过设置适当的对照加以解决.
这些对照包括:1.
不与靶蛋白反应的抗体(即免疫前血清或非相关单克隆抗体).
2.
样品对照,即含有已知量靶抗原或完全不含有靶抗原的制品.
一般情况下,用于Western印迹技术的免疫学试剂没有多大的选择余地,往往只需根据手头上所能得到的任何一种抗体来设计实验.
但如果能够有所选择,则以选用抗变性蛋白的高滴度多克隆抗血清或单克隆抗体混合物为佳.
只依赖某一单克隆抗体是要担风险的,因为与靶抗原不相关的蛋白质能引起高频率的交叉反应假象.
如果正像通常的情况那样,已制备抗天然靶蛋白的单克隆或多克隆抗体,就有必要查证它们所识别的表位究竟是可以耐受SDS和还原剂变性处理,还是经过这种变性处理后所产生的.
这可以用变性靶抗原进行固相放射免疫测定或Western斑点印迹法(点渍法)而予以确定.

在Western印迹法中,待测样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持体上(常用硝酸纤维素滤膜),然后可被染色.
随后滤膜可与抗靶蛋白的非标记抗体反应.
最后,结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂(125I标记的A蛋白或抗免疫球蛋白、与辣根过氧化合物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白)检测.
Western印迹法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白.
染色的程序与固相免疫测定方法基本相似,有直接法和间接法两种,常用间接免疫染色法.
首先用抗靶蛋白的非标记特异性抗体与NC膜反应,经适当洗涤后,与抗原结合的抗体可以和标记的(生物素、酶等)第二抗体反应,然后进行显色.
Westernbloting的特异性和敏感性取决于对一些无关蛋白质的潜在结合位点的封闭,一般可用去脂奶粉、血清蛋白、小牛血清等作为封闭剂.
【实验材料】1.
仪器(1)抽滤加样器(Dot或SlotFiltrationManifold)(2)真空泵(3)DYY-Ⅲ7B型转移电泳仪(4)DYY-Ⅲ40B型转移电泳槽(5)硝酸纤维素薄膜(NC膜)、铅笔、米尺、刀片、搪瓷盘(平底)、滤纸、作酶染的有机条槽等.
2.
试剂(1)电极缓冲液pH8.
3:Tris(25mmol/l)3.
03g甘氨酸(192mmol/l)14.
4g甲醇(20%200ml加dH2O至1000ml用lmol/LHCl调pH至8.
3.
(2)TBSpH7.
4:Tris1.
2g,NaCl8.
0g,加dH2O至1000ml,用lmol/lHCl调pH至7.
4.
(3)洗涤液TBS-T:TBS100ml,吐温-20(T)0.
05ml.
(4)封闭液及样品稀释液:洗涤液10ml,牛血清清蛋白0.
1g.
(5)底物溶液(新鲜配制):4氯-1-萘酚30mg,甲醇10ml.
先将4-氯-1-萘酚溶解在甲醇中,待其充分溶解后,再加入TBS液50ml.
临用前加30%双氧水30μl(6)氨基黑染色液:0.
1%氨基黑10B0.
2g45%甲醇90ml10%冰醋酸20ml加dH2O至200ml【实验步骤】1.
将硝酸纤维素膜用加样梳、铅笔标记,与SDS-PAGE凝胶的大小一样;再将大小相同的六张滤纸和海绵一同浸泡在电极缓冲液中30min~60min.
2.
将电泳完毕的SDS-PAGE凝胶取下,放入缓冲液内平衡10min,在缓冲液中按以下顺序从正极到负极铺于凝胶夹上:凝胶夹板→海绵→三层滤纸→NC膜→PAGE凝胶块→三层滤纸→海绵→凝胶夹板(此过程中应避免气泡产生),夹紧"凝胶三明治"插入电泳槽,灌满缓冲液.

3.
电转移将NC膜端接正极,凝胶面接负极,打开电源,预置电压70V,电流135mA,转印15h左右.
4.
电转移结束后,凝胶块可用考马斯亮蓝R-250染色(同SDS-PAGE),观察转移效果.
NC膜则用洗涤液洗后低温干燥保存,或立即进行蛋白质检测.
5.
蛋白质测定(1)直接染色法:为了更快地了解蛋白带是否已转到NC膜上,可切下一条已知蛋白带(如蛋白分子量标准、人血清、BSA等),用氨基黑10B直接染色,以观察蛋白质是否已完全转移和凝胶与NC膜的位置.

(2)间接酶免疫染色法1)将其余的NC膜按标记切成数条,使每一条NC膜上含有一份标本.
将NC膜用dH2O洗5min;加入封闭液封闭NC膜,37℃水浴1h后,倒掉封闭液.
dH2O洗5min.
2)将NC膜与合适浓度的第一抗体孵育37℃60min.
洗涤:dH2O5min;TBS-T2*10min.
3)将NC膜与合适浓度的第二抗体(酶标记过的)孵育37℃60min.
洗涤:dH205分钟,TBS-T2*10min.
4)加入底物溶液,37℃15min~30min显色.
5)蛋白带清晰后,用自来水冲净NC膜,夹于双层滤纸中风干保存.
【注意事项】1.
当用手触摸胶、滤纸及纤维素膜时均应戴手套,因为皮肤上的油和分泌物会影响蛋白质从胶上转移到膜上2.
辣根过氧化酶显色的条带在阳光下几小时就会褪色.
【思考题】1.
试比较蛋白凝胶电泳转移与核酸凝胶电泳转移的异同点2.
何为第一抗体及第二抗体.
实验十四、核酸原位杂交【实验目的】通过实验了解和掌握组织细胞原位杂交的技术和方法【实验原理】核酸原位杂交(nucleicacidhybridizationinsitu)是以特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法.
在杂交过程中不需要改变核酸所在的位置.
主要包括用于基因克隆筛选的菌落原位杂交、检测基因在细胞内的表达与定位的原位杂交,以及基因在染色体上定位的原位杂交等.

(一)菌落原位杂交1975年Grunstein和Hogness介绍了一种在硝酸纤维素滤膜上原位裂解细菌菌落并将释放出来的DNA非共价结合于滤膜的方法.
结合于滤膜上的DNA再与相应的放射性标记核酸探针杂交,根据杂交结果筛选含有目的DNA序列质粒的细菌菌落.
菌落的原位杂交技术主要用于基因克隆以及基因文库的筛选,以期从大量的细菌克隆中分离含有目的基因片段的阳性克隆.
菌落原位杂交的基本过程是,首先将在琼脂培养板上生长的细菌复印到杂交膜上,并通过不对称标记确定膜与平板的相对位置,然后用碱或者热和碱对菌落进行裂解.
将细菌释放出来的核酸固定在杂交膜上以后,再采用特异性的探针进行杂交,通过对杂交结果的分析确定含有目的基因片段的阳性克隆.
其基本操作过程与基因组文库的噬菌斑原位杂交类似.

(二)真核细胞中的核酸原位杂交该技术最早应用于上个世纪60年代末期,由于核酸原位杂交的特异性高,并可以精确定位,因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究之中.
真核细胞中的核酸原位杂交依据检测物的不同分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交两种,但不论哪种杂交,都必须经过组织细胞的固定、预杂交、杂交和冲洗等一系列步骤及放射自显影或免疫酶法显色,以显示杂交结果.
具体的操作步骤见后.

真核细胞中的核酸原位杂交可以用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交来确定特定核酸序列在染色体上的精确定位;与细胞内RNA进行杂交以观察组织细胞中特定基因的表达水平.
此外还可用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交,以确定有无病原体的感染等.
由于原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响,因此对于那些细胞数量少且散在于其它组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便.
此外,原位杂交不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性,并可完整地保持组织和细胞的形态,更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态.

核酸原位杂交是在组织和细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量的特异性方法之一,它对于研究细胞的生物学功能,基因表达的规律,以至肿瘤发生机制及病原微生物的检测,有广泛的应用前景.
随着方法学的不断发展与完善,检测的灵敏性、特异性及方法的简捷等快速、无害、稳定使其有更为广泛的应用前景,必将对医学及生物学研究有极大推动作用.

【实验材料】1.
仪器(1)载有冰冻切片的载玻片(2)两副载玻片架及广口瓶(一副留做RNA酶消化专用)(3)50℃水浴,37℃和42℃温箱(或水浴)2.
试剂(1)50mmol/lTris·Cl(pH7.
5)/5mmol/lEDTA(2)含2mg/ml甘氨酸的1*PBS(3)2*SSC(4)30%,60%,80%,95%和100%乙醇(5)标记的DNA或RNA探针(见附录)(6)杂交混合液:1.
2mol/lNaCl,20mmol/lTris·ClpH7.
5,4mmol/lEDTA,2*Denhardt溶液,1mg/ml酵母菌tRNA,200g/mlpoly(A)等量分装,于-20℃保存.
(7)去离子的甲酰胺(8)50%(w/v)硫酸葡聚糖(Pharmacia)(9)3.
3mol/l二硫苏糖醇(DTT)新配(10)加湿盒溶液:50%(v/v)甲酰胺,0.
6mol/LNaCl,10mmol/lTris·ClpH7.
5,2mmol/lEDTA.
(11)DNA洗液:0.
6mol/lNaCl,10mmol/lTris·ClpH7.
5,1mmol/lEDTA,50%(v/v)甲酰胺,0.
1%(v/v)2-ME,预热至37℃.
(12)NBT/BCIP液:将10mgNBT溶于200μl二甲基甲酰胺中,于37℃加入1ml底物缓冲液(50mmol/lTris·Cl,pH9.
5,l00mmol/lNaCl,lmmol/lMgCl2)后,以滴入法将液体滴于37℃的30ml底物缓冲液中;将5mgBCIP溶于200μl二甲基甲酰胺中,然后慢慢加入上述溶液中.
置-20℃保存.
(13)甘油明胶的制备:将10g明胶于37℃溶于60ml蒸馏水中,加入70ml甘油和0.
25g苯酚.
室温保存时呈胶冻状,42℃时为液体状.
【实验步骤】(一)组织细胞内mRNA的原位杂交1.
冰冻切片的制备:(1)手术切块或新鲜活检取材标本0.
4cm*0.
4cm大小,用PBS冲洗两次后置于冰冻切片机标本固定头上.
(2)行8μm切片,附于涂有1mg/ml多聚赖氨酸的载片上,室温空气干燥3min.
(3)4%多聚甲醛(PBS新鲜配制)室温下固定20min,或于4℃下用乙醇:冰醋酸(3:1)固定20min.
(4)PBS冲洗切片,室温下冲洗2次,每次5min.
(5)30%,60%,80%,95%,100%梯度乙醇脱水.
(6)切片空气干燥或置100%乙醇中,-20℃冰箱内保存.
2.
细胞涂片的制备:(1)贴壁培养细胞用0.
04%EDTA消化后离心(注意不能用胰酶消化,以防止胰酶中RNA酶的降解作用).
悬浮培养细胞可直接离心后用PBS冲洗2次,细胞计数后用PBS重新悬浮细胞至其浓度为106个/ml.

(2)于细胞涂片机上将细胞涂在有1mg/ml多聚赖氨酸载片上,或取2~3滴细胞悬液滴于载片上,室温下空气干燥5min.
(3)余处理同上述步骤(3)~(6).
3.
杂交前的预处理:(1)将切片或涂片置1μg/ml蛋白酶K(溶于50mmol/LEDTA,0.
1mol/LTris·Cl,pH8.
0中)溶液中37℃下消化30min.
(2)去离子水冲洗切片2次,每次5min.
(3)乙酰化切片:将切片置于0.
1mol/L三乙醇胺(PH8.
0)溶液中并彻底搅拌,同时在每升溶液中加入乙酸酐(aceticanhydride)5ml,待其完全溶化后静置10min.
(4)用2*SSC冲洗二次,每次5min,70%、95%乙醇处理,空气干燥.
4.
杂交(1)杂交可在40%甲酰胺、4*SSC、0.
1mol/l磷酸钠溶液(pH8.
0)中,于50℃杂交;或50%甲酰胺,5mmol/lEDTA,0.
3mol/lNaCl,20mmol/lTris·Cl(pH8.
0)于50℃杂交.
每张切片可用探针1ng-10ng.
应用DNA探针时可加入100μg/ml变性的大肠杆菌DNA或鲑精DNA及100μg/ml酵母tRNA,并可在杂交液中加入Denhardt液(0.
02%牛血清白蛋白,0.
02%聚蔗糖,0.
02%聚乙烷吡咯酮)以减少本底,加入10%硫酸葡聚糖(dextransulphate)以增加探针的相对浓度.
(2)每张玻片加入杂交液10μl-100μl后,加硅化盖玻片于杂交液上,边缘用橡胶水泥(rubbercement)或石蜡封闭,以防止杂交液蒸发.
(3)将玻片置于密闭湿盒中,50℃保温12h~14h.
5.
杂交后处理:(1)将玻片从湿盒取出,去掉橡胶水泥或石蜡后,于2*SSC中轻轻揭去盖片并洗去杂交液.
(2)使用RNA探针的杂交后处理:1)将玻片于含20μg/mlRNA酶(溶于0.
5mol/lNaCl,10mmol/lTris·Cl,pH8.
0中)溶液中,37℃消化30min.
2)用不含RNA酶的上述溶液于37℃冲洗30min.
3)用0.
1*SSC50℃冲洗10min.
4)用0.
1*SSC室温冲洗10min.
5)70%、95%乙醇脱水,每一浓度中5min,然后空气干燥.
(3)使用DNA探针的杂交后处理:1)用不含探针的杂交液在低于杂交温度3℃-5℃条件下反复冲洗切片.
2)用0.
1*SSC室温下冲洗,必要时可用放射线监测仪检测每一张切片,以防止过度冲洗.
3)70%、95%乙醇脱水,每一浓度中5min,空气干燥.
6.
放射自显影:(二)间期细胞内染色质DNA的原位杂交与间期细胞内DNA的原位杂交可应用冰冻切片、细胞涂片、石蜡切片.
玻片的准备同上述mRNA杂交法.
石蜡切片应将组织片附于涂有lmg/ml多聚赖氨酸的玻片上之后于80℃-120℃烘烤4h,以防止组织片脱落.
经脱蜡后再行原位杂交.
1.
杂交前玻片的预处理:(1)70%,95%乙醇中处理各5min,空气干燥.
(2)将玻片置于底部有2*SSC湿盒中,每张玻片加200μllmg/mlRNA酶(溶于20mmol/lNaAc,pH5.
0,沸水煮5min以去除DNA酶后,于-20℃保存,RNA酶消化细胞内总RNA时,其浓度可达100μg/ml,用2*SSC稀释),上加盖2.
2cm*2.
2cm盖片.
(3)用2*SSC洗玻片3次,每次5min.
70%、95%乙醇脱水,空气干燥.
(4)玻片置70mmol/lNaOH中3min,70%、95%乙醇脱水,空气干燥.
2.
杂交:(1)为防止杂交液蒸发,应在含50%甲酰胺的杂交液中37℃进行杂交(杂交液:50%甲酰胺、4*SSC、5*Denhardt氏液、l00μg/ml变性鲑精DNA).
如所用探针为dsDNA,使用前必须于90℃变性10分钟后于冰浴中快速冷却.
(2)每张玻片加杂交液20μl~50μl,加硅化之盖片后橡胶水泥或石蜡封闭周边.
(3)于密闭湿盒中37℃杂交12h~14h.
3.
杂交后处理:(1)杂交后将玻片从湿盒中取出,置于2*SSC中去掉盖玻片及杂交液,并于2*SSC冲洗切片2次,每次1.
5min.
(2)去掉非特异结合的探针:1)RNA探针的处理:A.
将玻片置于RNA酶溶液中(20μg/ml,溶于2*SSC中),于37℃消化1h.
B.
于2*SSC中冲洗玻片2次,每次10min.
C.
70%、95%乙醇脱水,空气干燥.
2)DNA探针的处理:A.
用2*SSS于低于杂交温度5℃冲洗3次,每次10min.
B.
70%、95%乙醇脱水,空气干燥.
4.
放射自显影.
(三)非放射性核素标记在核酸原位杂交中的应用近年来非放射性核素标记探针在原位杂交中得到了广泛的应用,其中应用最多的就是生物素.
DNA探针可用生物素化的dUTP或dATP进行标记,RNA探针可用生物素化的rUTP标记.
生物素标记之探针其Tm低于放射性标记之探针,并与标入的生物素量成反比.
上述探针可通过切口平移或随机引物法标记.
此外尚可应用光敏生物素(photobiotin)标记DNA、RNA或蛋白质,其标记的量大,但光敏生物素标记探针的本底高,其产生原因可能是由于探针中混有其它物质如蛋白质及无关核酸等,另一方面可能由于光敏生物素易于与带阴电荷的分子结合而产生假阳性结果.
生物素标记之探针可通过离心柱层析或SephadexG-50柱层析而纯化,亦可在加入载体DNA后经乙醇反复沉淀而纯化.
生物素化探针检测主要有抗生物素抗体检测及avidin/streptavidin检测.
抗体可以是单克隆抗生物素抗体,也可以是多克隆抗体.
两种抗体敏感性无明显差异.
卵白素(avidin)和链亲和素(streptavidin)是具有生物素结合特性的蛋白质,它们与生物素有极高的亲和能力.
Avidin是从卵清中提取的一种糖蛋白,分子量大约有66000,pI为10.
5.
Avidin碳水化合物成分带有正电荷,能与lectins(凝集素)及其它带阴电荷的生物素大分子(如核酸等)结合,因此其特异性较差.
而streptavidin为streqtomycesavidinii分泌的一种分子量为60000的蛋白质,不含有碳水化合物成分,pI为中性,因此比avidin有更高的特异性.
Biotin/streptavidin检测系统共有三种不同的方法:①streptavidin作为原始靶核酸与检测物(生物素化酶如碱性磷酸酶)之间的桥接物;②以streptavidin和生物素化酶复合物形式直接检测标记核酸上的生物素;③用荧光素标记之streptavidin直接检测生物素.
这三种方法中以第二种方法最为敏感,但其特异性较差.
第一种方法中作用的步骤较第二、第三种复杂.
常用的酶为碱性磷酸酶.
它能作用于底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoylphosphate,BCIP)与显色原硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium,NBT)而产生棕蓝色色物.
现已证实streptavidin-碱性磷酸酶-BCIP/NBT联合应用检测生物素化DNA时敏感性高.
改变这一系统中的任何成分将导致其敏感性降低.

以下介绍两种生物素标记探针的检测方法.
1.
抗生物素蛋白-碱性磷酸酶检测法(1)将玻片浸于22℃之抗生物素蛋白-碱性磷酸酶稀释液中(1:100稀释,稀释液TBT)30min.
注:TBT:0.
01mol/lTris·Cl,pH7.
5,0.
15mol/lNaCl,0.
25%(w/v)BSA,0.
05%TritonX-100.
(2)TBS(50mml/lTris·Cl,pH7.
2,100mmol/lNaCl)冲洗2次.
(3)在显色液中保温5min-20min.
(4)用蒸馏水冲洗5min,终止反应.
(5)42℃空气干燥,甘油明胶封片.
2.
抗生物素抗体检测法(1)将玻片在27℃在TBTl:50稀释之抗生物素抗体溶液中孵育30min.
(2)TBS冲洗2次,每次5min.
(3)将玻片于22℃,在TBTl:200稀释的生物素标记之兔抗鼠F(ab)2片段溶液中孵育30min.
(4)TBS冲洗二次,每次5min.
(5)将玻片浸于抗生物素-碱性磷酸酶液(TBTl:50稀释,含5%脱脂奶)中10min-20min.
(6)余同上述方法中(2)~(5)步.
【注意事项】1.
选择冰冻切片或细胞涂片固定液时,对不同组织应有区别.
肝、脾、肾等组织以乙醇:冰醋酸(3:1)为好;而多聚甲醛固定本底较高.
2.
切片在进入固定液之前,必须在空气中干燥至组织或细胞涂片表面没有水分,否则组织细胞极易脱落.
3.
探针的选择检测mRNA的原位杂交以RNA探针为佳,其制备简单、敏感性高.
其次为人工合成之寡核苷酸探针,这种探针可以进行组织胚胎发育中基因表达调控、剪切等研究.
4.
分辨率与标记探针所用的放射性核素种类有关,3H标记之探针分辨率最好,其次35S,而32P分辨率最差.
5.
所有操作过程必须戴手套,应尽可能使用镊子等器械操作,避免RNA酶的污染.
【思考题】1.
菌落原位杂交和组织细胞原位杂交的区别2.
组织细胞原位杂交实验中主要注意点是什么附核酸分子探针的标记在化学及生物学意义上的探针(probe),是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子,并可以被特殊的方法所探知.
例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、生长因子—受体等的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用.
所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段,能与互补核酸序列退火杂交,因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测.
要实现对核酸探针分子的有效探测,必须将探针分子用一定的示踪物(即标记物)进行标记.
标记的核酸分子探针是核酸分子杂交、DNA序列测定等技术的基础,已被广泛应用于分子生物学领域中克隆筛选、酶切图谱制作、DNA序列测定、基因点突变分析以及疾病的临床诊断等方面.

1.
原理在核酸分子杂交中,探针(probe)是指用放射性核素或其它标记物标记的核酸片段,它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段互补结合,因此可以用于检测核酸样品中的特定基因.
核酸探针可以是人工合成的寡核苷酸片段,可以是克隆的基因组DNA、cDNA全长或部分片段,也可以是RNA.
根据实验目的的不同,可以选择不同类型的探针.
但应注意的是,并非任何一段核酸片都可以作为探针,在选择探针时应该充分考虑到其特异性以及来源是否方便等.

直到上世纪70年代初期,还只能通过代谢标记法使放射性标记掺入到核酸分子上.
此法把放射性标记前体(通常为32P)导入正在合成目的DNA的细胞中.
这种做法不但需要大量的放射性标记物,纯化目的核酸费时费力,而且只能用于少数DNA(例如病毒基因组).
此外,采用这种方法制备的探针放射性比活度相对较低[<1*106-2*106计数/(分·μg)].
70年代发展了两种在体外对核酸进行放射性标记的方法:①由T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化法,此法将ATP的γ-磷酸转到DNA或RNA的5'羟基端.
②切口平移法,此方法利用大肠杆菌DNA聚合酶I,把双链DNA上未标记的核苷酸置换成α-32p标记的核苷酸.
这两种反应均快速有效,所用放射性前体仅及代谢标记法的1/1000-1/100,而所产生的探针的比活度则要高一个数量级.
因此这两种方法理所当然地被广泛接受且成为分子克隆的主干方法.

但是,用这两种方法制备的放射性标记探针也有一定的局限性.
磷酸化法充其量只能在每个核酸分子的5'端导入一个放射性标记原子,因此制约了探针的比活度;而切口平移,虽然能在遍及整个分子的多处引入放射性标记前体,但所产生的探针是一个含模板DNA双链序列的片段.
结果在某些情况下,探针互补双链的重结合就会和靶DNA链与标记链的杂交相竞争.
为避免此问题,随后又建立了一些方法来合成单链探针,而这些探针与克隆在噬菌体M13或噬菌粒载体上的DNA序列互补.
虽然此方法可以合成具有固定长度和高比活度的单链探针,但由于它需要通过凝胶电泳把新合成的探针与未标记的模板分开,因此使人望而生厌.
后来提出了一种简单而有效的方法,即把克隆化DNA区段体外转录成高比活度的单链RNA.
由于此转录物的合成效率高,且不必经凝胶电泳与模板分开,因此如今在大多数情况下被选作探针.
而且,RNA探针与DNA和RNA形成的杂交体比DNA:DNA杂交体要稳定得多,DNA:RNA和RNA:RNA杂交体都不会被RNA酶消化.
因此可用RNA酶除去非特异结合的探针,而DNA:RNA或RNA:RNA杂交体则不受影响.

近年来,随着DNA合成仪的问世及其使用的逐步推广,越来越多的研究者更热衷于采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针,其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列,避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响;由于大多数寡核苷酸探针长度只有15bp-30bp,其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(Tm),因此它特别适合于基因点突变分析;另外,由于序列的复杂性降低,因此杂交所需时间也较短.
需要注意的是,短寡核苷酸探针所带的标记物较少,特别是非放射性标记时,其灵敏度较低,因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时,以采用较长的探针为好.

2.
各种核酸标记物及其选择核酸分子杂交技术能在分子生物学范畴得到如此广泛的应用,在很大程度上得益于高度灵敏的示踪物—放射性核素.
应用放射性核素可以检测出1g-10g高等生物基因组DNA中的单拷贝基因.
近年来,众多的科学工作者由于不满意于放射性核素的半衰期短、污染环境等缺点,而不断致力于新的探针标记物的研制工作,现已有不少非放射性标记物得到应用,当前虽仍不能完全替代放射性核素,但相信在不久的将来会有更好的放射性核素替代物问世.

(1)放射性核素是目前应用最多的一类探针标记物.
其灵敏度极高,在最适条件下,可以检测出样品中少于1000个分子的核酸.
由于放射性核素与相应的元素之间的差别只在于中子数上,而质子和电子数一致,因此具有完全相同的化学性质.
它们对各种酶促反应均无任何影响,也不影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质.
此外,放射性核素的检测具有极高的特异性,假阳性率较低.
其主要缺点是存在放射线污染,而且半衰期短,探针必须随用随标记,不能长期存放.

目前在实验室中,用于核酸标记的放射性核素主要有32P,3H和35S等,其中32P在核酸分子杂交中最常用到.
它具有放射性强、释放的β-粒子能量高和穿透性较强等特点,因而放射自显影所需的时间短,灵敏度高,可广泛应用于各种滤膜杂交,特别适合于基因组中单拷贝基因的检测.
缺点是,半衰期短(14.
3天),射线散射严重,导致X线胶片上带型的轮廓不清,有时甚至会影响结果的分析.
商品化的32P主要是以标记的各种核糖核苷酸([32P]-NTP)和脱氧核糖核苷酸([32P]-dNTP)的形式提供的.
主要有水溶液和乙醇:水(1:1)溶液两种,前者可以直接使用,而后者在使用前须进行浓缩干燥,可以依据探针标记方法的不同,来选择合适的标记核苷酸.
在标记前,应注意所采用的放射性核素的比放射活性,它反映的是核苷酸分子中32P的取代比例.
实验室中常用的比放射活性为111TBq/mmol(3000Ci/mmol)的dNTP.
在同等放射活性时,比放射活性越高,核苷酸分子的浓度就越低,而核苷酸的浓度是多数酶促反应的重要限速因素,核苷酸浓度过低会降低探针的标记效率.
(2)非放射性标记物多年来,科学家们一直在寻找一种安全可靠、灵敏度高的标记物以替代放射性核素用于核酸探针的标记.
部分非放射性标记物已开始在国内外推广使用,并取得了比较理想的效果.
光学检测系统的发展更增加了非放射性系统的灵敏度,也拓宽了应用范围.
非放射性标记物的优点是,无放射性污染,稳定性好,标记探针可以保存较长时间,处理方便;主要缺点是灵敏度及特异性有时还不太理想,标记反应结束后不能立即确定探针的标记效率.
这类标记方法还有待于进一步的改进.

目前用于核酸分子杂交的非放射性标记物主要有以下几种:(1)生物素(biotin):是最先被用于核酸探针标记的非放射性标记物,它通过连接臂与dUTP或UTP的嘧啶环第5位的C原子相连,修饰后的dUTP或UTP可以替代dTTP掺人到标记探针中去,目前在标记反应中较常采用的是生物素-11-dUTP.
在溶液中,生物素可以与卵白素(avidin)和链亲和素(streptavidin)特异性结合,因此可以通过偶联有荧光素或特定的酶如碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)或辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)的卵白素或链亲和素来进行检测.
应该注意的是,生物素标记的DNA不能用酚进行抽提,因为生物素可以使标记的DNA分布于有机相与无机相的交界面或完全在有机相中.
(2)地高辛:是目前应用比较广泛的另一种非放射性核酸标记物,在酶学反应中替代dTTP而掺人到标记探针中去.
Roche诊断试剂公司(瑞士)可以提供地高辛-11-dUTP用来标记核苷酸.
地高辛标记的探针可以通过偶联有荧光素或特定的酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的抗地高辛单抗来进行检测.
由于内源性的地高辛只存在于Digitalis植物中,因此杂交结果的本底比较低.
地高辛标记的探针非常稳定,在-20℃条件下可以保存几年之久.

(3)荧光素:如FITC和罗丹明等,主要以荧光素-11-dUTP的形式提供,在相应酶的作用于可以很方便地被掺人到探针中去.
它们可以通过紫外线激发产生荧光来进行检测,主要适用于细胞原位杂交.
荧光素半抗原对光非常敏感,标记后的探针应该避光保存在-20℃.

3.
放射性探针的标记(1)切口平移法切口平移法是目前实验室中最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法.
它利用大肠杆菌DNA聚合酶I(E.
coliDNApolymeraseI)的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去,从而合成高比活的均匀标记的DNA探针.
线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板.
首先,极微量的DNaseI在Mg2+的存在下,在DNA链上随机形成单链切口.
利用大肠杆菌DNA聚合酶工的5'→3'核酸外切酶活性在切口处将旧链从5'-末端逐步切除.
同时,在DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性的催化下,顺序将dNTP连接到切口的3'-末端-OH上,以互补的DNA单链为模板合成新的DNA单链.
如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸(如32P-dCTP),则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基,从而形成高放射活性的DNA探针(图8-1).

(2)随机引物法随机引物标记法(randomPriming)是近年来发展起来的一种较为理想的核酸探针标记方法,是实验室中标记DNA探针的常规方法之一,可以得到比活度非常高的探针,适用于一般杂交实验.
较常采用的随机引物大多是六核苷酸片段的混合物,这些分子在每一个位置上都可能含有所有4种碱基的组合,因此它们可以与任意的核酸序列互补结合.

探针标记的基本过程是,首先将变性的DNA分子与寡核苷酸随机引物杂交,然后以这些寡核苷酸为引物,在一种标记dNTP和3种未标记dNTPs存在的条件下,大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow大片段沿单链DNA模板,起始DNA链的合成,这样就可以得到标记的DNA探针(图8-2).
由于寡核苷酸引物的序列并不均一,它们会在多个位置上同模板杂交,从而引导DNA延伸,因此模板上的每段核苷酸片段都可以很好地在探针中得到体现.

(3)单链DNA探针的标记单链DNA探针与双链DNA探针相比,其杂交效率更高.
这是由于双链DNA探针在杂交时,除与目的基因序列杂交外,双链DNA探针两条链之间还会形成自身的无效杂交;而单链DNA探针则避免了这种缺点.

一般采用M13噬菌体体系进行单链DNA探针的标记.
人工合成的寡核苷酸作为引物首先与克隆了特异基因片段的M13噬菌体DNA杂交,在α-32P-dNTP的存下,利用E.
coliDNApolymeraseIKlenow片段的链延伸反应合成高放射性的单链DNA探针.
用适当的限制性内切酶切取所需探针序列,然后用变性胶电泳分离得到单链DNA探针.
双链RF型M13DNA也可方便地用于单链DNA探针的制备,选择适当的引物(上游或下游引物)可得到相应的正链或负链DNA单链探针(图8-3).
作为引物的寡核苷酸一般采用互补于M13噬菌体多克隆位点3'端序列的"通用引物"(universalprimer,正链引物:5'-CACAATTCCACACAAC-3',负链引物:5'-TCCCAGTCACGACGT-3')也可以人工合成一段互补于插入序列的寡核苷酸片段作为引物.
(4)cDNA探针的标记来源于鸟类髓母细胞病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)的反转录酶是一种依赖于RNA的DNA聚合酶,具有多种酶促活性,包括5'→3'DNA聚合酶活性及RNA/DNA杂交体特异的RnaseH酶活性.
此酶主要应用于将mRNA反转录成cDNA而应用于cDNA克隆,亦可用于RNA或单链DNA模板的32P-标记探针的制备.

当以poly(A)mRNA为模板时,反转录酶的引物可以是oligo-dT,也可采用特异的寡核苷酸引物,还可采用随机寡核苷酸作为引物反转录得到的产物RNA/DNA杂交双链经碱变性后,RNA单链可被迅速降解成小片段,经SephadexG-50柱层析即可得到单链DNA探针.

(5)RNA探针的标记在许多人工构建的载体中含有可以被噬菌体RNA聚合酶如SP6、T3或T7特异识别的启动子序列,将目的基因片段克隆到它们的下游,再采用适当的限制性内切酶在插入序列的下游将重组质粒线性化,在1种标记NTP和3种非标记NTPs存在时,特异的RNA聚合酶将以目的DNA片段为模板转录合成互补的RNA探针.
标记结束后,体系中含有的DNA模板可以通过无RNase污染的DNase处理而清除.

这种标记方法的优点是:①标记产物产量高,可以得到多拷贝数的RNA探针;②标记探针活性高;③与DNA探针相比,特异性高,RNA探针形成的杂交分子稳定性更好,杂交反应和洗膜可以在更为严格的条件下进行,增强了杂交反应的特异性,信噪比得到提高;④探针的大小比较恒定,增加了杂交的敏感性及均一性,而且还能防止DNA中第二条链的竞争性杂交,杂交后用RNA酶消化单链未杂交的探针可以明显降低本底;⑤由于克隆于载体中的DNA序列可以从不同的方向进行转录,合成的RNA探针可以是任一条链的互补链,从而可以控制杂交反应的特异性.

(6)寡核苷酸探针的标记人工合成的寡核苷酸片段作为分子杂交的探针已日益为更多的研究者所青睐.
利用寡核苷酸探针可以检测到靶基因上单个核苷酸的点突变.
对于带粘性末端的双链寡核苷酸可利用KlenowDNA聚合酶的填充反应进行末端标记.
而对于单链寡核苷酸,则可预先合成一小段(如8-mer)与此探针互补的寡核苷酸作为引物,然后利用KlenowDNA聚合酶的链延伸反应获得标记的寡核苷酸探针.
此法的特点是模板DNA与标记的DNA探针的长度不相同.
因此如果需要的话,可采用电泳方法将它们分离开来.
4.
非放射性探针的标记按照标记方法的不同,现有的非放射性标记物主要有两种类型,一种是预先已连接在NTP或dNTP上,因此可像放射性核素示记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到枋酸探针上,如生物素,地高辛等;另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上.
此后一类标记物标记过程更为简单,可以是今后研究发展的主流.

目前应用最广的非放射性标记物是生物素(biotin).
生物素是一种小分子水溶性维生素,通过一条碳链臂,可与UTP或dUTP嘧啶环的5位碳相连.
生物素与尿嘧啶5位碳的相连不会影响其通过氢键形成碱基配对的能力与特异性,而且仍然是许多DNA修饰酶的良好底物.

除dUTP外,一系列生物素标记的dATP和dCTP也已被研制和应用.
德国BoehringerMannheim公司生产的地高辛(digoxigenin)标记物也已被逐步推广使用.
(1)酶促标记法生物素和地高辛标记的dNTP可以完全像放射性核素标记的dNTP一样,用多种酶促方法(如切口平移法、随机引物法及末端转移酶末端标记法等)进行核酸探针(包括DNA、RNA和寡核苷酸探针)的标记.
由于操作方法与前文所介绍的放射性核素标记法基本相同,不再赘述.
但要注意,由于生物素等标记物是连接在碱基上,而不是磷酸基团,因此不能用多核苷酸激酶法进行末端标记.

(2)化学标记法酶促标记方法最大的缺点是需根据不同的需要选用不同的标记核苷酸底物和不同的酶,并且当声要大量的核酸探针时,耗费极巨.
而化学标记方法则简单迅捷,价格低廉.
当然,不同的标记物其标记方法亦不同,本文仅简要介绍其标记原理,具体操作方法按厂家使用说明书进行.

N-Acetoxy-N-2-Acetylaminofluorene(AAF)此化合物是第一种被采用的用化学标记法标记的非放射性标记物.
AAF可在37℃中性pH下迅速与单链及双链RNA或DNA反应(主要部位是鸟嘌呤的C8位,如图8-4).
可用此化合物的特异抗体和酶联第二抗体进行间接酶联免疫检测法检测.
可用于Southern、原位、斑点杂交及克隆筛选.
标记的探针至少在6个月内是稳定的.
但此化合物是一种致癌物,使用时要特别注意.

5.
标记探针的纯化DNA探针标记结束后,反应体系中依然存在未掺人到探针中去的dNTP(标记的与未标记的)等小分子,如果不将它们去除,有时会干扰随后的杂交反应.
通过凝胶过滤层析法或选择性沉淀法沉淀标记的DNA分子均可以很方便地去除这些小分子.
当标记核苷酸的掺人效率超过60%时,探针在大多数情况下可以直接用于核酸杂交.
只有当标记核苷酸的掺人效率很低时才需要作进一步的纯化.

凝胶过滤层析通过其分子筛作用,可以将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子以及寡核苷酸有效地分离开来,大的标记探针将首先流出,而小分子则滞留在凝胶层析柱中.
常用的凝胶基质是SephadexG-50和Bio-GelP-60,所获得的探针的长度一般大于100nt.
在乙醇存在时,醋酸铵可以选择性地沉淀长度超过20nt的核酸分子,而未掺人DNA的dNTP则保留于上清中,因此通过两次醋酸铵沉淀就可以取得较好的分离效果.
如果DNA浓度较稀(<10μg/m1),可加入10μg酵母tRNA进行共沉淀以提高沉淀效率.
第九节综合性实验实验十五、蛋白质双向电泳【实验目的】分离、检测和分析来自于全细胞、组织或生物体中所包含的混合蛋白质.
一方面指分离生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质;另一方面指分离不同时期细胞表达的差异蛋白质,如蛋白质在不同环境下的差异表达,以发现有差异的蛋白质种类为主要目标.
在基础医学和疾病机理研究中,常用于分离人类不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的蛋白质.

【实验原理】双向电泳(Two-dimensionalgelElectrophoresis,2-DE)是目前蛋白质组研究中所采用的最有效的分离技术,是蛋白质组技术的核心.
它包含两个步骤,即一维的等电聚焦和二维的SDS-PAGE.
一维等电聚焦的基本原理是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同,在一个稳定、连续和线性的pH梯度介质中通过高电压进行分离和分析.
如果蛋白质所在的点的pH值与其等电点不符,则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷.
在高于其等电点的位置,蛋白质带负电荷,反之则带正电荷.
此时,如果加以强电场,蛋白质分子会在电场作用下分别向正极或负极漂移.
当达到其等电点位置时,蛋白质将不再带电荷,就不再漂移.

一维固相pH梯度等电聚焦中所用IPG(ImmobilizedpHgradients,IPG)胶条的材料是两性电解质(Immobilines),为具有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列,它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系.
通过大量的计算、分析和实验,人们获得制备IPG胶条的合适配方.
研究人员按照所获得的配方计算后,将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合,在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度.
通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用,因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态.
等电聚焦随着聚焦时间的延长,会出现pH梯度不稳,从而产生阴极漂移的现象.
IPG胶条通过两性电解质共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度,克服了等电聚焦这方面的缺点,从而能够实现高度的重复性.
目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线,范围或宽或窄的pH梯度的IPG胶条.
新的酸性pH3~5或碱性pH6~11的IPG凝胶pH梯度联合商品化的pH4~7的梯度凝胶可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomiccontigs)从而对样品进行有效分离.
二维SDS-PAGE的原理是在一维电泳基础上将胶条上的蛋白质根据分子量不同,用SDS-PAGE凝胶分离,从而使复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开.
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联试剂N-N'-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的情况下聚合而成.
聚合过程中,丙烯酰胺的单体形成长链,由N-N'-甲叉双丙烯酰胺的功能基团和链末端的功能基团反应而交联.
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构,具有分子筛效应.
影响蛋白质电泳的因素主要有三种:蛋白大小,形状和电荷.

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构.
而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂.
当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后,则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,其它因素可以忽略不计.
与连续缓冲系统相比,采用不连续缓冲系统进行SDS-PAGE能够提高分辨率.
目前,常用的双向电泳方法分为非变性2D-PAGE、非变性/SDS-2D-PAGE、非变性/还原/SDS-2D-PAGE、变性2D-PAGE四种.
非变性2D-PAGE是两向均在非变性条件下进行,这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的.
非变性/SDS-2D-PAGE是第一向采用非变性IEF,之后在2%SDS溶液中平衡;第二向也在SDS存在的条件下进行.
适于分析非共价键连接的蛋白-蛋白间的相互作用.
非变性/还原/SDS-2D-PAGE:非变性条件下IEF聚焦,之后用变性剂进行平衡,再进行第二向SDS-PAGE电泳.
此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、质谱分析鉴定,提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息.
变性2D-PAGE是样品先用变性剂在95℃变性5分钟,一维等电聚焦,然后胶条用变性剂平衡,再进行SDS-PAGE.
该技术适于DNA序列和多肽结构的分析,或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性,但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式.

双向电泳具有下列特点:①一次分离就可满足后续分析的需要;②高灵敏度和高分辨率,灵敏度可以达到10-15~10-18mol水平;③所获得的信息便于计算机分析处理;④电泳结果可与分析鉴定方法相匹配.
双向电泳的基本步骤如下:①样品制备,包括蛋白质的溶解、变性及还原、去除非蛋白质杂质等.
②第一相等电聚焦.
目前,第一相等电聚焦大多采用AmershampharmaciaBiotech公司的IPGphor或Bio-Rad公司的仪器.
通常采用的胶条厚度为0.
5mm,宽3mm;pH范围通常有3~10、4~7、6~11几类,上样量可达毫克级.
③第二相SDS-PAGE.
④蛋白质的检测.
电泳后胶上蛋白质的检测有多种方法,灵敏度和分辨率有一些差异,可根据上样量、分析要求等加以选择.

样品制备.
通常采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析.
有些实验需要对样品进行预分级,即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同的部分,再分别进行蛋白质组研究.
样品预分级的方法主要是根据蛋白质溶解性不同和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位来进行的,如分别分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分.
样品预分级的处理不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和方便检测,还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究.
一种方法是用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分,再用相应的蛋白质溶解液进行溶解.
这种方案的优点是不仅大大减少样品的复杂性,而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位.
但该方法需要专业仪器,有时会出现假阳性.
另一种方法是顺序抽提法.
根据细胞中蛋白质溶解性的差异,分别加入不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提.
首先加入Tris碱溶液裂解细胞,提取高溶解性蛋白.
离心收集未溶解的沉淀加入标准IEF样品液进行溶解,提取高疏水性蛋白.
然后用含有复合表面活性剂的蛋白溶解液抽提蛋白,最后抽提前面步骤不能溶解的膜蛋白,约占整个样品的11%(W/W).

医学院校中对临床组织样本进行研究来寻找疾病标记,是蛋白质组研究的重要方向之一.
但临床样本往往是各种细胞或组织混杂在一起的,而且状态不一.
如肿瘤组织中,发生癌变的多是上皮类细胞,而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂.
所以,如果将癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异蛋白的比较,实际上是多种细胞甚至组织蛋白质混合物的比较.
最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面有一些新的进展,可以用于制备蛋白质组研究所需要的单一细胞类型.
如采用显微切割、激光捕获微解剖(LaserCaptureMicrodissection,LCM)方法分离癌变上皮类细胞.
在实验设计过程中,要根据研究目的来确定样品制备的方法.
总的来讲,应该遵循这样的原则:①应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括疏水性蛋白),并且制备方法应具有可重现性.
样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一.

溶解的目标:一是样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体被完全破坏,从而形成各个多肽的溶解液.
否则,样品中结合牢固的蛋白复合物可能会在双向电泳中出现新的蛋白点,相应的表示单个多肽的点的强度会下降.
二是溶解方法有利于去除可能干扰双向电泳分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质.
三是溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态.
因此,在实验过程可以考虑使用加入变性剂、表面活性剂、还原剂和两性电解质等试剂来增加样品的溶解性.
变性剂可以通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域,增加蛋白质的溶解度.
常用有尿素和硫尿两种.
经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后,还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团.
常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等.
其中CHAPS和SB3~10效果较好.
在变性剂和表面活性剂联用条件下,样品中加入还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全,溶解更彻底.
常用含自由巯基的DTT或(-巯基乙醇,以及不带电荷的三丁基膦(TBP)进行还原.
②在样品制备过程中防止样品发生抽提后的化学修饰(如酶性或化学性降解等).
③样品中的核酸和某些干扰蛋白要完全去除.
双向电泳样品中如果有核酸的存在,会增加样品粘度、与蛋白质形成复合物而出现假象迁移和条纹.
去除核酸的方法是用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解,或是利用合成载体两性电解质(SCA)同核酸结合形成复合物的能力,再通过超速离心来去除复合物.
④尽量除去起干扰作用的高丰度蛋白或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性.
虽然增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加双向电泳分离时低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷,造成蛋白的叠加效应而影响分离.
目前常用先进行样品预分级、再用窄pH范围的胶条分离:即将总蛋白分成蛋白质组亚群,再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行双向电泳分离.
⑤防止样品在一维等电聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀.
某些情况下,即使在变性剂和表面活性剂存在的情况下,某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态,否则这些蛋白质在处于其pI点时会发生沉淀,这就需要在样品中加入两性电解质维持蛋白的溶解性.
除此之外,对于一些比较特殊的蛋白样品,需要采用不同的策略进行制备.
比如:强碱性蛋白质(如核糖体)样品,可先将蛋白预处理以富集,再用特殊pH梯度的IPG胶条(如pH3~12、4~12或10~12)进行等电聚焦.
使用窄范围碱性IPG胶(如pH10~12)需要注意克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式,而宽范围的碱性IPG胶条(如pH3~12、4~12)的使用可以消除窄范围胶所需要的专门水化液.
小于8kD和大于200kD的极端分子量的蛋白质样品,在常规双向电泳结果上不易观察.
这可能是在上样缓冲液中,样品和游离的硫酸钠离子持续积累浓缩,与小分子量的蛋白质发生对流混合,产生茸毛状或模糊的带,从而降低了小蛋白的分辨率.
双向电泳结束后凝胶的底部,高浓度的十二磺酸使蛋白点的固定、染色比较困难.
高分子量蛋白难以观察到的原因可能是在变性条件下,蛋白质复合物变成了多肽,或者可能是大分子.

蛋白样品在进行一维等电聚焦电泳时,需要对不同阶段的处理时间进行优化.
理论上讲,IEF分离达到稳定态所需要的时间就是获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间.
如果聚焦时间太短,会导致双向电泳图谱上出现水平和垂直条纹.
如果聚焦时间太长,虽然不会导致蛋白质向阴极漂移,但会因为活性水转运而导致IPG胶表面渗出(电渗)过多水,造成双向电泳结果中蛋白图谱变性,在胶条碱性端产生水平条纹,甚至会导致蛋白点的丢失.
因此,最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度经过多次实验来确定.

表3-1Bio-Rad公司仪器提供的参考参数设置如下(17cm胶条)步骤电压条件时间目的水化50V17℃12~16小时主动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速1小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持一维等电聚焦结束后可对胶条进行二维电泳,也可将其保存在塑料膜间于较低温度下保存,半年内进行二维电泳仍可获得较好的图谱.
在二维电泳前一定要通过相应的试剂对胶条进行平衡,目的是让被分离的蛋白质与SDS完整结合,从而保证二维电泳的顺利进行.
建议采用如下配方的平衡缓冲液对胶条进行平衡:首先用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)二硫苏糖醇(DTT)、6mM尿素和30%甘油的50mMTris(pH8.
8)缓冲液室温下平衡15min;再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液室温下平衡15min.
如果用非离子型还原剂如三丁基膦(TBP)代替DTT则只需进行一步平衡.
二维SDS-PAGE与普通SDS-PAGE操作类似.
因为一维电泳结束后,在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩,可以认为非限制性的胶条(低浓度丙烯酰胺胶)起到了浓缩胶的作用,因此在垂直电泳系统中不再需要配制浓缩胶.

电泳结束后,采用恰当的显色方法对凝胶上的蛋白点进行显色.
高灵敏度的检测技术,是将简单的蛋白质点呈现转换为集成化的蛋白质微量化学表征过程中的关键步骤.
而传统的考马斯亮蓝染色和银染方法在蛋白质组研究中的存在着一定的局限性.
新的染色技术如荧光标记、同位素标记技术在提高了灵敏度的同时,也与自动化的蛋白质组平台切胶技术和下游的蛋白质鉴定技术有很好的兼容性.
蛋白质的显色技术正向高灵敏度和自动化方向发展.
值得注意的是,不同染色方法对设备和仪器要求不同,研究者在选择时需综合考虑实验中的各种因素,选择当前条件下的最佳方案.

目前,常用的蛋白质显色方法有:染色法(考马斯亮兰染、银染、铜染)、同位素标记、抗体标记、荧光标记(荧光桔、荧光红等)等.
任何一种显色方法,我们都需要从安全性、灵敏性、特异性、稳定性、兼容性以及操作过程是否快速、简单这七个方面对其进行评估.

考马斯亮蓝(Commassieblue)染色.
考马斯亮蓝染料上的芳香苯环能与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸结合形成较稳定的复合物形式从而使蛋白质显色.
而一些电荷异常或构象异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质(某些糖蛋白)以及一些结构蛋白(如胶原蛋白)等都不能被考马斯亮蓝染色.
这种方法可以检测到30~100ng的蛋白质.
其优点是染色过程简单,所需配制的试剂少,操作简单,无毒性,染色后的背景及对比度良好,与下游蛋白质鉴定方法兼容.
在样品量充足的情况下,考染是一个比较好的选择.
其缺点是所需时间较长,染色过程大约需要24~48小时,灵敏度远低于银染和荧光染色检测.

银染方法的原理是银离子与蛋白质分子上的羧基(COO-)结合.
在碱性条件下,甲醛将银离子还原成金属银,从而使银颗粒沉积在蛋白点上.
染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关,不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染.
银染是非放射性染色方法中灵敏度最高的,其灵敏度可达200pg,成本较低,是目前差异蛋白质组分析中最常用的显色方法.
缺点是,银染方法中醛类的特异反应,使得对凝胶酶切肽谱提取存在困难.
目前大多数实验室采用银染凝胶进行图谱分析,后用加大上样量的方法进行考染,进而进行切胶的下游鉴定.
但由于银染和考染特异性不同,使得这两种方法所得二维电泳图谱可比性不好,不利于蛋白质研究的高通量筛选.

负染的原理主要是有选择的将金属离子沉淀在凝胶上,蛋白质条带不能被染色,因此,它们所处的位置是透明的.
考染和银染方法两种方法,其蛋白质回收率都很低,使得用于随后的微量化学表征的样品量不足.
负染的开发是专门为提高胶上蛋白回收率而设计的.
染色过程约需5~10分钟即可完成,蛋白质的生物学活性得到保持.
缺点是灵敏度不够高.

荧光染色原理是利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对两种蛋白质样品进行荧光标记,并在同一块凝胶上同步运行.
由于两种修饰后染料的激发波长不同,用两个波长范围对凝胶进行扫描,可以同时得到两个图像,经相应软件匹配,可方便地找到两个样品间的差异,即完全避免了实验因素对重复性的影响.
荧光试剂对蛋白质无固定作用,与质谱兼容性好,灵敏度高,线性范围高,适合于大规模蛋白质组研究.
缺点是标记过程中的共价修饰和荧光探针淬灭作用可能改变样品中蛋白的某些性质(如移动性能、溶解性能等),标记蛋白与未标记蛋白质间的轻微相对分子质量的差异,可能会导致分离后蛋白质的后续分析出现偏差.

【实验材料】1.
仪器:双向电泳仪、灌胶支架、玻璃板、电源、电泳槽、电子天平.
2.
试剂:(1)双向电泳试剂:上样缓冲液、矿物油、DTT、碘乙酰胺、10%过硫酸铵、TEMED、10%SDS、0.
5%琼脂糖、1.
5MpH8.
8Tris-HCl、胶条平衡缓冲液母液、30%丙烯酰胺贮液、10*Tris-甘氨酸电泳缓冲液.
几种试剂配制方法如下:1)水化上样缓冲液:尿素4.
805g,CHAPS0.
4g,1%溴酚蓝10l,用MilliQ水定容至10ml.
-20℃分装保存.
2)胶条平衡缓冲液母液:尿素36g,SDS2g,1.
5MpH8.
8Tris-HCl25ml,甘油20ml,用MilliQ水定容至100ml.
-20℃分装保存.
3)胶条平衡缓冲液I(现配):胶条平衡缓冲液母液10ml,DTT0.
2g.
4)胶条平衡缓冲液II(现配):胶条平衡缓冲液母液10ml,碘乙酰胺0.
25g.
(2)银染试剂:乙醇、冰醋酸、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甲醛.
银染法几种试剂配制方法如下:1)固定液:乙醇100ml,冰醋酸25ml,蒸馏水定容至250ml.
2)致敏液:乙醇75ml,乙酸钠17g,三水乙酸钠28.
2g,硫代硫酸钠0.
5g,蒸馏水定容至250ml.
3)银染液:AgNO30.
625g,甲醛100l,蒸馏水定容至250ml.
4)显色液:Na2CO36.
25g,甲醛50l,蒸馏水定容至250ml.
5)终止液:EDTA.
Na2.
2H2O3.
65g(或者甘氨酸1.
0g),蒸馏水定容至250ml.
【实验步骤】(一)第一向等电聚焦(7cmIPG胶条,pH3~10)取-20℃冷冻保存的上样缓冲液(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶化.
加入0.
01gDTT,Bio-Lyte4~6、5~7各2.
5(l,充分混匀.
取400(l上样缓冲液,加入100(l样品,充分混匀.
取出-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(7cm,pH3~10),室温放置10分钟.
沿着聚焦盘中槽的边缘从左到右线性加入样品.
槽两端各1cm左右处不要加样,中间的样品液一定要连贯.
注意:不能有气泡产生,否则将影响胶条中蛋白质的分布.
用镊子轻轻去除IPG胶条上的保护薄膜.
分清胶条的正负极,胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极.
轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中样品液上.
确保胶条与电极紧密接触.
不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收.
注意胶条下面的溶液不能产生气泡.
如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外.

沿着胶条,缓慢加入矿物油,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上.
每根胶条上覆盖约2~3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发.
对好正、负极,盖上盖子.
参照仪器说明书设置等电聚焦程序.
(二)胶条平衡在一维等电聚焦结束前预先制备好二维电泳的凝胶.
待等电聚焦结束后,用滤纸轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品.
置于平衡缓冲液Ⅰ中,室温振荡平衡15分钟.
彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I.
再加入胶条平衡缓冲液II,室温振荡平衡15分钟.
将IPG胶条从样品水化盘中移出,用滤纸轻轻吸干胶条上平衡缓冲液II,进行第二向SDS-PAGE电泳.
否则将等电聚焦结束的胶条立即置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存.

(三)第二向SDS-PAGE电泳配制10%的丙烯酰胺凝胶,凝胶数量与一维电泳胶条数目一致.
因为蛋白样品在IPG胶条上,因此不再需要用梳子制备点样孔.
用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体.
将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己.
将平衡后的胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上.
其余胶条同样操作.
将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己.
用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.
注意不要在胶条下方产生任何气泡.
在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面.
在凝胶的上方缓慢加入低熔点琼脂糖封胶液.

放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固.
在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后.
将凝胶转移至电泳槽中.
在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源.
开始时设定低电流或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳.
电泳结束后,戴上手套,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,切角作记号.
(四)染色(银染法)将双向电泳结束获得的每块凝胶各置于一较大塑料长方形盘中,分别倒入250ml固定液.
振荡,固定时间30min以上.
完全倒掉固定液,每个方形盘中加入250ml致敏液,振荡,30min.
倒掉致敏液,每个方形盘中加入双蒸水,振荡,10min.
再重复洗涤2次.
倒掉洗涤液,每个方形盘中加入银染试剂250ml,振荡20min.
同第3步操作,水洗2次,每次1min.
注意把握时间,水洗时间长显色速度慢,点的颜色偏黄色.
倒掉洗涤液,加入显色液,振荡.
随时观察,以标准蛋白品的条带为参考,决定显色时间长短.
待标准蛋白品的条带清晰时,立即倒掉显色,迅速加入终止液.
每个方形盘加入250ml,振荡,10min以上.
倒掉终止液,每个方形盘中加入1%冰醋酸,4℃保存.
如果染色试剂是购买的试剂盒,请参加其附带的说明书进行操作.
【注意事项】双向电泳整个操作过程中,实验人员都需要戴上手套.
将水化上样缓冲液分装后再储存于-20℃.
用时,只要解冻需要量,其余继续储存.
水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻.
如果在等电聚焦过程中,聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收,留在胶条的外面,这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路,而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦.
这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾.
为了减少形成并联电流通路的可能性,可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀,然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中.
在转移过程中,要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体.

程序设置中的除盐步骤,可根据具体情况进行设置,如果样品中含盐量较高可设置多步除盐,并加长除盐时间.
但这种方法只能除去很少量的盐离子,所以最好是在上样前,对样品进行除盐处理.
在一维加样、放置IPG胶条、用琼脂糖密封胶条时都不能有气泡的产生.
【思考题】双向电泳的原理是什么样品制备过程中有哪些方面是需要注意的实验十六、酵母双杂交实验【实验目的】1.
掌握酵母双杂交的实验原理2.
掌握酵母双杂交实验的操作步骤和要领【实验原理】酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)是研究蛋白质间相互作用的新技术.
其原理是利用真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域(bindingdomain,BD)和转录活化结构域(activationdomain,AD)共同完成的,这两个结构域通过共价或非共介连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键.
根据这一特点,如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y与空间上相互分离的BD和AD分别形成X-BD和Y-AD的杂合蛋白的形式,在酵母中表达并分布于细胞核中,若X与Y之间的发生相互作用时,就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列(upstreamactivationsequence,UAS)结合,进而发挥激活转录的功能,使受调控的下游报告基因得到表达(图2-XX4).
根据这一原理,双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究.
目前研究中常用BD基因有:GAL4(1-147),LexA(Ecoli转录抑制因子)的BD编码序列.
常用的AD基因有:GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等.
报告基因通常是LacZ基因,试验结果可以通过蓝白斑筛选很容易检测出来.
酵母双杂交系统主要应用于:①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用;②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸;③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质.
酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:①易于转化、便于回收扩增质粒.
②具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因.
③酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合.
图酵母双杂交系统工作原理图示【实验材料】1.
仪器:PCR仪,电泳仪,电转仪(基因导入仪),超净工作台,离心机,摇床,恒温培养箱,水浴锅2.
试剂载体质粒:pLexA-53,pB42AD-T,p8op-LacZ含报告基因的酵母菌株:EGY48(p8op-LacZ)大肠杆菌菌株:E.
coliKC8对照质粒:pLexA-pos(LexA/GAL4AD融合蛋白)阳性对照质粒;pLexA-Lam阴性对照质粒.
【实验步骤】1.
培养基的制作(1)YPDA培养基:蛋白胨20g/l,酵母浸出物10g/l,琼脂10g/l,维生素B4(硫酸腺嘌呤)0.
003%;加蒸馏水至950ml,调pH6.
5,121℃高压灭菌30min,待溶液温度降至55℃左右时,在无菌条件下加入40%的葡萄糖母液50ml.
注意,葡萄糖的灭菌条件为121℃,15min,温度过高,时间过长会使之焦化或分解.
(2)SD培养基:酵母含氮物(无氨基酸)6.
7g/l,琼脂20g/l,蒸馏水850ml,10(DO100ml.
pH5.
8,121℃高压灭菌30min,待溶液温度降至55℃左右时,在无菌条件下加入40%的葡萄糖使其终浓度达到2%(即加50ml40%的葡萄糖母液);(3)10(DO溶液(dropoutsolution)表7-310(DO溶液配制表营养成分10(浓度Sigma货号L-Adeninehemisulfatesalt200mg/lA-9126L-ArginineHCl200mg/lA-5131L-HistidineHClmonohydrate200mg/lH-9511L-Isoleucine300mg/lI-7383L-Leucine1000mg/lL-1512L-LysineHCl300mg/lL-1262L-Methionine200mg/lM-9625L-Phenylalanine500mg/lP-5030L-Threonine2000mg/lT-8625L-Tryptophan200mg/lT-0254L-Tyrosine300mg/lT-3754L-Uracil200mg/LU-0750L-Valine1500mg/LV-0500注:10(DO灭菌后在4℃可以保存1年,如果要配某一营养成分(如-Ura)缺陷的10(DO,只需将其(L-Uracil)不加入即可.
(4)SD/Gal/Raf/-His/-Ura/-Trp/-Leu培养基:在SD培养基中添加50%的半乳糖(galactose)母液和40%的棉籽糖(raffinose)母液至终浓度分别为2%和1%,而10XDO中则不含组氨酸、色氨酸、亮氨酸和尿嘧啶.
2.
酵母感受态细胞的制备:在新鲜培养的YPDA平板上挑取1个EGY48(p8op-LacZ)单菌落,接种于50mlYPDA培养基中,30℃,250rpm振荡培养15-18小时,使其OD600大于1.
5,再从其中取出一定体积的培养物到300ml的YPDA培养基中,调整OD600为0.
2-0.
3,在30℃,250rpm振荡培养2-3小时,当OD600为0.
4-0.
6时离心收集酵母细胞,用30ml的10%无菌甘油(去离子水配制)洗涤细胞3-5次,室温下1000g(5min离心洗涤.
小心移去上清,用1.
5-2.
0ml的10%无菌甘油重新悬浮细胞,所得细胞即为电转化用的酵母感受态细胞,置冰上备用.
3.
酵母细胞的转化取酵母感受态细胞200l,与1l的pLexA-53和1l的pB42AD-T混合均匀后加入到2.
0cm的转化杯中,冰上放置30min,电击转化(参数:1.
5kV,25F,200().
转化完成后涂布SD/Gal/Raf/-His/-Ura/-Trp/-Leu/x-gal平板,30℃培养2-3天,出现蓝色的菌落为双杂交菌落(阳性),白色菌落为没有杂交的菌落(阴性).
【注意事项】1.
酵母感受态细胞的制备对后期的转化率影响非常显著,因此,操作时切忌用PBS等含盐离子的溶液处理细胞,所用的水最好是专门设备制备的去离子水.
【思考题】1.
酵母双杂交的原理是什么它在分子生物学研究中有什么用途2.
查文献,总结克服酵母双杂交中假阳性的策略.
实验十七、RNA干扰实验【实验目的】掌握RNA干扰技术用于基因功能研究和肿瘤治疗的原理.
掌握进行RNA干扰研究的技术路线.
【实验原理】科学家们最早在植物(Napoli等,1990)和脉孢菌(Cogoni等,1997)中发现了dsRNA诱导的RNA沉默现象,但关于RNA沉默现象的关键性发现还是由AndrewFire和CraigMello首先完成的.
有学者在线虫中进行反义RNA实验时观察到正义RNA也具有很高的基因沉默活性(Guo等,1995).
AndrewFire和CraigMello通过将反义RNA和正义RNA同时注射入秀丽隐杆线虫(C.
elegans),结果比单独注射反义RNA诱导基因沉默的效率高10倍.
他们认为这一现象是由于dsRNA触发了高效的基因沉默机制并高效地降低了靶mRNA水平而导致的.
人们将这一现象称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi).
随着研究的深入,人们陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planaria)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、牵牛花、大鼠、小鼠和人体内发现了RNAi现象.
随后,RNAi技术被广泛用于功能基因组学研究、基因表达调控机理研究,基因治疗等领域.
将果蝇胚胎提取物建立体外系统,实验证明RNAi是一个依赖ATP的过程.
双链RNA(外源的或体内产生的)首先被降解为21~23bp的小分子双链RNA,这种RNA分子称为小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA).
siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA,并介导其降解.
RNAi能够在多重水平上发挥作用.
在华丽新小杆线虫和植物中发现,双链RNA所诱导的基因沉默发生在转录后水平.
在植物中,dsRNA(doublestrandsRNA)导致基因组中与沉默触发物同源序列的甲基化;如果沉默触发物与启动子序列相同,则引起转录水平的基因沉默.
而线虫中,RNAi作为内源性编码的诱导剂在蛋白质合成水平上发挥作用.
RNAi的发生共有四个步骤:①长链dsRNA被"Dicer"酶切割成21~25nt含正义和反义序列的片段,即siRNA.
Dicer是RNaseⅢ家族成员之一,是一种ATP依赖性核酸内切酶.
它具有四个功能结构域:解旋酶(helicase)结构域、dsRNA结合域(DS-RBD)、PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域、RNaseⅢ催化结构域.
dsRNA即是与Dicer的ds-RBD相结合后被切割成siRNA的.
Dicer在催化过程中以二聚体形式出现,其催化结构域在dsRNA上反向平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧两个位点具有内切核酸酶的活性.
这两个位点在相隔约22bp的碱基处切断dsRNA.
Dicer的结构因物种不同略有差异,因此形成的siRNA碱基数也存在相应的差别.
②siRNA与多种亚单位结合,形成蛋白质复合物.
siRNA展开,蛋白质复合物构型改变成为具有活性的RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC).
RISC是由siRNA的反义链指导合成的核蛋白体,具有内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶,同源RNA链搜索等活性.
③活性形式的RISC识别并切割与siRNA引导链互补的靶mRNA.
siRNA作为引导序列引导RISC与同源mRNA按照碱基互补配对的方式结合.
然后,该mRNA与siRNA的正义链进行置换并在距siRNA3′端12个碱基处被降解,形成约10个碱基的寡核苷酸残段.
④RNA聚合酶激发另外的dsRNA合成,沉默效应得以放大和扩散.
siRNA反义链识别并结合靶mRNA后可作为引物,以靶mRNA为模板在依赖于RNA的RNA聚合酶催化下合成新的dsRNA.
然后,dsRNA被Dicer切割产生新的siRNA,新siRNA再去识别新一组mRNA.
经过若干次循环,沉默信号就会不断地被放大,同时也赋予了RNAi的高效性和持久性.
许多研究还显示,RNAi信号可以越过胞间屏障向其他细胞和组织扩散.
在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝和脉管系统进行传递.
在动物中,RNAi信号的扩散需要sid21基因编码的跨膜蛋白参与.
RNA干扰技术与传统的基因技术相比,具有投入少,周期短,操作简单等优势,因而被广泛应用于哺乳动物功能基因、基因治疗、信号转导通路等方面的研究.
siRNA序列的设计一般应遵循以下几个原则:①从靶基因转录本起始密码子AUG开始,向下游寻找AA双核苷酸序列,将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸作为siRNA序列设计模板;②每个基因选择4~5个siRNA序列,然后运用生物信息学方法进行同源性比较,剔除与其他基因有同源性的序列,选出一个特异性最强的siRNA;③尽量不要以mRNA的5'端和3'端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板,因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列,降低siRNA的基因沉默效应.
要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源.
可以用来进行靶序列筛选的网站有:http://www.
genesil.
com/business/products/order2.
htm;http://www.
ambion.
com/techlib/misc/siRNA_finder.
html;http://www.
ic.
sunysb.
edu/Stu/shilin/rnai.
html;http://design.
dharmacon.
com/rnadesign/default.
aspxSID=45358710.
目前,siRNA主要通过以下几种方法获得:化学合成法、体外酶法合成、长片断dsRNAs经RNaseIII类降解制备siRNA以及siRNA表达载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA.
化学合成法:许多公司可以根据用户要求提供高质量的siRNA.
但价格高,定制周期长.
适用于已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究.
如果是进行筛选siRNA等长时间的研究,通常不会采用这种方法制备siRNA.

体外转录:以寡核苷酸双链DNA为模版,通过体外转录合成siRNA.
成本比化学合成法低,所需时间短,得到的siRNA毒性小,稳定性好,转染效率高,但实验的规模受到反应规模和量的限制.
适用于筛选siRNA,特别是需要制备多种siRNA.
不适用于实验需要大量的,一个特定的siRNA以及进行长期研究.

RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA:选择200~1000碱基的靶mRNA模板,体外转录制备长片断双链RNA,再用RNaseIII(或者Dicer酶)进行体外消化,得到多种siRNA.
除掉没有被消化的双链RNA后,直接转染细胞.
由于得到的是多种siRNA的混合物,一般能够有效地抑制目的基因的表达.
这种方法不需要设计和检测多个siRNA序列来寻找有效的siRNA,操作步骤较少,为研究人员节省了时间和经费.
局限性在于有可能引发非特异性的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因.

上面三种方法主要都是在体外制备siRNA,需要专门的RNA转染试剂.
而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架是转染到细胞内的DNA模版在体内转录得到siRNA.
由于不需要直接操作RNA,因此普通的实验条件就能满足要求.

siRNA表达载体:通过在线设计靶基因的特异性siRNA,人工合成两条寡核苷酸链,退火形成双链DNA,末端与载体的多克隆位点序列互补.
与线性载体连接,构成环状载体,并形成带有强启动子的siRNA表达框.
载体所用启动子通常是人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子,通过添加3到6个尿嘧啶来终止转录,在哺乳动物细胞中能够表达大量的小分子RNA.
重组载体转染细胞后,从每一个载体转录单个同时含有反义siRNA和有义siRNA的siRNA发夹序列;siRNA发夹序列形成双链siRNA(两侧末端为突出的UU),并进一步形成siRNA/RISC复合体,最终导致靶标mRNA特异降解.
siRNA表达载体的优点在于带有抗生素标记,可建立siRNA表达的稳定细胞系,持续抑制靶基因的表达,便于长期研究.
病毒载体表达siRNA的优势在于可以提高转染细胞的效率.

siRNA表达框架:一种由PCR得到的siRNA表达模板,包括一个RNApolIII启动子及终止位点,一段发夹结构siRNA,直接转入细胞进行表达.
该方法适于进行siRNA筛选,针对得到的siRNA加上酶切位点后,通过克隆到载体中构建siRNA表达载体.
局限性在于转染效率较低,PCR产物可能会有碱基突变.

将制备好的siRNA或表达载体转染到真核细胞中的方法主要有以下几种:①磷酸钙共沉淀:将氯化钙,RNA(或载体)与磷酸缓冲液混合,沉淀形成包含RNA(或DNA)且极小的不溶的磷酸钙颗粒.
磷酸钙-核酸复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入细胞的细胞质.
影响转染效率的关键因素是沉淀物的大小和质量.
②电穿孔法:将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导目的分子.
方法是将细胞悬浮液置于电场中,诱导细胞膜的电压差异,导致细胞膜暂时穿孔,siRNA或载体通过形成的小孔进入细胞内.
电穿孔需要优化电脉冲的时间和电场的强度,在保证转染效率时避免不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞.
③葡聚糖转染:带正电的DEAE-葡聚糖与带负电的核酸分子结合,附着在细胞表面,通过二甲亚砜或甘油将DNA复合体导入细胞.
④机械法:显微注射法是通过一根细针头将DNA,RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核.
基因枪法使用高压将大分子导入细胞.
⑤脂质体介导:将阳离子脂质体试剂加入水中时形成微小的纳米级的单层脂质体.
带正电荷的脂质体可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面.
中性脂质体需将DNA预先包埋在脂质体中.
脂质体介导都是依赖于细胞的内吞作用将外源分子导入细胞内.

RNA干扰实验的技术路线、siRNA序列设计以及预实验结果等通常都是我们关注的重点,但不容忽视的是设计系统的对照组实验.
设立正确的阳性对照和阴性对照实验是RNA干扰实验不可缺少的部分,也有助于实验结果的分析,进一步优化实验条件.
作为阴性对照的siRNA应该和目的siRNA序列碱基组成相同,但和mRNA没有明显的同源性.
通常的做法是将目的siRNA碱基序列打乱,并保证与其它基因没有同源性.
荧光标记阴性对照与哺乳动物基因无同源性,可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况,优化转染条件和评价转染效率,并具备很好的pH耐受性,在活细胞中更稳定.
阳性对照的siRNA是那些已知的高效siRNA,常选用一些看家基因的siRNA,其结果可验证实验条件以及实验结果的可靠性.
如最为常用的GAPDH、p53、Beta-Actin等基因的siRNA,也有使用其它一些看家基因的siRNA作为阳性对照来摸索转染条件.
转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响.

下面以抑制Hela细胞中cyclinE基因的表达为例,介绍RNA干扰实验方法.
【实验材料】1.
仪器:冷冻离心机、微量移液器、恒温磁力搅拌器、冰箱、超净工作台、电泳仪、凝胶成像系统、倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪.
2.
试剂:限制性内切酶BamHI、HindIII、SalI,DNA抽提试剂盒、连接试剂盒,RPMI1640细胞培养基,lipofectamine2000,二甲亚砜(DMSO),小牛血清,链霉素,焦碳酸二乙酯DiethylPyrocarbonate(DEPC),PBS(PhosphateBufferedSaline),荧光染料碘化丙啶(PI)、HeLa细胞株.
【实验步骤】(一)cyclinE基因siRNA真核表达载体的构建1.
设计cyclinE基因靶序列:AATGCGAGCAATTCTTCTGGATT;阴性对照序列:GACTTCATAAGGCGCATGC.
阳性对照β-actin基因序列:AATGAAGATCAAGATCATTGC.
中间加入9bp的茎环结构,两端分别加入BamHI和HandIII酶切位点,3'端酶切位点之前加入polⅢ聚合酶终止信号TTTT.
公司合成如下序列,clyE1:5'-GATCCTGCGAGCAATTCTTCTGGATTCAAGACGTCCAGAAGAATTGCTCGCATTTTTTA-3';3'-GACGCTCGTTAAGAAGACCTAAGTTCTGCAGGTCTTCTTAACGAGCGTAAAAAATTCGA-5'.
阴性对照:5'-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTA-3';3'-GCTGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCCGTACGCGGAATACTTCAGAAAAAATTCGA-5'.
阳性对照:5'-GATCCTGAAGATCAAGATCATTGCTTCAAGACGGCAATGATCTTGATCTTCATTTTTTA-3';3'-GACTTCTAGTTCTAGTAACGAAGTTCTGCCGTTACTAGAACTAGAAGTAAAAAATTCGA-5'.
2.
将新合成的寡核苷酸片段分装,每个片段各取一管,12000rpm离心一分钟,小心打开eppendorf盖,加入无菌无核酸酶的ddH2O约10l,轻轻混匀,使其终浓度约为3mg/ml.
置于-20℃冰箱备用.
3.
每种寡核苷酸单链(正向和反向)1l与48l退火缓冲液混合.
混合物在90℃孵育4分钟,然后在70℃孵育10分钟.
将退火的oligos慢慢冷却到10℃.
(先在37℃冷却15~20分钟,然后放入10℃或室温,)置入-20℃冰箱保存.
取退火后的寡核苷酸在2.
0%的琼脂糖上进行凝胶电泳.
4.
将pGenesil-1质粒用HindⅢ、EcoRI双酶切,回收载体.
5.
将pGensil-1载体与分别与3种siRNA片段混合制备成体积为5~10l的DNA溶液(TE溶液).
载体与siRNA片段的摩尔数比为:0.
03pmol:0.
1~0.
3pmol.
按比例加入T4DNA连接酶及相应的缓冲液,充分混匀.
16℃反应30分钟.
连接后产物置于-4℃冰箱保存备用.
6.
DH5α感受态菌80ml中加入120ml0.
1mol/LCaCl2,混匀,分装于两管中,一管加入上述连接物5ml,另一管加入一标准质粒1ml,混匀后置于冰上30分,42℃水浴60秒,迅速放置冰中3~5分钟,每管中加入900mlLB(不含Kanamycin),37℃摇菌1小时,离心3分钟,留约100ml将菌液均匀涂抹至加含卡那霉素(30(g/ml)的LB培养皿表面并倒置于温箱中,37℃孵育过夜.
同时设阴性对照和阳性对照.
即,阴性对照为将无连接产物,只有DH5α感受态细菌接种到含卡那霉素抗性的培养基上;阳性对照为将pGensil-1空质粒直接转化到DH5α感受态菌中.
18小时后,观察菌落的生长.

7.
挑取阳性菌落,提取质粒.
分别用HindⅢ,EcoRI和BamHI,EcoRI双酶切,电泳,观察所得片段大水是否与预期一致.
三种重组质粒分别标为:pGenesil-clyE1、阴性对照pGenesil-NC和阳性对照pGenesil-PC.

8.
取酶切鉴定后的质粒和菌液送生物公司进行DNA序列测定,以进一步验证质粒是否重组正确.
鉴定正确的克隆保存,备用.
(二)细胞转染及RNAi效果检测1.
取出冻存HeLa细胞,转入含37℃预热RPMI1640培养基的细胞培养瓶中,含10%小牛血清,置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养,复苏.
待第二日细胞贴壁后换液,并用PBS轻轻吹打以去除残留DMSO.