色谱卡巴斯基2010激活码

第11卷第19期食品安全质量检测学报Vol.
11No.
192020年10月JournalofFoodSafetyandQualityOct.
,2020*通讯作者:李延升,副主任技师,主要研究方向为食品安全风险监测及营养成分分析.
E-mail:liy781106@163.
com*Correspondingauthor:LIYan-Sheng,AssociateChiefTechnician,CenterforDiseaseControlandPreventionofLiaoningProvince,No.
242,ShayangRoad,HepingDistrict,Shenyang110005,China.
E-mail:liy781106@163.
com超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中喹乙醇及卡巴氧代谢物邹淼,蒋莹,冯静,陈曦,李延升*(辽宁省疾病预防控制中心,沈阳110005)摘要:目的建立超高效液相色谱串联质谱法检测鸡蛋中喹乙醇代谢物3-甲基-喹恶啉-2-羧酸以及卡巴氧代谢物喹恶啉-2-羧酸的分析方法.
方法样品经酶解后,用乙酸乙酯提取,PAX固相萃取柱净化,用色谱柱WATERSACQUITYUPLCHSST3(2.
1mm*100mm,1.
8μm)分离,同位素内标法定量.
结果3-甲基-喹恶啉-2-羧酸及喹恶啉-2-羧酸的最低检出限均为0.
2μg/kg,定量限均为0.
6μg/kg,平均回收率为80.
9%~106.
4%,相对标准偏差为2.
6%~7.
2%.
结论该方法净化效果好,灵敏度高,准确性好,适用于鸡蛋中喹乙醇以及卡巴氧代谢物的同时检测.
关键词:超高效液相色谱串联质谱法;3-甲基-喹恶啉-2-羧酸;喹恶啉-2-羧酸;鸡蛋Determinationofmetabolitesofolaquindoxandcarbadoxineggbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometryZOUMiao,JIANGYing,FENGJing,CHENXi,LIYan-Sheng*(CenterforDiseaseControlandPreventionofLiaoningProvince,Shenyang110005,China)ABSTRACT:ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationofmethyl-3-quinoxaline-2-carboxylicacidandquinoxaline-2-carboxylicacidineggbyultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS).
MethodsAfterenzymatichydrolysis,thesampleswereextractedwithethylacetate,followedbyclean-upwithPAXcolumn,thenseparatedbyWATERSACQUITYUPLCHSST3(2.
1mm*100mm,1.
8μm).
Internalstandardmethodwasusedtoquantify.
ResultsThelimitsofdetectionandthelimitsofquantifywere0.
2μg/kgand0.
6μg/kgformethyl-3-quinoxaline-2-carboxylicacidandquinoxaline-2-carboxylicacid,respectively.
Therecoverieswere80.
9%-106.
4%andtherelativestandarddeviations(RSDs)were2.
6%-7.
2%.
ConclusionThismethodhasgoodpurification,highsensitivity,goodaccuracy,andissuitablefordeterminationofmethyl-3-quinoxaline-2-carboxylicacidandquinoxaline-2-carboxylicacidinegg.
KEYWORDS:ultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry;methyl-3-quinoxaline-2-carboxylicacid;quinoxaline-2-carboxylicacid;egg第19期邹淼,等:超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中喹乙醇及卡巴氧代谢物69431引言喹乙醇及卡巴氧同属于喹恶啉抗菌药[1],由于其能够促进畜禽生长,増加瘦肉率,提高饲料转化率,曾在养殖业广泛应用.
但喹乙醇及卡巴氧本身具有潜在的致癌、致畸、致突变作用[2,3],食用残留该类药物的动物产品会对人体造成危害,许多国家将喹乙醇及卡巴氧列为禁用或者限用药物,但由于该类药物价格低廉,应用方便,养殖业仍有违规添加及超剂量添加的现象存在,严重危害人体健康.
因此,建立喹乙醇及卡巴氧代谢物在鸡蛋中的残留检测方法十分必要.
3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylicacid,MQCA)是喹乙醇在动物体内的代谢产物,喹恶啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylicacid,QCA)是卡巴氧在动物体内的代谢产物,因MQCA和QCA在动物体内相对较稳定,因此作为喹乙醇及卡巴氧的残留标示物[4].
目前,关于MQCA和QCA检测方法有酶联免疫法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等[59].
酶联免疫法易出现假阳性现象,液相色谱法的检出限较高,基质干扰较为严重.
液相色谱串联质谱法由于具有分析速度快、分离度好、灵敏度高的优点得到普遍应用,但目前检测对象多局限于猪肉、鸡肉、鱼虾等[1012],为使检测范围更加全面,更准确监测喹乙醇及卡巴氧的残留状况,本研究在前人研究的基础上,对前处理进行改进,建立鸡蛋中喹乙醇及卡巴氧代谢物的检测方法,以期为畜禽生产监测全覆盖、保障食品安全提供技术支持.
2材料与方法2.
1主要仪器与试剂AcquityXevoTQ超高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司);ST16R型台式高速冷冻离心机(美国ThermoFisher公司);Vortexgenie2多用途漩涡混合器(美国SI公司);XcelVap氮吹仪(美国Horizontechnology公司);VacElutSPS24固相萃取仪、PAX固相萃取柱(200mg,6mL)(美国Agilent公司).
3种标准品:3-甲基-喹恶啉-2-羧酸(MQCA)、喹恶啉-2-羧酸(QCA)、喹恶啉-2-羧酸-d4(QCA-d4)(纯度≥98%,德国Dr.
E公司).
乙酸乙酯、乙腈、甲醇(色谱纯,美国ThermoFisher公司).
蛋白酶(P5147)、Tris碱(T1503)(美国Sigma公司);水为超纯水(美国Millipore公司).
2.
2实验方法2.
2.
1样品处理(1)提取称取样品5.
00g(精确到0.
01g)于50mL离心管中,加入8mL0.
2mol/LpH9.
6Tris缓冲溶液和0.
3mL10mg/mL蛋白酶水溶液,涡旋混匀后,55℃酶解16h,放置至室温,再加入1.
0mL浓盐酸,混匀,9000r/min离心5min,转移上清液至另一50mL离心管中,加入6mL乙酸乙酯,混匀离心后,将上清液于35℃氮气吹干,10mL20%甲醇水溶解.
(2)净化依次用5mL甲醇、5mL水活化平衡PAX固相萃取柱,转移提取液至PAX柱内,依次用5mL水、5mL1%氨水、5mL甲醇、5mL乙酸乙酯除杂,抽干后,5mL2%甲酸-甲醇洗脱,35℃氮气吹干后,加入1mL20%甲醇水复溶,过0.
22μm滤膜上机测定.
2.
2.
2标准溶液的配制(1)标准储备液分别准确称取适量的3-甲基-喹恶啉-2-羧酸、喹恶啉-2-羧酸、喹恶啉-2-羧酸-d4标准品,分别用甲醇溶解配制成浓度均为500mg/L的单标标准储备液,-20℃储存.
(2)混合标准储备液分别准确移取适量的3-甲基-喹恶啉-2-羧酸、喹恶啉-2-羧酸标准储备液于100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成混合标准储备液,浓度为5mg/L,4℃储存.
(3)空白样品提取液选取阴性样品,按2.
2.
1样品处理操作,得到空白样品提取液.
(4)基质混合标准工作溶液根据每种标准品的灵敏度和线性范围,移取一定量的混合标准储备液和同位素内标储备液,用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液,临用现配.
2.
2.
3仪器条件(1)色谱条件色谱柱:WATERSACQUITYUPLCHSST3(2.
1mm*100mm,1.
8μm);柱温:40℃;流量:0.
3mL/min;进样量:10μL;流动相:A:乙腈,B:0.
1%的甲酸水溶液,梯度洗脱条件见表1.
表1梯度条件Table1Gradientelutionconditions时间/minA/%B/%0.
06.
07.
07.
19.
052525559575759595(2)质谱条件离子源:电喷雾离子源(electronsprayionization,ESI);扫描模式:正离子;离子源温度:150℃;毛细管电压:1.
5kV;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:850L/hr.
6944食品安全质量检测学报第11卷3-甲基-喹恶啉-2-羧酸、喹恶啉-2-羧酸及喹恶啉-2-羧酸-d4质谱参数见表2.
表2MQCA、QCA及QCA-d4的质谱参数Table2ParametersofmassspectraofMQCA,QCAandQCA-d4化合物母离子定量离子(锥孔电压/V、碰撞能量/eV)定性离子(锥孔电压/V、碰撞能量/eV)MQCA189.
2145.
2(20、14)143.
1(18、16)QCA175.
2129.
1(16、16)131.
1(16、14)QCA-d4179.
2133.
2(18、16)-3结果与分析3.
1质谱条件优化本研究以乙腈:0.
1%的甲酸水溶液(5:95,V:V)为初始流动相,采用电喷雾离子源和正离子模式进行扫描,同时在标准溶液和样品溶液中都加入已知量的内标QCA-d4,消除样品基质对离子化的抑制作用.
MQCA和QCA分子结构中有羧基,在一级质谱中,易与H+结合,产生带正电荷离子[M+H]+,确定MQCA、QCA和QCA-d4的分子离子m/z分别为189.
2、175.
2和179.
2,与文献报道的结果一致[13].
以上述3种目标化合物的分子离子峰为母离子,进行子离子扫描,同时对其质谱条件进行优化,选取丰度最高且互不干扰的2个作为子离子,其中丰度较高的作为定量子离子,另一个作为定性子离子.
3.
2色谱条件优化MQCA和QCA均易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂,本研究对比了用甲醇、乙腈为流动相时MQCA和QCA的峰形,发现用乙腈为流动相时,目标化合物的峰形更好.
正离子模式下水相中加入0.
1%的甲酸,提供质子来源,显著提高离子化效率,提升灵敏度.
对色谱柱的选择,本研究比较了ACQUITYUPLCHSST3柱、ACQUITYUPLCBEHC8柱和ACQUITYUPLCBEHC18柱这3种不同的色谱柱,结果表明差异不大,但当进行样品测定时,T3柱凸显出优势,对极性化合物具有良好的保留,与杂质峰有良好的分离效果.
因此,本研究选取乙腈作为有机相,0.
1%的甲酸水溶液作为水相,ACQUITYUPLCHSST3柱作为色谱柱.
在实际样品测定过程中,由于基质复杂,对目标化合物的离子化有不同程度的抑制,等度洗脱很难满足实验要求,故采用梯度洗脱方式.
MQCA、QCA及内标物的MRM提取离子流图见图1.
图1MQCA、QCA及内标物的MRM提取离子流图Fig.
1MRMchromatogramofMQCA,QCAandinternalstandard第19期邹淼,等:超高效液相色谱串联质谱法测定鸡蛋中喹乙醇及卡巴氧代谢物69453.
3前处理条件优化MQCA和QCA在鸡蛋中与蛋白质以结合态的形式存在,无法直接使用试剂提取,必须通过酸解、碱解或酶解方式将目标化合物与蛋白质分离,便于提取.
本研究采用0.
3mL10mg/mL蛋白酶水溶液55℃酶解16h的方式进行组织破坏,林黎等[14]将酶解温度控制在47℃,经过比较,47℃和55℃2种温度下经过16h酶解,均可保证样品酶解完全.
由于MQCA和QCA呈弱酸性[15],因此在提取前加入1.
0mL浓盐酸进行酸化处理,再用乙酸乙酯进行提取,保证较高的提取效率.
提取后,过小柱除杂,本研究对比了C18、HLB以及PAX固相萃取小柱的绝对回收率,见图2.
实验结果表明,对于鸡蛋中MQCA和QCA的测定,PAX固相萃取柱绝对回收率相对较好,是样品前处理中净化的最佳选择.
3.
4内标物的选择本研究根据喹乙醇类药物的性质选取内标物,MQCA和QCA以QCA-d4为内标,实验表明,上述同位素为内标时,可获得准确可靠的实验结果.
3.
5回归方程及检出限将系列浓度的基质混合标准工作溶液在仪器工作条件下测定,以目标组分与对应同位素内标的峰面积比(Y)为纵坐标,以各目标组分的浓度(X,μg/L)为横坐标,进行线性回归,绘制标准曲线,以3倍信噪比对应的化合物含量作为方法检出限(limitsofdetection,LOD)和定量限(limitsofquantification,LOQ),见表3.
MQCA和QCA在0.
5~100μg/L浓度范围内相关系数大于0.
998,线性关系良好,检出限为0.
2μg/kg,定量限为0.
6μg/kg.
图2MQCA和QCA在C18、HLB以及PAX固相萃取小柱上绝对回收率对比图(n=6)Fig.
2AbsoluterecoveriesofMQCAandQCAonC18,HLBandPAXcolumns(n=6)表3MQCA和QCA的线性范围、相关系数、回归方程、检出限及定量限Table3Linearranges,correlationcoefficients,regressionequationsdetectionlimitsandquantificationlimitsofMQCAandQCA化合物线性范围/(μg/L)相关系数r回归方程检出限/(μg/kg)定量限/(μg/kg)MQCA0.
5~1000.
9989Y=0.
344627X+0.
08204930.
20.
6QCA0.
5~1000.
9992Y=0.
117524X+0.
03232950.
20.
63.
6回收率与精密度取鸡蛋阴性样品,添加3个浓度水平,每个浓度水平6个平行样,按照本研究进行样品处理,上机测定,结果见表4.
MQCA和QCA的平均回收率为80.
9%~106.
4%,相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)为2.
6%~7.
2%,回收率和精密度均满足实际样品测定要求.
表4回收率及相对标准偏差(n=6)Table4Recoveryandrelativestandarddeviation(n=6)化合物添加浓度/(μg/kg)回收率/%RSD/%MQCA0.
582.
16.
32.
0106.
42.
610.
094.
53.
3QCA0.
580.
97.
22.
093.
53.
410.
092.
25.
43.
7样品实测应用本研究方法对市售20份鸡蛋样品进行测定,均未检出MQCA和QCA残留.
4结论本研究建立了同时测定鸡蛋中喹乙醇和卡巴氧残留的超高效液相色谱串联质谱方法,通过对仪器条件及样品前处理的优化,回收率良好,MQCA及QCA的最低检出限均为0.
2μg/kg,定量限均为0.
6μg/kg,平均回收率为80.
9%~106.
4%,相对标准偏差为2.
6%~7.
2%,优于目前报道的检测方法.
该方法准确、稳定、可靠,可满足鸡蛋中喹乙醇和卡巴氧残留的日常检测与监测要求.
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(责任编辑:于梦娇)作者简介邹淼,主管技师,主要研究方向为卫生理化检验及食品污染物风险监测.
E-mail:741690012@qq.
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E-mail:liy781106@163.
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