蛋白白刺液泡膜nah逆向转运蛋白与肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析毕业论文

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白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克

隆与基因序列分析

摘要

白刺属Nitraria L. 是蒺藜科(Zygophyllaceae)的古老小属中国有8种有4种该属植物是我国、和一带荒漠植被的重要建群种之一为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物而且具有很高的开发利用价值因此开发其抗逆性基因资源、从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义。

盐胁迫是影响植物正常生长发育的最严重的非生物胁迫之一。植物盐害可分为原初盐害和次生盐害原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害即离子胁迫导致的伤害包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代过程次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。植物的耐盐机制主要包括渗透调节和降低胞Na+浓度。减少Na+的吸收、外排Na+和将Na+区域化是保持胞低Na+浓度的策略其中 Na+的外排和区域化主要由Na+/H+转运蛋白调节。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白是将胞质的Na+逆Na+浓度梯度运送到液泡膜中进而将Na+区域化集中。 目前为止一些植物的液泡膜Na+/H+逆向蛋白编码基因NHX已经被克隆而且一些研究表明NHX基因的过量表达可显著提高植物的耐盐性。

本研究以开发白刺的耐盐基因资源、揭示其耐盐分子机理为目的、利用RT-PCR、RACE技术及iPCR的方法从小果白刺(N.sibirica Pall)中克隆了NHXcDNA片断并对其进行了经过同源序列比较及进化关系分析从而为调查该基因的表达调控模式、作用机理及利用该基因进行甜土植物的耐盐性遗传改良奠定DOC版本

了基础。另外本研究还克隆了小果白刺的肌动蛋白基因片断。 由于肌动蛋白基因在各种不同器官上恒定表达因而它常常被用作分子标来研究其它基因的表达差异。小果白刺的肌动蛋白基因的克隆为今后研究NHX等白刺属植物的基因表达奠定基础。

关键词 白刺耐盐性Na+/H+逆向转运蛋白 RT-PCR

Molecular cloning and Sequence Analysis of avacuolar Na+/H+antiporter and Actin genes form Nitraria L.

Wang Li

Lin XiaoFeiAbstract

The Nitraria L. is a smal l genus of Zygophyl laceae,which primari lygrows inarid and semiarid regions,sal ine and alkal i land,desertand sand areas,and isthe majorconstructive species of forest in western Inner Mongol ia.The Nitrariaplants exhibit a strong salt-resistance, and have important economical- andecological-value.Therefore, the research on molecular mechanism of stresstolerance is very necessary in Nitraria.

Salt stress is one of abiotic factor that cause serious l imitation on plantgrowth and development.Plant salt stress include primary salt and secondrysalt, primary salt refers to the injury on plant by ions, including the damage ofselective penetrated property of plasma membrane and interference on plantmetabol ism; secondary salt refers to the osmotic stress by excessive soi lDOC版本

sal inityand the nutrient loss by ion competition.

Since the first vacuolar Na+/H+antiporter gene, referred to as NHX,wascloned from Arabidopsis, more than 500 of NHX orthologs were isolated.Previous research indicated that over-expression of NHXgene can enhancesalt-tolerance abi l ity of plants.

In the study,we isolated a cDNA fragment of NHX homology from N.sibirica Pallusing RT-PCR,RACE and iPCR,and analyzed its gene structureand phylogenetic relationship.The results wi l l prove an important experimentalbasis for analyzing the expression pattern and molecular mechanism of NHXgene, and for improving salt-resistant abi l ity of glycophytes through genetictransformation with NHXgenes of Nitraria L.On the other hand,we isolated acDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actingenes are stable in each organs, therefore, itwas used as an internal standardfor analyzing gene expression.The experimental result could prove useful forgene-expression analysis of Nitraria plants.

Keyword:Nitraria L.  sa lt-to lerance Na+/H+antiporte r RT-PCR

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目录

1绪论. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 1

1 .1盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 1

1 .1 .1盐胁迫对植物的伤害. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 1

1 .1 .2植物的耐盐机制. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

1 .2液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白NHX研究进展. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

1 .2.1液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

1 .2.2液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

1 .2.3液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

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1 .3本研究的目的及意义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

2材料与方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.1材料. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.1 .1植物材料的培养. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.1 .2实验试剂及配制. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20

2.1 .3实验使用试剂盒. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

2.1 .4实验用引物. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22

2.1 .5载体及菌株. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

2.1 .6主要仪器设备及其他. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

2.2实验方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

2.2.1兼并引物设计. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24

2.2.2 白刺总RNA的提取及鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

2.2.3 cDNA第一链的合成. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27

2.2.4 白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因cDNA片段的克隆. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

2.2.5白刺肌动蛋白基因片段的克隆. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29

2.2.6大肠杆菌DH5α超级感受态细胞的制备TB法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30

2.2.7 PCR产物的凝胶回收及TA克隆的与转化. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

2.2.8克隆基因片段序列的测定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34

2.2.9白刺Na+/H+逆向转运蛋白cDNA 3’末端的快速克隆RACE. . . . . . . . . . . . . . . . .34

2.2.10 白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因5’末端的获得. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

2.2.1 1 Na+/H+逆向转运蛋白序列分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

3结果与讨论. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

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3.1实验结果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

3.1 .1 RNA的变性琼脂糖凝胶检测结果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41

3.1 .2 PCR产物鉴定. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

3.1 .3白刺Na+/H+逆向转运蛋白3’末端cDNA的克隆. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43

3.1 .4菌落PCR鉴定含重组质粒菌落. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

3.1 .5 白刺Na+/H+转运蛋白基因5’末端的获得. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

3.1 .6序列的blast比对结果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

3.1 .7基因片段的Na+/H+逆向转运蛋白基因序列分析及系统树构建. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48

3.2讨论分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

3.2.1 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

3.3.2 Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

3.2.3肌动蛋白基因的参作用. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50

4致. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52

5参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .54

6附录. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58

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