SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸,电泳开始后,HCL解离成
氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最
快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电
导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,
形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。
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可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散,二者相遇,在比例合适处形成白色沉淀。
基本类型有单向扩散和双向扩散两种。
双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)
抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中,两者各自向四周扩散,如两者相对应,浓度比例合适,则经一定时间后,在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。
每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线,若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。
且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。
所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。
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【方法】
1、用生理盐水配制1.0~1.5%琼脂,隔水煮沸使溶化,用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上,制成琼脂板。
2、待琼脂凝固后,按右图用打 孔器打孔,并用针头挑去孔中琼脂 (孔距为5mm)。
3、在①孔中加正常人混合血清,在②孔中加小牛血清,③孔中加羊抗人全血清,注意不要溢出。
4、将加好样品的琼脂板置于湿盒内,于37℃温箱内放置24小时后观察结果。
【结果】
观察孔间沉淀线的数目与特征,一般可注意到以下几种现象:
1、抗原与抗体孔间形成一条沉淀线,说明只有一种抗原与相对应的抗体特异性结合,如出现数条沉淀线,说明有几组不同的抗原和相对应抗体相结合(图2-1)。
2、根据抗原的成份可有以下三种现象(图2-2):(1)若二孔中的抗原相同,与相应抗体形成的沉淀线融合成弧形;(2)若二孔中抗原不同,当抗血清中分别含有与抗原相应的抗体时,则形成的沉淀线相交叉;(3)若两孔中抗原部分相同,抗血清中有各相应的抗体,形成的沉淀线相切。
3、相应抗原抗体所形成的沉淀线,如二者浓度相当,沉淀线在孔中央,二者浓度不当时,则沉淀线偏向浓度低的一侧
可 参考:
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单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)—人血清中IgG、IgA、IgM的测定。
单向琼脂扩散试验是一种定量试验,将抗体混合于琼脂内,倾注于玻片或平皿上,凝固后在琼脂上打孔,再将抗原标本加入孔内,经过一定的时间,在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环,环的大小与抗原含量和扩散时间相关。
用不同浓度的抗原制成标准曲线,则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。
本试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量。
【方法】
1、免疫琼脂板制备:将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴比妥缓冲液配成),加热溶化,待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度),混匀,制成厚1.5mm的琼脂板,待琼脂凝固后打孔,孔径为3mm,孔距1~1.2cm。
2、稀释参考血清及待检血清:参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用,参考血清、待检血清稀释按要求进行。
3、加样:将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内,其余孔滴加待检的稀释血清,每个检样加两个孔,每孔滴加10微升。
4、扩散:将免疫板置水平湿盘内,放进37℃温箱,IgG免疫板扩散24小时,IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果,(如果沉淀环不清晰,也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察),必要时可以染色后观察。
绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定:测量沉淀环直径。
沉淀环直径的大小除与抗原量相关,还与分子量和扩散时间有关。
这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关,而是对数关系,这种关系有两种计算方法:
(1)Mancini曲线-适用于大分子抗原和长时间扩散(>48小时)的结果处理。
使用方格计算纸划线,沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。
公式表示:C/d2 =K(C=抗原浓度,d=沉淀环直径,K=常数)。
(2)Fehey曲线-适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。
使用半对数纸划线,浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。
公式表示:logC/d=K(C=抗原浓度,d=沉淀环直径,K=常数)。
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