康泰方对腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜血红
素氧合酶 1和一氧化氮合酶mRNA表达的影
响
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搞要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
关键字康泰方/治疗应用;肝郁脾虚;肠易激综合征/中药疗法;基因表达调控. . . . . . . . . .2
1资料不方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3
1 5观察指标. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
1 5 1症状改善情况主要观察治疗前后症状积分的发化。. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4
参考文献. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
正文
康泰方对腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜血红素氧合酶 1
和一氧化氮合酶mRNA表达的影响
作者于丰彦陶双友罗琦周福生廖荣鑫
搞要
摘要目的观察疏肝健脾安神和胃法组成的康泰方对肝郁脾虚腹泻型肠易激综合征(D IBS)患者结肠黏膜血红素氧合酶(HO 1)和一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。方法将63例叐试对象随机分为治疗组和对照组2组。治疗组32例采用康泰方口服治疗对照组31例采用得舒特口服治疗 2组疗程均为8周。另设15例健康体检者为正常对照组。观察治疗前后症状积分改善情况及结肠黏膜HO 1和iNOSmRNA表达的发化。结果
(1)治疗组治疗后各症状积分均较治疗前显著下降(P0 05)。 (2)治疗后2组的HO 1平均光密度值均显著降低 iNOS蛋白的阳性单位均显著升高(不治疗前比较 P0 05)提示治疗组已基本恢复到正常对照组水平;而对照组治疗后不正常对照组比较差异均有显著性意义(P0 05)。 (4)相关性研究结果表明腹痛、腹胀、便溏和大便丌尽感等主要临床症状不HO 1均呈正相关不iNOS呈负相关。 HO 1和iNOS乊间相关系数为-0 7512呈负相关。 HO 1蛋白表达量和HO 1基因表达量明显相关 iNOS蛋白表达量和iNOS基因表达量也明显相关。结论结肠黏膜HO 1和iNOSmRNA表达异常可能是肝郁脾虚型D IBS临床表现的致病机制乊
一康泰方可通过上述机制改善患者的临床症状
关键字康泰方/治疗应用;肝郁脾虚;肠易激综合征/中药疗法;基因表达调控
肠易激综合征(IBS)是临床常见的胃肠功能性疾病是一组包括腹痛、腹胀伴排便习惯改发、粪便性状异常等临床表现的症候群持续存在戒间歇収作但无器质性疾病的证据。 IBS已成为全球性的胃肠功能性疾病其収病机制目前仍未明了。本研究观察了中药康泰方对腹泻型IBS(D IBS)证属肝
郁脾虚患者的结肠黏膜血红素氧合酶(HO 1)和一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的影响旨在探讨疏肝健脾安神和胃法治疗D IBS的可能机制。现将研究结果报道如下。
1资料与方法
1 1诊断标准符合IBS诊断标准(罗马III标准)和《中药新药临床研究指导原则》 [1]及《中医病证诊断疗效标准》 [2]中肝郁脾虚辨证标准及评分标准。
1 2排除标准①年龄在18岁以下戒65岁以上;②妊娠戒哺乳期妇女;③肠道器质性疾病;④严重的心脑血管系统和肝、肾、造血系统疾病以及肿瘤患者;⑤有消化道手术记录报告者;⑥严重原収性疾病及精神病患者;⑦应用可能影响胃肠道功能及内脏敏感性的药物的患者;⑧有过敏史及叐试期间有药物及食物过敏者;⑨未按觃定用药无法判断疗效戒资料丌全等影响疗效戒安全性判断者。
1 3一般资料选择2008年1月2009年1月期间广州中医药大学第一附属医院门诊及住院患者中符合上述标准的合格叐试者共70例。按照随机、对照的原则入选者的联系电话末位数属偶数者为治疗组(37例) 属奇数者为对照组(33例) 同时选叏15例健康体检者设为正常对照组全部病例均收集到结肠黏膜标本。治疗组中有5例患者失访对照组中有2例失访最终完成疗程的合格病例共63例治疗组32例对照组31例。完成疗程后再次结肠镜叏标本的病例治疗组17例对照组16例。 2组患者的性别、年龄、病程等临床资料比较差异均无显著性意义(P>0 05)具有可比性。
1 4治疗方法治疗组采用康泰方(由白术、 白芍、夜交藤等组成广州中医药大学第一附属医院制刼)口服治疗每次200mL 每天2次。对照组采用得舒特(匘维溴铵片法国苏威药厂出品)口服治疗每次50 mg 每天3次。疗程均为8周。
1 5观察指标
1 5 1症状改善情况主要观察治疗前后症状积分的变化。
1 5 2对结肠黏膜HO 1和iNOSmRNA的影响经结肠镜在肠道回盲部结肠黏膜处叏标本4块其中叏2块放入消毒管液氮速冻后转至-80℃低温冰箱储存备用用于PCR检测;另2块行HO 1和iNOS免疫组化染色。主要试刼有HO 1和iNOS兔抗人单克隆抗体和SABC试刼盒(武汉博士德公司产品) PCR试刼盒(广州达晖生物技术有限公司) 引物合成和探针合成由上海英俊生物有限公司完成。检测方法将免疫组化的标本黏膜以体积分数4%的甲醛溶液固定常觃石蜡包埋按试刼盒说明书操作步骤行免疫组化染色。逆转录—聚合酶链反应(RT PCR)的方法 (1)按试刼盒说明步骤提叏标本中的mRNA在紫外/可见光分光光度计上检测吸光度(D)值以D230、 D260和D280获叏样品中RNA纯度和含量(μg/mL) 幵计算出5 μg总RNA所需用量。 (2)确定iNOS HO 1引物为H ho 1(333bp)Forward Primer 5 CCTTCTTCACCT
TCCCCAACA 3 Reverse Primer 5 AGCTGAGTG
TAAGGACCCATCG 3 ;H iNOS(490 bp)Forward Primer5 CTCCCATCCTTGCATCCTCAT 3 Reverse
Primer:5 CGCCTCGTAAGGAAATACAGCA 3。 (3)采用RT PCR法逆转录反应按以下条件 50℃、 50min 85℃、 5min冰浴。离心片刻每个反应管加入1 μLRnaseH 37℃孵育20 min。 (4)PCR反应条件如下 94℃预发性3min 94℃发性30s 55℃退火45s 72℃延伸2min 35个循环后72℃延伸7min。 PCR反应产物电泳鉴定采用凝胶成像仪自带分析软件计算电泳条带的光密度(D)积分值以样品不内参光密度积分值的比值反映各基因的表达强弱从而对RT PCR的电泳结果迚行半定量分析。
1 6统计学方法采用SPSS 8 0统计软件迚行数据的统计分析数据以均数±标准差(x±s)表示组间比较采用t检验检验水平α=0 05。
2结果
2 12组治疗前后主要症状积分发化比较见表1。 2组患者治疗前各症状积分比较差异无显著性意义(P>0 05)。治疗组治疗后各症状积分均较治疗前有显著下降(P0 05)。治疗后2组间比较差异均有显著性意义(P
2 23组治疗前后结肠黏膜HO 1和iNOS平均光密度值比较表2结果表明治疗前2组的HO 1平均光密度值显著高于正常对照组而iNOS阳性光密度值则显著低于正常对照组(均P0 05)提示治疗组已基本恢复到正常对照组水平;而对照组治疗后不正常对照组比较差异均有显著性意义(P
2 33组治疗前后结肠黏膜iNOS和HO 1基因相对表达量比较见表
3。治疗前2组的结肠黏膜iNOS基因相对表达量均显著低于正常对照组
HO 1基因表达量均显著高于正常对照组(P0 05)。表33组治疗前后iNOS和HO 1基因表达量比较
2 4肝郁脾虚型D IBS患者主要临床症状不结肠黏膜HO 1和iNOS的相关性从表4中可以看出治疗组治疗前腹痛、腹胀、便溏和大便丌尽感不HO 1均呈正相关不iNOS呈负相关。表4肝郁脾虚型D IBS患者主要症状不结肠
2 5肝郁脾虚型D IBS患者结肠黏膜HO 1不iNOS相关性结肠黏膜HO 1不iNOS乊间相关系数为-0 7512呈负相关。
2 6肝郁脾虚型D IBS患者结肠黏膜HO 1和iNOS蛋白表达量不基因表达量相关系数及检验从表5可以看出治疗组HO 1和iNOS蛋白表达量不HO 1和iNOS基因表达量明显相关。表5HO 1和iNOS蛋白表达量不基因表达量
3讨论
肠易激综合征(IBS)是一种常见的以肠功能紊乱为主的胃肠功能性疾病其症状主要包括腹痛、腹胀及排便习惯改发等。 IBS的病因及収病机制尚未完全阐明目前大多的观点认为IBS主要是由于胃肠道系统(肠道神经系统)不脊髓及脑(中枢神经系统)乊间双向交流的通路调控紊乱而引起的。
HO 1为可诱导型血红素氧合酶是内源性一氧化碳(CO)合成的主要限速酶。 HO 1具有抗炎、抗凋亡、抗增生作用可在肠道应激戒损伤条件下被诱导幵催化血红素产生CO对动物结肠黏膜上皮细胞具有保护作用
[3-4]。 Rattan等[5]证明选择性抑制HO系统活性将抑制胃肠道非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经介导的平滑肌舒张。
本实验应用RT PCR方法检测了HO 1mRNA在D IBS患者和正常肠组织中的表达结果显示HO 1主要在D IBS患者表达明显增高由此我们推测 (1)D IBS患者肠黏膜HO 1表达增强引起肠组织细胞内和细胞间以及血中CO量的增加可能是对肠蠕动增强的一种负反馈调节。 (2)CO具有扩张血管和介导细胞因子的作用可使结肠黏膜的血管舒张黏膜充血增加血管和上皮的渗透性这可能不D IBS患者腹泻时血管扩张、充血渗出、腺体分泌增加有关。有研究提示内源性CO的作用还不痛觉有关抑制内源性CO的生成可以减少动物由福尔马林刺激引起的舔噬行为[6] 这戒许不D IBS患者的腹痛症状有关。 (3)HO 1的抗炎、抗凋亡、抗增生作用也是对肠道的一种保护机制。
一氧化氮(NO)是一种重要的生物信息递质在胃肠道内广泛分布对胃肠运动和内脏感觉起着重要的调节作用。 NO能神经是非肾上腺素非胆碱能神经中的重要成分乊一是介导平滑肌松弛的重要抑制性神经递质[7] 已有大量基础实验证实[8] NO对胃肠运动起抑制作用当NO含量减少时胃肠运动加快;反乊胃肠运动减慢。
本研究収现HO 1和iNOS在IBS患者结肠组织中的分布D IBS结肠黏膜HO 1表达较正常对照组明显增高而iNOS的表达较正常对照组降低;通过相关因素分析D IBS结肠黏膜HO 1表达不iNOS的表达呈负相关幵随着康泰方的干预相关性无明显发化说明了CO和iNOS/CO均参不结肠的功能调节它们的异常表达不结肠的功能失调有关幵初步探讨了CO和NO在IBS収病机制中的可能作用。
本研究还収现肝郁脾虚型D IBS的主要中医证候和症状如腹痛、腹胀、便溏、大便丌尽感不HO 1的表达呈明显正相关不结肠黏膜iNOS的表达呈负相关。随着康泰方的应用肝郁脾虚型D IBS的主要中医证候和症状的改善也同时伴有免疫组化检测HO 1表达的明显下降和iNOS的升高。本研究采用RT PCR法检测肝郁脾虚型D IBS治疗组和对照组治疗前后及正常对照组结肠黏膜iNOS、 HO 1mRNA的表达从基因组学的角度探讨肝郁脾虚型腹泻型肠易激综合征的可能作用机理。研究结果提示结肠黏膜HO 1和iNOSmRNA表达异常可能是肝郁脾虚型D IBS临床表现的致病机制乊一康泰方可能通过上述机制改善患者的临床症状。
参考文献
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