细胞单细胞克隆技术提纯分化的IBRS-2细胞研究

单细胞克隆技术提纯分化的IBRS-2细胞研

究

中国畜牧兽医2011年第38卷第6期生物技术?87?

单细胞克隆技术提纯分化的IB RS-2细胞研究

高林,李乐,廖德芳,朱明旺.,李华春

(1.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室,

云南昆明650224;2.云南省保山疫苗厂,云南保山678000)

摘要:I BRS-2细胞出现分化变异影响使用,为不影响正常的科学研究,本研究采用单细胞克隆的方法重新提纯,用96孔

板经过3周的独立培养后,将具有代表性的4株进行扩增,然后用已知毒价的口蹄疫病毒(fOOtandmouthdiseasevirus,FM—

DV)弱毒分别对其进行接毒试验和TC I D.测定.结果表明,B 1株克隆细胞的病变最为理想,其TC ID为7.6 O,比提纯前的

4.52更接近实际毒价7.85,且和实际毒价无显着差异.

关键词:单细胞克隆;I B RS-2细胞;分化;提纯

中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1671-7236(2011)06—0087—04细胞培养技术广泛应用于疫苗生产和科学研究

中,细胞培养使用原代和传代细胞,原代细胞一般只

能传到1O代左右,不适合用于规模生产.而传代细

胞理论上是可以无限传代的,所以一般都采用传代

细胞,但在实际生产中传代细胞也会发生分化(Pa—sonerr-Seppfinen等,2001;S iis salo等,2007).IBRS-2

细胞是一种猪肾脏传代细胞,由巴西生物研究所在

1964年培育而成,可用于动物病毒研究和疫苗生产

(周秦冲等,1981).通过试验发现I BRS一2细胞在

经超过300次传代后,细胞形态可产生明显的分化,

病毒接种试验中可见病变产生时间不均一,病变不

完全等特点,在用已知毒价为7.85的口蹄疫病毒

(footandmouthdiseasevirus,F MDV)弱毒进行毒

价测试时,只测得4.52,且病变都不典型.在排除

了支原体,霉菌,牛病毒性腹泻病病毒(bovineviral diarrheavirus,BVDV)等感染后,可以确定为高代

次细胞变异.高代次传代细胞性能下降是生物制品

生产中面临的问题之一,传统方法是复苏低代次细

胞或者重新引种.所以尝试采用单细胞克隆的方法

重新提纯IB RS一2细胞.

1材料与方法

1.1 IB RS一2细胞已经分化的连续传代细胞,由

农业部热带亚热带动物病毒病学重点开放实验室

提供.

1.2 O型FMDV弱毒O型FMD V弱毒由云南

修回日期:2011—03一O7

作者简介:高林(1974一),男,云南人,硕士,研究方向:细胞生物学,动物病毒学.

通信作者:李华春.E—ma il:huac hun-li@ho tma il.co rn

基金项目:云南省应用基础研究项目(2010 ZC 228).

省某疫苗厂提供.

1.3主要试剂MEM培养基,购自I nvitro ge n公

司;新生牛血清,购自Hyclone公司,原产地为新西

兰;胰酶,购自JRH公司.

1.4主要耗材96孔板,Falcon公司产品;12孔

板,CASTAR公司产品;细胞培养瓶,Corning公司

产品.

1.5主要仪器C O培养箱,Heraeus公司产品;

生物安全柜,生物Ⅱ级,Ge lma n公司产品.

1.6用单细胞克隆技术纯化IB RS一2细胞

1.6.1消化细胞选长满IB RS一2细胞的25 c m 培养瓶,在生物安全柜内将培养液倒掉,加人3mL

0.05胰酶(含EDTA),洗涮后倒掉,重复3次.然

后将瓶盖旋紧,放入37℃条件下作用5 ra in,让残余的胰酶消化瓶内的细胞.

1.6.2吹散细胞用吸管移取5mLMEM全生长

液加到消化好的细胞内,然后完整,均衡地吹打细胞,使细胞分散均匀,然后加入MEM全生长液至5OmL,摇匀细胞悬液.

1.6.3细胞计数将细胞悬液用滴头取出30L

加到细胞计数板的样品口内,然后放在倒置显微镜上观察,通过细胞计数器,计算出细胞浓度.

1.6.4细胞稀释根据测出的细胞浓度用滴头从

悬液内将细胞取出100L,剩下的继续分瓶传代,将这100L进行分级稀释,最后要求稀释到浓度为1O个细胞/mL,并且至少要有10mL细胞悬液.

1.6.5细胞加样拆开一块96孔板,在无菌条件

下,将细胞悬液按每孔100肚L加入到每一个板孔内.

1.6.6细胞克隆加样后盖好盖,将96孑L板放人?

88?生物技术中国畜牧兽医2011年第38卷第6期

37.C,5CO培养箱内,并把加湿盘盛上水,每周

观察12次,当有板孔内出现细胞小群落时,每

12d观察一次,当细胞群扩大时,可根据情况更换板孔内的生长液.

1.7细胞扩种当细胞群面积扩大减缓,中心部分细胞特别密集时,可先将具有代表性的板孑L进行标

记,再用胰酶将细胞消化,吹散并转入另一加有MEM全生长液的12孔板内,继续放CO.培养箱内培养.注意板孔之间的对应关系.细胞长满后,将板孔内的细胞消化,吹散并转入另一加有MEM全生长液的25cmz细胞培养瓶内,然后放入普通37.C培养箱内培养.当培养瓶里的细胞长满后,按1 :3的比例,将每一瓶细胞都传代培养.

1.8细胞接毒试验每一个克隆株选2瓶长满的细胞(25cm.),1瓶接种O型FMDV弱毒0.2mL,24h后观察结果,另1瓶作为试验对照,其余的继续传代.

1.9用克隆的细胞株试测定已知毒价FMDV的TC ID5.

1.9.1制备细胞悬液将克隆的细胞株各取2小瓶,消化吹散后,用MEM生长液稀释成细胞悬液,浓度为4×l0个细胞/mL,每个克隆株要10mL.

1.9.2FMDV的稀释将FMDV用MEM维持

液稀释成10,1O,1O_.,10,10一,1O一,1O一,1O共8个稀释度,每个稀释度的体积为要测定的克隆细胞株数×0.5mL.

1.9.3 FMDV稀释液的添加将3个稀释度的含

毒液接到96孑L细胞培养板内,每块板接8个稀释度,每个稀释度接12个孔,每孔接25L.

1.9.4细胞悬液的添加将细胞悬液分别加到上述96孔板内,每块板接种1株细胞,每个板孔接种100L,然后盖上盖,做好标记,放入37℃,5

CO.的培养箱内静置培养,48h后观察结果.

2结果

2.1 IB RS一2细胞高代次分化I BRS一2细胞经过

300次传代后,出现了细胞形态的分化(图1).接种

FMDV后出现病变产生时间不均一,病变不完全,

不均一.分化细胞经过支原体,霉菌,BV DV检测

为阴性,由此判断,高代次传代可能是造成分化的主

要原因.

2.2细胞克隆分化的IB RS一2细胞经过有限稀

释,分配到96孔板中,平均每孔有1个细胞,经过2

周的培养,板孔内出现细胞克隆,且有不同形态的克

隆(图2).经过仔细挑选,从96孔板内选出有代表

性的4个孔,获得细胞克隆株A4,A5,B 1,B7.

图1高代次IB RS-2细胞出现形态分化(50×)

注:从图1可以看出I BRS-2细胞已经明显分化,在视野中至少

可以看到两种形态的细胞A和B,A的个体大,较为短粗,B

的个体小,较为细长.这两种细胞似乎互不相容,不能混杂

生长.

图2细胞克隆的形态分化

注:A,B孔为单个细胞繁殖出来的克隆,二者的形态互不相同;C是由两个形态不同的单个细胞各自繁殖出来的克隆.

2.3克隆细胞株的筛选

2.3.1形态筛选选出的4个细胞株经3次传代

后,发现这4个细胞株,分为两种形态,每种形态2

株,每个细胞株都是形态均一,大小均等,未见分

化的.

2.3.2接毒筛选用已知毒价的FMDV弱毒接种

中国畜牧兽医2011年第38卷第6期生物技术?89?

克隆出的细胞株,并进行TC ID.测定.经过F MD V

接毒试验和TC ID.测定后,克隆出来的4株IB RS-

2细胞中,B1细胞株对FMDV最敏感(图3).用

B 1细胞株测出的TCID5.也最高,为7.6O,结果见

表1,更加接近所用病毒的实际毒价7.85,更加远离

细胞提纯前的毒价4.52.经统计学分析得出,用

B1细胞株测出的FMDV毒价和实际毒价无显着差

异,而和细胞提纯前所测出的毒价差异显着.

图3细胞克隆B1株接FMDV24h效果及对照(100×)

注:A为接毒细胞,B为对照细胞,A中有95以上的细胞发生了病变.表i4个克隆细胞株的接毒筛选

3讨论

3.1关于传代细胞的分化传代细胞从理论上讲

是不容易出现分化的,因为传代细胞在最初建系时

就是经过细胞单克隆技术将目的细胞数量不断扩

大,直到形成一个独立的细胞系,另外克隆出来的细

胞也已经是分化后的细胞,但是不能确定传代细胞

就是细胞分化的终点.

克隆出来的传代细胞能够长期传代,而正常的

体细胞则绝对不行,说明它已经不同于正常的体细

胞了,正常体细胞的分化有明确的终点,从分化的起

点到终点所经历的时间也不会超过产生该细胞所属

动物的平均寿命.而传代细胞系已经脱离了原动物

独立出来,也许是另外一种分化的起点,而其分化的

历程和终点具有不确定性,这取决于培养的代次和

环境.

在培养的细胞中,以BHK一21细胞为例的细胞

库里,该细胞就有许多株或亚株,有的长得快,有的

长得慢,有的耐久力长,有的耐久力短,它们最初都

是由一株B HK一21细胞培养出来的,只是后来发生

了分化,有人将分化的细胞又进行了分离提纯,将不

同生长特点的BHK一21细胞进行单独扩大冻存,最

终形成了新的株或亚株.

3.2关于单细胞克隆技术单细胞克隆术可以用于分离纯化传代细胞和原代细胞,从较早的1955年Puck和Marc us利用稀释法进行He La细胞的克隆培养后,1978年C la rk和P ate ma n通过此技术从中国仓鼠肝脏内分离并建立了枯否氏细胞系,1991年Zwa in克隆培养出睾丸支持细胞等.另外吴信生等

(2008)也成功克隆分离了鸡的胚胎干细胞.

在做单细胞克隆之前,应该先测定细胞的克隆形成率(关伟军等,2008).细胞的克隆形成率是指在接种众多单个分散细胞,经培养后能够分裂形成克隆的百分数.通过细胞的克隆形成率可以了解细胞在极低密度条件下的生长能力.

在本研究中,没有必要先测定细胞的克隆形成率,此次试验的目的除了纯化IB RS一2细胞之外,就是要寻找抗逆性很强的单细胞克隆株,理论上讲,各种细胞都可以进行克隆培养,更何况此细胞为无限细胞系,细胞的克隆形成率不可能非常低(薛庆善,

2003).能形成克隆的细胞肯定有其必然性,将该细胞克隆出来扩大后应具有良好的抗逆性,或者说这种可能性很大.另外这次要分离克隆的细胞本来就已经出现了分化,即使测定出克隆形成率,也没有代表性,所以没有必要先测定细胞的克隆形成率.

3.3关于单克隆细胞株的筛选形态学筛选是进行单克隆细胞株筛选的第一步,通过形态学观察,将形态均一,大小均等,生长旺盛的各个克隆细胞株,?

90?生物技术中国畜牧兽医2011年第38卷第6期单独挑出培养.这是通过肉眼就可以判断的,良好的形态可以对以后判定其接毒效果起着鲜明对照的

作用.接毒是对单克隆细胞株进行筛选的重要手

段,通过接毒试验,将每个细胞株在相同时间内对特

定病毒的敏感程度进行初步判定,此判定虽然粗略,

但它的结果对TC ID.测定具有关联性和预示性,没

有条件进行TC ID.测定的实验室可以采用,通过测

定TC ID.值最终确定目的克隆细胞株.测定

TC ID.值表面上是测定F MD V的毒价,实际上也

是测定各个克隆细胞株对FMDV的敏感程度,测出

的TC ID.值越高,说明该细胞越敏感.TC I D.值可

以更精确,更具体地反映出各个克隆细胞株对FM—

DV的敏感程度.用已知毒价的F M DV在各个克

隆细胞株上进行TC ID.值测定,最接近已知毒价的

克隆细胞株,就是目的细胞株.

3.496个克隆样只有几个可用的解释将细胞悬

液用96孔板稀释克隆是进行细胞单克隆提纯的常

用方法,同时也是比较简易的方法(弗雷谢尼,

2004).接种到96孔板后,并不一定每1个孔都有

1个细胞,有的可能会超过,有的可能没有.有的孑L

即使有细胞,又可能活力不够强,甚至是死细胞.真

正满足接种要求的孔并不多,并且受克隆形成率的

影响,能够长成形态均一,数量充足的就更少了,所

以在96孔板中,能找到满意的细胞克隆并不多.

4小结

试验结果表明,用单细胞克隆技术提纯分化的

IB RS-2细胞是可行的,提纯后细胞的生产性能与正

常细胞相比并不下降.因此,该方法也为处理其它

传代细胞的分化问题提供了一个方向.

参考文献

1弗雷谢尼RI.动物细胞培养——基本技术指南[M].北京:科学

出版社,2004,228230.

2关伟军,马月辉,等.家养动物细胞体外培养原理与技术EM].北京:科学出版社,2008,7137l6.

3吴信生,何先红,戴建明,等.鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备EJ].中国家禽,2008,30(22):3O34.

4周泰冲,刘桂芳,翟盘兴.IB RS-2猪肾细胞株污染病毒的检查口].中国兽医科技,1981(4):29.

5薛庆善.体外培养的原理与技术[M].北京:科学出版社,2003,25O252.

6ClarkJM,PatemanJA.Longtermcultureo fC hinesehamster

Kup fferc e llline s iso latedb yaprimaryc lo ningstep EJ].Experi me nta lC e llRe sea rc h,1978,112:207217.

7PasonenS epp finenS,S uho nenM T.VitaminC e nhancesdiffer entiatio no fa co ntinuo uskeratinocytece llline(REK)intoep i dermiswithnorma lstratumco rne umultrastructureand func tio n alpermeab ilityb arrier[J].His toc he mistryandC e llB io lo gy,

2001,116(4):287297.

8PuckTT,MarcusP I.Arap idmethod fo rviab lece lltitratio n andc lo neproduc tio nwithHe Lace lls intissueculture:theuseo f

Xirrad iatedce lls to supp lyco nd itio ningfacto r[J].ProcNatl

AcadS c iUSA,1955,41 :432437.

9SiissaloS,LaitinenI,Ko ljonenM.Effe cto fc elldifferentiation andpas sagenumbe ro nthee xp ress io no fe ffluxpro te ins inwild typ eandvinb lastine—induc edCaco一2ce lllines[J].EuropeanJour nalo fP harmaceuticsandBiopharmaceutics,2007,67(2):548

554.

10ZwainIH,MorrisP I,ChengC Y.Identificationo faninhib ito ryfacto rfro maS erto lic lo na lce lll ine(TM4)thatmodulatesa—dultratledyingce llstero ido genes is[J].Mo lecularandCe llular