地中海www.ggg.cn

·博士后驿站·收稿日期:2003-11-10基金项目:国家自然科学基金课题(301711997)作者简介:易杰(1965-),女,辽宁灯塔人,副教授,博士后,从事中医基础理论教学与研究.
本文作者还有:陈佩贞3,王荣新4,黄有文4,朱欲英4,李平萍4益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者SCF及EPORmRNA表达的影响易杰1,吴志奎2,黄启福1,蔡辉国3,张新华4(1.
北京中医药大学中西医结合基础博士后流动站,北京100029;2.
中国中医研究院广安门医院,北京100053;3.
中国医学科学院血液学研究所,天津300020;4.
解放军303医院,广西南宁530021)摘要:目的:探讨益髓生血颗粒对造血刺激因子SCF及受体EPOR的mRNA表达的影响,以阐述益髓生血颗粒的疗效机制及中医肾益髓生血的分子基础.
方法:收集、观察临床资料,并于治疗前、给药4、8、12周分别记录和常规血检1次.
于治疗前和治疗后现场取样,采用RT-PCR法检测造血刺激因子SCF及EPORmRNA表达.
结果:治疗后,外周血EPOR、SCFmRNA表达明显增强,电泳带明显变亮.
结论:益髓生血颗粒可能是通过影响造血刺激因子SCF以及EPORmBNA表达来促进骨髓造血,提高Hb、RBC的水平,达到治疗β-地中海贫血的目的;造血刺激因子SCF以及EPORmRNA表达的变化,为中医肾藏精、主骨、生髓理论提供了分子基础.
关键词:SCF;EPOR;mRNA表达;β-地中海贫血;补肾生血中图分类号:R259.
556.
61文献标识码:A文章编号:1000-1719(2004)03-0197-03β-地中海贫血,是一种遗传性溶血性贫血,是严重危害人类健康的世界性顽症之一.
在我国南方各省发病率较高,其中,儿童发病率更高.
现代研究表明,β-地中海贫血的分子基础是β-基因缺少或功能缺乏,β-珠蛋白不能合成,导致早期造血障碍.
因此,其治疗主要集中在基因治疗方面.
治疗方法诸多,补肾生血药以其疗效确切,副作用小,经济易行而为患者接受.
中国中医研究院广安门医院联合303医院、中国医学科学院血液学研究所,多年来,采用益髓生血中药治疗β-地中海贫血取得较为满意的疗效[1],并对其疗效机理从分子基因水平加以探讨.
结果表明,益髓生血中药具有促进γ-珠蛋白转录和表达,诱导HbF合成的作用,从而代偿了β-珠蛋白基因缺陷[2].
近些年,在原来的胶囊剂的基础上,改为颗粒剂.
为了进一步观察疗效及其疗效机理,本文观察了益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血11例,并取治疗前、后静脉血,探讨该药对造血刺激因子SCF及受体EPORmRNA表达的影响.
1临床资料与观察方法本组11例中,男7例,女4例;年龄4~21岁,平均13.
09岁;壮族8例,汉族2例,瑶族1例,均为广西籍.
症状和体征:各例均自幼起病,有贫血的临床表现,发育较差,营养不佳,均有不同程度的地中海贫血面容,11例均有肝增大,其范围2~6cm,平均3.
0cm,脾肿大10例(1例脾已切除),分别在肋缘下3~9cm,平均9.
35cm,其质较硬.
临床化验:Hb48~96g/L,平均69.
818g/L;RBC:2.
06~4.
83*1012/L.
诊断:中间型β-地中海贫血6例,重型β-地中海贫血复合血红蛋白E1例,中间型β-地中海贫血复合血红蛋白E4例.
中医证型:脾肾两虚型5例,其中夹血瘀3例;脾虚血亏型2例;气血两虚型4例.
诊断和疗效判定标准:依据张之南《血液病诊断及疗效标准》(1998年版)[3],凡血红蛋白增加和红细胞增加均为有效.
观察方法:①症状、体征:中医证候均于治疗前、给药4、8、12周分别记录1次;②实验室检查:血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)等每2周检测1次.
中药组成和治疗方法:予益髓生血颗粒,由熟地、山茱萸、炙何首乌、补骨脂、炙黄芪、当归、阿胶、党参等11味中药组成.
中国中医研究院广安门医院制剂室提供.
治疗方法:益髓生血颗粒2包,每包5g,每日3次,3个月为1疗程.
治疗时间:2002年1月9日—2002年4月18日.
统计学方法:采用配对t检验.
2实验材料和方法2.
1主要试剂异硫氰酸胍,AMRESCO分装;十二烷基肌酸钠、溴化乙锭(EB),美国Sigma公司;β-巯基乙醇,Fluka公司;酵母转运RNA(tRNA)、Amersham公司;逆转录缓冲液(RT-buffer)、MMLV-RT(M-MuLVReverseTranscriptase)、MBIFermentas、寡聚核糖脱氧胸苷酸(OligodT)、乙酰化小牛血清白蛋白(BSA),Gibco公司;二硫代苏糖醇(DTT),Promega公司;四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)、RNA酶抑制剂(RNasin),TaKaRa公司;耐热性DNA聚合酶(TaqDNApolymerase),San-gon公司;过硫酸胺(APS),Bio-Rad公司;α-32P-dCTP/dATP,北京福瑞生物工程公司.
·791·第31卷第3期2004年3月辽宁中医杂志LIAONINGJOURNALOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEVol.
31No.
3Mar.
,2004http://www.
paper.
edu.
cn2.
2引物设计与合成由上海生工生物工程公司合成.
H-SCF:15'-----CCTTATGAAGAAGACA-CAAACTTG25'-----ACTTGGCAAAACATCCATCCCGH-EPOR:15'-----CAAGTTCGAGAGCAAAGCGGC25'-----CTGTAGGCAGCGAACACCAGB-actin:15'-----GAGACCTTCAACACCCCAGCC25'-----GGGAAATCGTGCGTGACATT其余试剂均购自上海生工生物工程公司.
2.
3主要仪器PCR仪:90AD型,中国科学院遗传研究所;紫外分析仪:ZF型,上海康华生化仪器制造厂;42℃水浴锅(JY05型PCR样品处理器),北京市君意机电技术公司、河南省三和金信医学科技有限公司.
2.
4实验方法2.
4.
1外周血及骨髓血细胞的分离广西303医院现场取样,抽取β-地中海贫血患者静脉血5ml,ACD抗凝.
梯度分离细胞后,离心,加5倍体积GTC,液氮冻存待用.
2.
4.
2总RNA提取异硫氰酸胍一步法.
2.
4.
3逆转录(RT)反应反应总体积为30l,反应在0.
5mlEppendorf管中进行.
向管中依次加入:5*RTbuffer6l,OligodT2l,0.
1MDTT2l,2.
5mM/每种dNTP3l,1mg/ml乙酰化BSA1l,40U/lRnasin1l,200U/lMMLV-RT1l,RNA提取物14l.
充分混合后,于42℃反应1h,合成cDNA,并于95℃加热5min,终止反应.
2.
4.
4PCR扩增反应总体积为20l,反应在0.
5mlEppendorf管中进行.
按配方依次加入下列试剂,cDNA2l,10*buffer2l,20mMMgCl21.
2l,H2O8l,2mM/每种dNTP2l,β-actin(或EPOR上、下游引物或SCF上、下游引物)各2l,1mg/ml乙酰化BSA0.
4l,5U/lTaq酶1U,α-32P-dATP/dCTP0.
5UCi.
再向每管中加入1滴石蜡油,于94℃槽预变性3min后进入循环.
94℃变性60s、57℃退火50s,72℃延伸50,34个循环后于72℃再延伸8min(此为EPOR扩增条件.
SCF的退火温度为58℃,其余条件同EPOR).
2.
4.
5PCR扩增产物的检测琼脂糖电泳:1.
5%的琼脂糖,0.
5g/mlEB染色法检测.
电泳条件:电压80V,电泳时间30min,扩增产物在紫外灯下观察,呈红棕色荧光带.
3结果3.
1一般状态观察11例,100%症状改善,表现为精神振奋,体力有所增加,饭量增加,睡眠较好,不易患感染性疾患.
中医辨证,脾虚血亏型效果最为明显,气血两虚型次之,脾肾两虚型更次之,脾肾两虚型夹血瘀型效果最差.
3.
2益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者肝脾的影响经过益髓生血颗粒治疗,肝缩小4例,分别缩小0.
5~1.
0cm,平均0.
2cm.
经统计学处理,双侧检验,P>0.
05,肝缩小无统计学意义;脾缩小8例,分别缩小0.
5~1.
5cm,平均0.
7cm.
经统计学处理,双侧检验,P<0.
01,脾缩小有统计学意义.
见表1.
表1益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者肝脾的影响(-X±s,n=11)肝(cm)治疗前治疗后差值脾(cm)治疗前治疗后差值3.
1±1.
32.
9±1.
30.
2±0.
38.
5±4.
87.
8±4.
6*0.
7±0.
5注:治疗前与治疗后比较,*P<0.
01.
3.
3益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者Hb、RBC的影响见表2.
表2益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者Hb、RBC、RET、HbF的影响(-X±s,n=11)Hb(g/L)RBC(*1012/L)疗前69.
818±12.
7113.
463±0.
788疗后84.
636±18.
742*3.
973±0.
599*差值14.
818±8.
9310.
510±0.
199注:治疗前与治疗后比较,*P<0.
01.
3.
4益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者外周血EPORmRNA表达的影响治疗后EPOR表达明显增强,电泳带明显变亮,见图1.
图1益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者外周血EPORmRNA表达的影响3.
5益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者外周血SCFmRNA表达的影响治疗后SCF表达增强,电泳带变亮,见图2.
图2益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者外周血SCFmRNA表达的影响4讨论正常造血过程包括造血干细胞或祖细胞不断地增殖和分化,在维持正常外周血细胞成分的同时,保·891·辽宁中医杂志31卷持自身干细胞池的稳定.
因此,造血干/祖细胞的数量不但是维持正常造血所必需,而且也反映造血贮备量,该过程在多种造血细胞生长因子(HGF)的调节下进行[4].
干细胞因子(stemcellfactor,SCF)是1990年发现的一种新的重要的造血细胞因子,又叫干细胞生长因子(stemcellgrowthfactor,SCGF)、肥大细胞生长因子(mastcellgrowthfactor,MGF)[2,3],又叫青灰因子(steelfactor,SLF)或盒配体(c-kitligand,KL),是通过与c-kit受体的结合而引发其对造血干细胞和祖细胞的增殖、分化以及存活活性的[5].
c-kit受体与其配体SCF结合是正常造血干/祖细胞的增殖分化,尤其是红系造血祖细胞发育成熟和血红蛋白形成的必要条件[6].
它由骨髓基质细胞产生,其单独存在即有促增殖作用,与促红细胞生成素(EPO)联合应用有明显的协同作用[7].
在多种组织和细胞中都有SCF表达,包括脑、肝脏、骨髓、胎盘、睾丸、肾脏等,主要由这些组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵细胞、足细胞(Sertolicell)、肝细胞产生,一些肿瘤细胞系、纤维肉瘤细胞系也能产生SCF[8].
SCF的受体为原癌基因c-kit的表达产物,为酪氨酸激酶受体.
c-kit受体广泛存在于各种发育阶段的造血细胞以及其他的一些组织中[9].
SCF是一种作用于最早期造血干/祖细胞的造血细胞因子,在维持造血细胞存活,促进造血细胞增殖分化,调控各系造血细胞的生长发育中起着重要作用,而其它造血细胞因子如G-CSF、GM-CSF、EPO、IL-11、TPO等都是作用于较晚期或晚期定向增殖分化的细胞[10].
人红细胞生成素受体(EPOR)是位于相对成熟阶段人体红系祖细胞表面的跨膜蛋白,它能专一结合人红细胞生成素.
人红细胞生成素(EPO)是一种促进人体红系祖细胞生长、增殖和分化的主要生长因子[11].
EPOR除了存在红细胞表面外,在非红系的细胞上也有[12].
地中海贫血,多因先天禀赋不足,肾精不充所致.
先天之本在肾,肾藏精,主骨生髓,精血互生.
因而,肾精不足,血之化生减少,导致血虚.
脾为后天之本,气血生化之源,赖先天之精以滋养,又不断地补养先天之精.
益髓生血颗粒是宗《内经》"精不足者,补之以味"的原则,根据中医肾藏精生髓、精血同源的理论,在长期临床实践基础上研制出来的.
具有滋肾养肝,益精生血,健脾补气的功能,以补肾为主,兼以健脾养肝.
经临床十余年的实践证明,益髓生血颗粒能够明显改善β-地中海贫血患者的临床症状,能够提高外周血Hb、HbF、RBC[1].
本实验结果,益髓生血颗粒能够提高β-地中海贫血患者外周血Hb、RBC,使脾肿大减轻,缓解肝肿大的程度,与以往研究结果一致.
中医肾藏精,主骨生髓,精化生血,为血液化生提供充足的养料.
益髓生血颗粒重在补肾生精,因此,可提高外周血象中红系各项指标.
β-地中海贫血肝、脾肿大因虚而致,补肾生血可以改善血虚病理状态,从而使肝、脾肿大得以改善.
有研究表明,干细胞因子及其受体原癌基因蛋白质(c-kit)之间相互作用对原始生殖细胞迁徙、存活和粘连及其他阶段生殖细胞增殖、分化、减数分裂和细胞凋亡的重要旁分泌调控作用[13].
至于益髓生血颗粒对β-地中海贫血患者的治疗作用,是否是通过影响生殖细胞增殖、分化等过程而影响肾藏精、生髓生血功能,有待以后实验进一步探讨.
益髓生血颗粒还能提高血红蛋白珠蛋白mR-NA[2]和造血刺激因子GM-CSFmRNA表达[14],为中医肾生髓理论提供了分子基础.
药效学实验表明,益髓生血颗粒对多种贫血动物模型均有较好的治疗作用,能够促进小鼠骨髓造血祖细胞的增殖分化[15]等作用.
本实验益髓生血颗粒能够增强EPOR与SCFmRNA表达,与上述实验结果相似.
说明益髓生血颗粒可能是通过影响造血刺激因子SCF与E-PORmRNA表达来促进骨髓造血,提高Hb、RBC的水平,达到治疗β-地中海贫血的目的,并再一次从分子基因水平印证了中医肾生髓理论.
至于不同造血刺激因子及其受体在肾生髓中的作用机制,有待深入探讨.
参考文献:[1]吴志奎,黄有文,王荣新,等.
益髓生血颗粒治疗β-地中海贫血症29例临床观察[J].
中医杂志,2000,41(2):90-91.
[2]吴志奎,蔡辉国,陈佩贞,等.
补肾生血方对β-地中海贫血基因水平的影响[J].
中医杂志,1997,38(2):91-93.
[3]张之南,沈悌.
血液病诊断及疗效标准[S].
第2版.
北京:科学出版社,1998.
33.
[4]傅晋翔,虞斐,张学光.
再生障碍性贫血患者造血细胞生长因子的测定及其意义[J].
新医学,2001,32(5):274.
[5]叶波平,张玉彬,吴梧桐.
干细胞因子的研究与应用[J].
药学进展,2000,24(6):321.
[6]ScopesJ,DalyS,AtkinsonR,etal.
Aplasticanemia:evidencefordysfunctionalbonemarrowprogenitorcellsandthecorrectiveeffectofgranulocytecolony-stimulatingfactorinvitro[J].
Blood,1996,87:3179.
[7]嵇月红,王良绪,陈萍生.
干细胞因子对正常造血祖细胞作用的研究[J].
江苏医药,1997,23(4):230.
[8]孙卫民,王慧琴.
细胞因子研究方法[M].
北京:人民卫生出版社,1999.
663.
[9]KatayamaN,ShihJP,NishikawaS,etal.
Stage-specificexpressionofc-kitproteinbymurinehematopoieticprogenitors[J].
Blood,1993,82:2353.
[10]AndrewsRG,knitterGH,BartelmerSH,etal.
Recombinationhumanstemcellfactor,akitligand,stimulateshematopoiesisinprimates[J].
Blood,1991,78(8):1975.
[11]王少雄,董晨,华子春.
人红细胞生成素受体的研究进展[J].
生物化学与生物物理进展,1995,22(3):198.
[12]郑庆棠,王鸿利.
红细胞生成素受体结构、功能与临床[J].
临床血液学杂志,1996,9(2):81.
[13]刘光伟,龚守良.
SCF/c-kit系统对生精细胞发育的调控作用[J].
吉林大学学报(医学版).
2002,28(5):561.
[14]陈智松,吴志奎,蔡辉国,等.
从补肾生血药对衰老小鼠骨髓GM-CSF基因转录水平的影响探讨肾生髓的分子基础[J].
中国中医基础医学杂志,2001,7(4):28.
[15]张新华,黄有文,王荣新,等.
益髓生血灵对小鼠骨髓造血干/祖细胞的影响[J].
浙江中医杂志,2003,37(10):448.
编辑:刘劲收稿日期:2003-11-04作者简介:胡作为(1968-),男,湖北浠水人,在站博士后,主治医师,主要从事老年病(呼吸系统)基础与临床研究.
·991·第31卷第3期2004年3月辽宁中医杂志LIAONINGJOURNALOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEVol.
31No.
3Mar.
,2004