干细胞zuanke8

中国组织工程研究与临床康复第15卷第10期2011–03–05出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchMarch5,2011Vol.
15,No.
10ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH17311DepartmentofEmergency,2DepartmentofGeneralSurgery,QingdaoCentralHospital,Qingdao266042,ShandongProvince,China;3DepartmentofSpinalSurgery,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266042,ShandongProvince,ChinaWangXiao-yan,Doctor,Physician,DepartmentofEmergency,QingdaoCentralHospital,Qingdao266042,ShandongProvince,Chinaxiaoyan.
wang445@hotmail.
comCorrespondenceto:ChenBo-hua,Chiefphysician,DepartmentofSpinalSurgery,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266042,ShandongProvince,Chinabhchen@hotmail.
comReceived:2010-10-19Accepted:2011-02-13年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响王小艳1,王志伟2,王青山1,谢东方1,陈伯华3EffectofagingonproliferativecapacityofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsinvitroWangXiao-yan1,WangZhi-wei2,WangQing-shan1,XieDong-fang1,ChenBo-hua3AbstractBACKGROUND:Mesenchymalstemcells(MSCs)fromhumanbeingscanproliferateanddifferentiatetorepairthedamagesoftissuesandorgans.
Thereparationcapacityoftissuesandorgansdecreaseswithage.
QuestionarisesiftheproliferationcapacityofMSCsdeceaseswithage.
OBJECTIVE:ToevaluatetheeffectofagingontheproliferativecapacityofhumanMSCsinvitro.
METHODS:FifteenbonemarrowspecimenswereobtainedfromthepatientsinQingdaoCentralHospital,whoreceivedtheoperationofbonebecauseofbonefractureorhipdiseases.
Theyweredividedintothreegroups:5childrenagedfrom7to12years;5adultsagedfrom20to55years;5elderagedfrom60to90years.
Thebonemarrowisolatesweretakenoutfrompatientsduringoperation.
Themononuclearcellswereisolatedfrombonemarrowusingdensitygradientcentrifugationandseededintothecultureflask.
Onthefifthday,colonyformingunitswerecountedundermicroscope.
Whenthecellsreachedaconfluence,theywerepassagedandfurtherculturewasprecededintwoways:192cellswereseededintwo96-wellplatestostudythecloningefficiencyofsinglecells;12500cellswereseededinT25flaskatthedensityof5*103/cmtostudytheproliferationrateofcells.
RESULTSANDCONCLUSION:TherewerenocorrelationbetweencolonyformingunitsandproliferationrateofMSCsculturedinvitroandtheage(P>0.
05),butthecloningefficiencyofsinglecellsdecreasedwithage(P0.
05),但单细胞克隆形成能力随年龄增长而下降(P<0.
01).
提示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力没有随年龄的增长而下降,但其中能形成单细胞克隆未定向干细胞的数量随年龄的增长而减少.
关键词:年龄;骨髓间充质干细胞;体外;增殖能力;单克隆形成doi:10.
3969/j.
issn.
1673-8225.
2011.
10.
005王小艳,王志伟,王青山,谢东方,陈伯华.
年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响[J].
中国组织工程研究与临床康复,2011,15(10):1731-1735.
[http://www.
crter.
orghttp://cn.
zglckf.
com]0引言骨髓间充质干细胞是一种具有多分化潜能的成体干细胞,研究证明骨髓间充质干细胞可以分化为成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞,肌腱细胞,肝细胞和神经细胞等[1-8].
骨髓间充质干细胞由于取材方便、易于体外培养增殖和多向分化潜能,已成为组织工程技术理想的种子细胞.
骨髓间充质干细胞具有高度的自我更新能力,在体内它被认为是间充质组织损伤后修复主要的细胞来源.
在临床上发现老年人组织修复能力较年轻人明显减弱,这是否提示随着年龄增长骨髓间充质干细胞自我更新能力逐渐下降对此,目前国内外各项研究看法不一,本实验通过比较不同年龄组人群骨髓间充质干细胞的数量及增殖能力,旨在探讨年龄对人骨髓间充质干细胞增殖能力的影响.
1材料和方法设计:对比观察.
时间及地点:实验于2009-02/2010-04在王小艳,等.
年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响P.
O.
Box1200,Shenyang110004cn.
zglckf.
com1732www.
CRTER.
org青岛市中心医院,1急诊科,2普外科,山东省青岛市266042;3青岛大学医学院附属医院脊柱外科,山东省青岛市266000王小艳,女,1980年生,山东省威海市人,汉族,2009年德国海德堡大学毕业,博士,医师,主要从事骨髓间充质干细胞的研究.
xiaoyan.
wang445@hotmail.
com通讯作者:陈伯华,主任医师,青岛大学医学院附属医院脊柱外科,山东省青岛市266000bhchen@hotmail.
com中图分类号:R394.
2文献标识码:A文章编号:1673-8225(2011)10-01731-05收稿日期:2010-10-19修回日期:2011-02-13(20101019022/WL·Y)Tgen=t/(3.
32[log10Nt-log10N0]青岛市中心医院干细胞研究中心完成.
材料:15份骨髓标本取自青岛市中心医院骨折或行髋关节置换患者,其中儿童5例,年龄7~12岁,平均9.
4岁;成年人5例,年龄20~55岁,平均43.
6岁;老年人5例,年龄60~90岁,平均75.
6岁.
纳入标准:经临床体格检查和生化检查符合置换条件.
排除标准:除骨科疾病外无其他病史.
主要仪器及试剂:实验方法:骨髓间充质干细胞的分离、纯化和培养:将获得的人的肝素化骨髓标本置于50mL离心管内,加入两倍体积的PBS,1000r/min离心10min,去上清后再重复一次以去除骨髓标本中的脂肪组织.
将骨髓组织轻轻加到淋巴细胞分离液的上层,1800r/min离心30min.
经过离心后离心管内的液体分为3层,上层为水和血清,中层为单核细胞层,下层为红细胞,将单核细胞轻轻吸出后置于另一离心管内,加PBS冲洗2遍,并计数单核细胞数.
以3*105/cm2的密度接种单核细胞于培养瓶内,置于37℃,体积分数为6%CO2,100%湿度的培养箱内培养.
实验中所使用的骨髓基质干细胞培养液是根据Reyes等[9]在2001年发表的文献配置的,其成分为体积分数54.
75%DMEM高糖培养基,体积分数40%MCDB201培养基,体积分数2%胎牛血清,胰岛素10mg/L,转铁蛋白10mg/L,选择素10μg/L,体积分数1%双抗,地塞米松0.
02μmol/L,抗坏血酸0.
1μmol/L,PDGF-BB10μg/L,促表皮生长因子10μg/L.
接种后第5天首次换液,以后每周换2次液直到细胞达到90%融合.
传代时用0.
25%胰蛋白酶消化,计数,13∶传代.
第2代细胞用流式细胞分析判断是否为骨髓基质干细胞.
集落形成单位的计数:原代培养中单核细胞以3*105/cm2的浓度接种于培养瓶后第5天首次换液,换液后在倒置显微镜下观察贴壁细胞并计数CFU-F的数量.
大于30个细胞并呈放射状生长的细胞集落被认为是CFU-F.
CFU-F被认为是由有增殖能力的骨髓间充质干细胞扩增形成的.
骨髓间充质干细胞体外增殖:当培养瓶内的骨髓间充质干细胞生长到约90%融合的状态,用0.
25%胰蛋白酶进行消化并计数.
次代细胞培养以两种方式进行:192个细胞以1个/孔的密度接种于2个96孔培养板内观察骨髓间充质干细胞单细胞克隆的形成能力;12500个细胞以5*103/cm2的浓度接种于T25培养瓶观察细胞增殖率.
细胞增殖率:当原代细胞达到90%融合,计数12500个细胞并以5*103/cm2的浓度接种于T25培养瓶内来进行次代培养,当细胞融合后也以同样的方法进行下一代的培养直到细胞不能进行传代.
倍增时间用来表示细胞的增殖率.
倍增时间是指细胞经过一个细胞周期所需要的时间,与增殖率成倒数关系.
计算公式如下:此公式只能用于处于对数生长期的细胞,而不适用于所有的细胞,其中Tgen代表细胞倍增时间,t代表细胞增殖时间(单位h),N0指原始细胞数量,Nt指经过一段时间(t)培养后所得到的所有细胞数.
单细胞克隆形成能力:当原代细胞达到90%融合,用胰蛋白酶消化细胞后计数192个细胞以1个/孔的密度接种于2个96孔培养板内.
每周换液2次,持续培养至少2周.
在倒置显微镜下观察细胞,如果在1个孔内的贴壁细胞能够达到融合状态,就认为这个孔内的细胞能形成单细胞克隆.
单细胞克隆形成效率以形成单细胞克隆孔数/192来计算.
主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态、大小,并计数集落形成单位数量;流式细胞仪检测表面抗原;比较不同年龄组骨髓间充质干细胞的单细胞克隆形成能力和细胞增殖率.
统计学分析:由第二作者采用KendalTauB检验对研究指标与年龄的相关性进行统计,实验数据以x_±s表示,P<0.
05为差异有显著性意义.
试剂及仪器来源DMEM高糖培养基MCDB201培养基,胰岛素-转铁蛋白-选择素添加成分,地塞米松,抗坏血酸,促血小板生长因子(PDGF-BB),促表皮生长因子(EGF)胎牛血清,双抗青霉素与链霉素,丙酮酸Pyruvate,脯氨酸Proline,BSACO2培养箱倒置显微镜离心机淋巴细胞分离液Ficoll美国GibcoSigmaBiochromKG德国Haraeus德国ZeissAxiovert德国HaraeusInstrumentsGE通用公司王小艳,等.
年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH1733www.
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org2结果2.
1人骨髓基质干细胞鉴定和形态学观察流式细胞分析鉴定细胞表面标志显示细胞CD29、CD44、CD105、HLA-ABC阳性表达,而CD34、CD45、CD90、HLA-DR阴性表达,见图1.
倒置显微镜下可见大量贴壁细胞,为梭形或成纤维细胞样,大多成克隆样生长,每个克隆内细胞呈放射状分布,呈极性状态,还有部分细胞散在分布,呈三角形或扁平状,细胞生长很快,5~7d后一般可达到90%融合,见图2.
2.
2集落形成单位与年龄的关系实验中共有13份骨髓标本有集落形成单位,2份在第5天换液时未发现有集落形成单位.
集落形成单位在不同年龄人群的骨髓标本中差异很大,每百万单核细胞中集落单位数:儿童组为15.
3±16.
1,成年人组为11.
5±11.
6,老年组为13.
6±13.
7.
集落形成单位数量与年龄关系见图3,可见集落形成单位数量与年龄增长无明显关系(R2=-0.
077,P=0.
691).
2.
3骨髓间充质干细胞的增殖率实验中大部分细胞都可以传代三四次,而一部分老年组的细胞传代次数明显减少至一两次.
由于倍增时间是指处于对数生长期的细胞,所以实验观察第1代和第2代细胞的倍增时间.
第1代细胞的倍增时间为:儿童组46.
7h,中年组70h,Figure3Therelationshipofcolonyformingunitswithage图3集落形成单位数量与年龄的关系454035302520151050Colonyformingunits0102030405060708090Age(yr)R2=-0.
077P=0.
691Figure1Flowcytometryanalysisofcellsurfacemarkers图1流式细胞鉴定细胞表面标志表达a:Blankcontrolc:CD34b:CD29d:CD44e:CD45f:HLA-ABCg:HLA-DRh:CD90CD105i:CD90CD105blankcontrolFigure2Theshapesofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsunderinvertedmicroscope(*100)图2倒置显微镜观察人骨髓基质干细胞形态变化(*100)a:Thecellsdisplayedfusiformorfibroblast-likec:Thecellsconfluencedb:Somecellsscattered15FL1LDG100101102103B33FL1LDG100101102103K23FL1LDG100101102103R23FL1LDGT1001010210323FL1LOG100101102103O23FL1LOGN10010110210315FL1LOGP100101102103王小艳,等.
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com1734www.
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org老年组93h;第2代则为:儿童组82h,中年组248h,老年组947h.
结果显示倍增时间在不同的骨髓标本中差异很大,但均与年龄没有明显的关系(P1∶R2=0.
337,P=0.
083;P2∶R2=0.
213,P=0.
035),见图4,5.
2.
4单细胞克隆形成能力与年龄的关系在15份骨髓标本中,共有12份标本可以形成单细胞克隆,其他3份标本则没有形成单细胞克隆,这3份标本全部来自老年组.
各组形成单细胞克隆的效率分别为:儿童组(6.
1±0.
7)%,中年组(2.
1±1.
8)%,老年组(1.
7±3.
2)%.
单细胞克隆形成能力与年龄的关系见图6,结果显示单细胞克隆形成能力随年龄增长而显著下降(R2=-0.
604,P=0.
002).
3讨论骨髓间充质干细胞具有多种细胞分化潜能,它可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞及神经元细胞等.
因此骨髓间充质干细胞被认为是体内组织修复细胞的主要来源.
临床实践证实老年人的组织修复能力远远不如儿童,例如新生儿股骨骨折只需2周就能达到坚固愈合,而老年人则至少需要3个月.
这是否提示用来修复组织损伤的骨髓间充质干细胞也随着年龄的增加而出现自我更新能力的下降本实验通过观察不同年龄人群骨髓间充质干细胞的增殖能力进而分析年龄对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响,结果显示骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力并没有随着年龄的增长而下降,以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程仍可应用于老年人.
对于不同年龄人群骨髓间充质干细胞的数量是否存在差别,不同的研究有不同的意见.
有些研究认为骨髓间充质干细胞的数量随着年龄的增长而下降[10-12],而有些研究则并没有发现这样的变化[13-15].
实验表明不同年龄人群集落形成单位数量有很大的差别,此差别与年龄之间没有明显的关系.
本实验发现从骨髓标本中分离的单核细胞中每百万个大约有13.
47个是骨髓间充质干细胞,这与很多研究报道的10个很接近[16-17].
另外实验结果还表明不同年龄人群骨髓间充质干细胞的倍增时间与年龄之间没有明显关系,说明骨髓间充质干细胞的自我更新能力随着年龄的增长依然保持稳定,这与Pittenger等[17]的发现一致.
Pittenger等[17]研究人骨髓间充质干细胞的增殖能力与成骨方向分化的潜能,发现骨髓间充质干细胞的增殖能力与年龄及性别之间没有明显的关系.
单细胞克隆形成能力是专门设计用来研究骨髓间充质干细胞中未定向干细胞的.
有研究证实体外培养的骨髓间充质干细胞具有复杂的细胞成分[18-20],含有很多处于不同分化阶段的干细胞,其中包括未定向干细胞和定向干细胞,还有很多其他细胞,包括骨髓基质细胞,上皮细胞,成纤维细胞等.
其中未定向干细胞被认为是可以无限增殖和具有向所有间充质组织方向分化潜能的干细胞,其后代可变成定向干细胞.
定向干细胞是处于不同分化阶段的各种干细胞,包括三四种分化潜能的干细胞,有2种分化潜能和只有1种分化潜能的干细胞.
未定向干细胞具有很少的数量(本实验为3%),较其他细胞更大的增殖潜力,不易衰老以及即使在老年人群也同样存在的特性与实验中的单细胞克隆形成细胞的特点一致.
实验表明骨髓间充质干细胞的单细胞克隆形成能力随着年龄的增长逐渐下降.
这在以前的研究中没有报道,具体的原因不清,可能与随着年龄的增长未定向干Figure4Therelationshipofgenerationtimeofpassage1mesenchymalstemcellswithage图4第1代骨髓间充质干细胞倍增时间与年龄的关系140120100806040200Generationtime(h)020406080100Age(yr)R2=0.
337P=0.
083Figure5Therelationshipofgenerationtimeofpassage2mesenchymalstemcellswithage图5第2代骨髓间充质干细胞倍增时间与年龄的关系2000150010005000Generationtime(h)020406080Age(yr)R2=0.
213P=0.
335Figure6Therelationshipofsinglecellcloningefficiencywithage图6单细胞克隆形成能力与年龄的关系876543210Singlecellcloningnumber/192020406080100Age(yr)R2=-0.
604P=0.
002王小艳,等.
年龄对人骨髓间充质干细胞体外增殖能力的影响ISSN1673-8225CN21-1539/RCODEN:ZLKHAH1735www.
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org细胞的细胞凋亡有关.
实验结果显示体外培养的骨髓间充质干细胞的数量和增殖能力与年龄之间没有明显的关系,说明老年人骨髓间充质干细胞具有与年轻人同样的增殖能力,这表明以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程应用于老年人有着光明的前景.
但骨髓间充质干细胞中未定向干细胞的数量随着年龄的增加而减少,说明人体的干细胞库随着年龄的增加而逐渐减少.
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External:adj.
外来的,外部的,外面的,表面的n.
外观,外部,外界事物adj.
[医]外用的英英解释:名词external:outwardfeatures形容词:external:①happeningorarisingorlocatedoutsideorbeyondsomelimitsorespeciallysurface②comingfromtheoutside同义词:extraneous,outside③fromorbetweenothercountries同义词:international,outside④purelyoutwardorsuperficial-A.
R.
Gurney,Jr.
本刊例句:Amedianincisionwasmadeatthecervicalnecktoexposetherightcommoncarotidartery,externalcarotidarteryandinternalcarotidartery.
来自本文课题的更多信息--作者贡献:通讯作者进行实验设计,第一作者完成实验实施、成文,并对文章负责,第二作者完成实验统计学分析工作及文章的审校,第一、三、四作者共同负责资料的搜集等工作,实验评估为全部作者,均经过正规培训,采用盲法评估.
利益冲突:课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助.
伦理批准:实验中患病个体完全知情同意将其骨髓标本用于骨髓间充质干细胞的研究并签署知情同意书,实验方案获得青岛市中心医院伦理委员会批准.
本文的创新性:经检索中国医学数字数据库,检索关键词"年龄,骨髓间充质干细胞,体外,增殖能力",由最终检索结果认定实验具有先进性.
本课题设计的创新之处在于设计单克隆形成能力来观察骨髓间充质干细胞复杂成分中具有无限增殖能力的未定向干细胞,这在以前的实验报告中未被提及,并因为这个创新亮点获得青岛市中心医院的基金资助.
医学英语单词例句:本刊英文部ISSN1673-8225CN21-1539/R2011年版权归《中国组织工程研究与临床康复》杂志社所有