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药物生物技术01223,!
(4):3546357电穿孔法转化大肠杆菌893的条件优化!
李南,凌世淦1,吴梧桐3(3:中国药科大学生物制药学院,南京13222;;1:军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室,北京322#@A5B经电穿孔转化大肠杆菌893菌株的影响因素,并优化其转化条件.
电场强度和脉冲时间的影响较为复杂,两者适当组合才可获得高转化效率.
此外,采用对数生长早期的细菌,提高细菌浓度和降低筛选用氨苄青霉素的浓度均可提高转化效率.
关键词电穿孔;转化效率;大肠杆菌893中图分类号:C7H"KL!
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Q3=]和质粒>#@A5B(7:4R@,D>$),由军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室保存;蛋白胨和酵母提取物为ST-*L公司产品,QS!
U购自北京鼎国生物工程公司,氨苄青霉素(简称D>)和其余试剂为进口或国产分析纯;U,培养基(4V蛋白胨,1V酵母提取物,3VQS!
U,2:5V葡萄糖,32%%-+WXQ/Y+1,>ZA:2),US,培养基(1V蛋白胨,2:=V酵母提取物,2:2=VG#Y+,1:=%%-+WX[Y+,32%%-+WXQ/Y+1,>ZA:2),US,ED培养基(含322%/WXD>的US,培养基),USY培养基(US,培养基,加12%%-+WX葡萄糖),USYED培养基(含322%/WXD>的USY培养基);NGE323型基因脉冲导入仪(天津理工学院),X#%@L#1\]W]NU型光谱分析仪(美国!
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EH+%'$公司).
3:1菌株制备将EA2^冻存的893菌种分别于US,和US,ED琼脂平板上划线培养,验证其为D>K.
从US,平板上挑取单菌落,4A^于U,培养基中培养至SF722约为3:2.
取培养物按3_322的比例重接于U,培养基中,4A^培养至SF722约为2:7.
培养物冰浴中放置42%*.
后,在5^以5222$W%*.
离心3=%*.
.
用预冷的32V甘油溶液重复洗涤细菌4次,最后于453!
收稿日期:1223E24E31基金项目:北京市自然科学基金资助,G-'A221243作者简介:李南(3;A7年生),男,江苏南京人,中国药科大学硕士生,分子生物学,HE%#*+:K-()"E+''a!
",离心*$'().
弃上清后加少量+$,甘油溶液将细菌悬浮,取样稀释测-.
/$$值,计算细菌浓度并调整至*0+$+$&'1,每管*$$!
1分装后23$"冻存备用.
+4#质粒制备56783!
9在!
4中扩增,采用上海华舜生物工程公司质粒提取试剂盒提取,经琼脂糖电泳和紫外吸收法分析和鉴定产物纯度.
用灭菌超纯水稀释至2*$"保存备用.
+4!
转化方案23$"保存的感受态细菌于冰浴中缓慢解冻,与*!
1质粒溶液混匀后,加于预冷的样品杯内.
电击后,迅速加入+'1预冷的-@培养基,混匀后#3"缓慢振荡培养!
A'().
培养物用-@培养基有限稀释,分别铺于-@和-@BC平板上,培养过夜后计数,计算转化效率(转化子数&!
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DC)和存活率(转化后活菌数&转化前细菌总数).
!
结果*4+脉冲时间和电场强度对EF+菌株转化效率的影响分别在/,G,+$,+*HI&J'的电场强度下,通过改变电路中电容值的大小来控制脉冲时间的长短,结果见图+.
电场强度恒定时,脉冲时间延长,转化效率在一定范围内增加而达到最大值.
更长的脉冲时间导致转化效率迅速降低.
如场强为+$HI&J'时,转化效率在脉冲时间约为+A'K时达到最高.
电场强度的影响较为复杂.
脉冲时间较短(小于++'K)时,转化效率与电场强度呈正相关.
脉冲时间较长(大于*+'K)时,随着场强的增大,转化效率明显降低.
当脉冲时间适中(在++'K和*+'K之间)时,转化效率在某一场强处达到最大值,场强增大或减小均降低转化效率.
本实验表明,GHI&J'电场强度下脉冲+G'K时,EF+菌的电转化效率最高.
*4*脉冲时间和电场强度对EF+菌株存活率的影响以上实验中,同时记录电穿孔后存活细菌的数量,观察脉冲时间和电场强度对存活率的影响(图*).
由图*可知,脉冲时间延长,电场强度增大均会导致存活率降低.
当转化效率达到最高时,死亡率也很高,说明外源生物分子进入菌体内同时,也有大量细菌不胜"重压"而死亡.
在此基础上再延长脉冲时间,或增大电场强度,转化效率和死亡率均增高,此时转化效率的主要限制因素就是大量受体细菌的死亡.
*4#EF+细菌浓度对转化效率的影响将细菌悬液按+L+$梯度稀释.
取等体积不同浓度的细菌悬液进行电穿孔,电场强度为GHI&J',脉冲时间控制在+3到+27培养基中,振摇后均可生长,证明不是假阳性克隆.
由于抗性筛选是在电穿孔过程之后进行,故78是通过电击后存活的转化子数来改变转化效率的.
!
讨论菌株大小、形状、细胞壁和细胞膜组成不同,则对相同强度的电脉冲敏感程度不一样,所以不同菌株的转化效率各异.
我们观察了大肠杆菌@A9电穿孔转化的几个影响因素,结合电穿孔作用的机理对转化条件进行了优化.
电场强度和脉冲时间是影响转化效率的两个关键因素.
电穿孔过程中,外源分子进出的孔隙是在电场的作用下,细胞表面结构的两侧形成极化,产生高强度的跨膜电势.
当该电位差超过某一临界水平时,细胞表面被击穿而产生暂时性的孔道[B],这些过程在几到十几毫秒内完成[C].
因此,只要采用足够高的电场强度击穿细胞,并且用一定时间的电压维持这些孔道的存在就可以实现细胞的转化[D].
本研究结果表明,适当的场强和脉冲时间的组合可使转化效率达到最大值.
其中之一改变时,达到最大转化效率时的另一参数也随之改变.
这种现象可能是因为高场强下,细胞表面两侧电位差很高,瞬间击穿表面而形成孔道,所需时间短;低场强下,细胞表面极化所需时间较长,电荷积累到一定强度后,才能作用于细胞表面.
受体细胞也是影响转化效率的重要原因.
细胞浓度高时,外源分子进入的几率增加,转化子数就会增多.
处于对数生长早期的细菌生命力旺盛,表面结构致密度比稳定期的细菌差,转化效率高.
另外据报道,培养基高压灭菌产生不利于细菌生长的化合物,采用洁净状况下新鲜配置的培养基不经高压灭菌培养细菌,转化效率可增加4:E.
电穿孔体系中甘油的作用是有利于保存细菌,但会影响细胞活性.
有研究用超纯水反复洗涤细菌后,直接进行电穿孔,转化效率可进一步提高.
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"#FG).
8.
1-3!
"#6718"("00"1-)"*+3电穿孔后受体细菌的恢复能力与转化效率也有关系.
电穿孔是一种物理作用,故放电过程必然使细菌受到一定程度的损害.
电穿孔过程中,有相当一部分细胞表面产生空隙,外源生物大分子进入细胞,但却不能承受一定时间的高场强而破裂死亡,产生无效转化.
电穿孔后细菌修复能力越强,转化效率越高.
本研究筛选时采用低浓度78以降低抗性压力,转化子数明显增多,表明电穿孔后的细胞虽经短时间的培养,仍然较脆弱,适当降低选择压力,使转化菌的抗性基因足够表达,可进一步提高转化效率.
在电穿孔体系中,低离子强度是维持一定时间高场强的关键.
如果电击液中电解质浓度高,导电能力强,放电两极之间形成低电阻通路,瞬间电流急剧增加,电场强度迅速减小,产生激烈的放电现6F9李南等:电穿孔法转化大肠杆菌@A9的条件优化象,对受体细胞形成无效放电或旁路放电,不能产生传输孔道.
同时,瞬间强电流导致电击体系温度骤然升高,大量细菌死亡.
由于细菌太小,通常需要用较高的场强,为了避免产热又达到一定的脉冲时间,有必要在电击转化前采用超纯水充分洗涤细菌,同时降低电击时的温度.
另外,外源分子的大小、构型、纯度、浓度以及与受体细菌的比例均影响转化效率.
最终,我们利用不经高压灭菌的培养基培养大肠杆菌*+#,生长至,-!
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/$,超纯水反复洗涤并浓缩至$0#.
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用终浓度为#.
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2'3的质粒456789:低温下电穿孔转化该细菌,电场强度和脉冲时间分别为;%&'()和#;)/8>0#.
8个转化子'!
2-=,大大高于其它转化方法.
参考文献〔#〕杜权,贺福初,薛社普@:3#A71BC菌株电穿孔转化方案的条件优化[!
]/军事医学科学院院刊,#DD;,""($):#E!
/〔$〕FGH2*I,CB)6HHJ@J1C(KLM(NMC1O)COM6KCO2CHCKL6H;9/〔E〕6P,PQCH*,:M6GF,&/01@*QCN6(KGL,##(E):#DE/〔9〕S6B)T,5GL;/〔>〕PQCH2Y,Z6H(MHG&,SMLLCHS@*L6H;"&(##):DD.
/〔!
〕陈乃用@电穿孔法在细菌质粒转化中的应用[!
]@微生物学通报,#DD#,#'($):D8/〔8〕*C%1CJ,=/〔;〕丁志山,蒋承俊,吴根福@电穿孔法转化完整酵母的研究[!
]@生物技术,#DD>,)(9):D/*+,-.
-/0,-12134567,81+180,-12981,171531880-2;.
)=>,807,J1C(KLG4GL6KMGHW6<4CLNGL)COKGKL6H本发明采用基因工程手段制备出改进的新型改进型重组人白介素##,经证明与天然人白介素##有相同的体内外生物功能,可望成为治疗血小板减少症的药物.
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9#药物生物技术第;卷第E期