宋慕波,帅良,段振华,等.荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达[J].华南农业大学学报,2019,40(1):77-83.

SONGMubo,SHUAILiang,DUANZhenhua,etal.
Cloningandexpressionofphenylalanineammonia-lyase(PAL)geneinChinesewaterchestnut[J].
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2019,40(1):77-83.
荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达宋慕波1,2,帅良1,2,段振华1,2,覃丽1,李淋1,陈振林1,方方1,2(1贺州学院食品科学与工程技术研究院,广西贺州542899;2广西果蔬保鲜和深加工人才小高地,广西贺州542899)摘要:【目的】克隆荸荠Eleocharistuberosa苯丙氨酸解氨酶基因(PAL),分析其序列特征及其在荸荠不同组织中和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况,为揭示鲜切荸荠黄化机理提供理论依据.
【方法】通过RT-PCR和RACE技术从荸荠中克隆PAL基因的cDNA全长,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用荧光定量PCR技术分析PAL基因在荸荠不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达情况.
【结果】克隆得到荸荠PAL基因全长cDNA,将其命名为CwPAL,该序列长度为2485bp,含有1个2142bp的完整开放阅读框,共编码713个氨基酸.
CwPAL蛋白分子式为C3437H5514N944O1058S34,相对分子质量为78079,等电点为5.
97,原子总数为10987个.
CwPAL包含PAL-HAL和PLN02457结构域及典型的PAL酶活性中心序列(GTITASGDLVPLSYIAG).
CwPAL的二级结构以α–螺旋为主,其三维结构模型呈典型的"海马状"结构.
系统进化分析表明,CwPAL与菠萝Ananascomosus和海枣Phoenixdactylifera的PAL蛋白亲缘关系较近.
荧光定量PCR分析表明,CwPAL基因在荸荠皮中的表达量最高,鲜切荸荠贮藏过程中CwPAL基因表达量快速上升,水杨酸处理显著抑制了CwPAL基因的表达.
【结论】CwPAL属于典型的苯丙氨酸解氨酶家族,该基因可能通过调控苯丙烷代谢从而影响鲜切荸荠的黄化.
关键词:荸荠;苯丙氨酸解氨酶;基因克隆;表达分析;黄化;水杨酸中图分类号:S645.
3;TS255.
36文献标志码:A文章编号:1001-411X(2019)01-0077-07Cloningandexpressionofphenylalanineammonia-lyase(PAL)geneinChinesewaterchestnutSONGMubo1,2,SHUAILiang1,2,DUANZhenhua1,2,QINLi1,LILin1,CHENZhenlin1,FANGFang1,2(1InstituteofFoodScienceandEngineeringTechnology,HezhouUniversity,Hezhou542899,China;2GuangxiTalentHighlandofPreservationandDeepProcessingResearchinFruitandVegetables,Hezhou542899,China)Abstract:【Objective】Toclonefull-lengthcDNAofphenylalaninammonia-lyase(PAL)inChinesewaterchestnut(Eleocharistuberosa),investigateitssequencecharacteristics,analyzeitsexpressionsindifferentorgansandduringstorageoffresh-cutE.
tuberosa,andprovidetheoreticalreferencesforrevealingthemechanismofE.
tuberosaetiolation.
【Method】ThefullsequenceofPALgenewasclonedfromE.
tuberosabyRT-PCRandRACEtechniques.
BioinformaticsmethodwasusedtoanalyzethecDNAsequenceandtheencodedaminoacidsequence.
Real-timePCRwasusedtoanalyzetheexpressionprofileofPALgeneindifferentorgansandinfresh-cutE.
tuberosaduringstorage.
【Result】Thefull-lengthcDNAofPALgeneinE.
tuberosawasclonedandnamedCwPAL.
Thesequenceconsistsof2485bpwithanintactopenreadingframeof2142bp,encodingapolypeptideof713aminoacids.
TheformulaofCwPALproteinis收稿日期:2018–04–09网络首发时间:2018–12–2814:38:00网络首发地址:http://kns.
cnki.
net/kcms/detail/44.
1110.
s.
20181227.
1104.
006.
html作者简介:宋慕波(1986—),男,副研究员,博士,E-mail:songmubo1@163.
com;通信作者:方方(1985—),女,讲师,博士,E-mail:Hellenff@163.
com基金项目:广西自然科学基金(2017GXNSFAA198082,2015GXNSFBA139082);广西特聘专家专项经费资助(厅发[2016]21号)华南农业大学学报JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity2019,40(1):77-83DOI:10.
7671/j.
issn.
1001-411X.
201804020C3437H5514N944O1058S34,therelativemolecularweightis78079,pIis5.
97,andthetotalnumberofatomsis10987.
CwPALproteincontainstwofunctionaldomainsincludingPAL-HALandPLN02457,andthetypicalPALactivesitesequence(GTITASGDLVPLSYIAG).
ThemainstructuralelementinCwPALsecondarystructureisα-Helix,thethree-dimensionstructureofCwPALproteinshowsatypical"seahorse"shape.
ThephylogeneticanalysisshowedthatCwPALwasverycloselyrelatedtoPALproteinsofAnanascomosusandPhoenixdactylifera.
TheQ-PCRanalysisshowedthattheexpressionlevelofCwPALgenewasthehighestinpeel,CwPALgeneexpressionquicklyincreasedduringstorageoffresh-cutE.
tuberosa,andsalicylicacidtreatmentsignificantlyinhibitedCwPALgeneexpression.
【Conclusion】TheclonedCwPALgeneisatypicalmemberofPALfamily,andCwPALgenemayaffectE.
tuberosaetiolationbyregulatingthephenylpropanoidpathway.
Keywords:Eleocharistuberosa;phenylalanineammonia-lyase;genecloning;expressionanalysis;etiolation;salicylicacid荸荠Eleocharistuberosa别名马蹄、地栗、乌芋等,是非常受欢迎的莎草科水生蔬菜[1].
荸荠的肉质球茎去皮后可食用,肉质清甜,口感爽脆.
荸荠皮比较坚硬,洗净和削皮不易,因此卫生、方便的鲜切荸荠产品更易被消费者接受.
然而,荸荠去皮后出现的黄化现象,严重影响了鲜切荸荠的品质[2].
鲜切荸荠表面黄化与传统的果蔬褐变不同,黄色物质主要由苯丙烷代谢中间产物柚皮素和圣草酚组成,而不是醌类物质[3].
因此,控制鲜切荸荠贮藏过程中的苯丙烷代谢是控制其黄化的关键.
苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase,PAL)位于苯丙烷代谢途径的入口,是该代谢途径重要的限速酶,与植物组织中黄酮类物质的积累密切相关[4].
鉴于此,从荸荠中克隆PAL基因,分析其结构特征、功能及其在荸荠不同组织中的表达特征,对研究鲜切荸荠黄化机制有重要意义.
PAL最早在大麦幼苗中被分离得到[5].
随后的大量研究表明PAL活性的提高与果蔬黄酮类物质积累密切相关,同时参与了对干旱、强光、冷害、病害、机械损伤等逆境的响应,在水杨酸和乙烯信号转导途径中受到复杂的调控[6-7].
果蔬机械损伤后,受伤组织的PAL活性会迅速升高,促进伤口的木质化及愈合[8-9].
机械伤诱导PAL酶活力很可能是通过调控其编码基因合成新酶实现的.
伤害信号可诱导生菜PAL基因表达,增加酶的合成量,导致其酶活力的提高,从而导致酚类物质的积累[10].
Campos等[11]研究发现,机械伤可诱导莴苣PAL1基因表达上调,热处理抑制PAL活性是通过抑制其编码基因的表达实现的,认为机械伤信号通过转录水平的调控来影响PAL活性.
在组织培养过程中,切割伤害也可诱导PAL基因表达,从而导致叶片外植体的黄化[12-13].
因此,鲜切荸荠黄化可能与机械伤诱导对PAL基因转录水平的调控密切相关.
目前,PAL基因已经从龙眼[14]、水稻[15]、甘蔗[16]、黄瓜[17]和南瓜[18]等植物中克隆得到,并对其表达特性进行了分析,但尚未在荸荠中克隆得到PAL基因.
PAL是苯丙烷代谢的限速酶,在鲜切荸荠黄化过程中可能起到关键作用,但荸荠中尚未见PAL基因的相关研究报道.
本研究通过克隆荸荠PAL基因全长,并对其蛋白结构和功能进行生物信息学预测分析,运用荧光定量PCR分析其在荸荠不同组织及其在鲜切荸荠贮藏过程中的表达特征,为后续该基因的功能机制研究和鲜切荸荠黄化机理研究提供理论依据.
1材料与方法1.
1试验材料荸荠在2016年12月10日购于广西壮族自治区贺州市八步区农产品市场.
原料运回实验室经清洗,挑选大小均一和无机械损伤、无病虫害的果实,去皮后横切成厚度为0.
5cm的圆片,然后用10g·L–1次氯酸钠溶液杀菌10min,样品分成2组,对照组在清水中浸泡10min,处理组在10mmol·L–1水杨酸水溶液中浸泡10min,样品晾干后置于塑料托盘中用0.
02mm聚乙烯保鲜膜包装,于10℃条件下贮藏.
在贮藏0(处理前)、2、4、6、8、10、12d后分别取样,将样品放入–80℃超低温冰箱保存,用于后续基因克隆和表达分析.
另取未做处理的健康荸荠植株的根、叶、皮和肉各组织样品用液氮速冻,置于–80℃条件下保存备用.
1.
2试验方法1.
2.
1荸荠总RNA提取采用华越洋植物RNA提取试剂盒提取荸荠果肉总RNA,具体方法按照说明书进行.
得到RNA后通过10g·L–1琼脂糖凝胶电泳和K5600超微量分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司)测定其纯度和含量,RNA样品保存于78华南农业大学学报(http://xuebao.
scau.
edu.
cn/zr)第40卷–80℃超低温冰箱中,用于反转录等后续试验.
1.
2.
2荸荠果肉PAL基因克隆3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA的合成具体操作按照SMARTerRACE5′/3′KitRACE(TaKaRa)试剂盒说明书进行.
根据之前从荸荠转录组数据中得到的PAL基因片段设计3′RACE引物(5′-AGTTAATGACAATCCTCTGATCGATG-3′)和5′RACE引物(5′-TTGTAGAAATCATTGACAAGCTCAGA-3′).
PCR反应程序为:94℃预变性1.
5min;94℃变性30s,68℃退火45s,72℃延伸2.
5min,25个循环;72℃延伸10min,产物于4℃条件下保存.
PCR产物经回收、连接(pRACEvector)、转化(Stellar感受态细胞)、重组子筛选及菌液PCR鉴定后,测序委托华大基因科技股份有限公司进行.
测序结果应用DNAMAN软件和NCBI在线工具对荸荠PAL基因进行序列基本结构和特征分析.
根据拼接得到的基因全长核苷酸序列设计全长PAL基因正向引物5′-CATCGCCGCTAAATTAGTTTACAA-3′,反向引物5′-AAACAAGAAAGGAATTTATTCTA-3′.
以反转录cDNA为模板,进行PCR扩增,经检测和测序获得全长序列.
1.
2.
3荸荠PAL基因生物信息学分析采用NCBI中的BLASTn和BLASTp程序进行核苷酸及氨基酸序列的比对;采用NCBIORFfinder程序寻找开放阅读框;利用ProtParamTool分析蛋白质理化性质;采用NCBI的ConservedDomains和BLASTp分析氨基酸序列的保守区域;采用TargetP1.
1Server进行氨基酸序列导肽的分析;采用SignalP4.
0Server预测蛋白的信号肽;采用TMHMMServerv.
2.
0分析氨基酸跨膜结构域;采用PostPrediction和WOLFPSORT进行蛋白亚细胞定位信号预测;ProtScale以Hphob.
/Kyte&Doolittle算法进行亲疏水性预测;使用NetPhos2.
0Server预测蛋白质序列的磷酸化位点;使用MotifScan软件分析蛋白质功能结构域;使用ExPaSy-SOPMA软件分析蛋白质的二级结构;使用ClustalX软件进行多重比对分析;采用Mega5软件进行系统进化树构建;采用SWISS-MODEL预测蛋白质三级结构.
1.
2.
4荸荠PAL基因的表达分析根据获得的荸荠PAL基因序列利用Primer5.
0设计Q-PCR正向引物5′-AGTTAATGACAATCCTCTGATCGATG-3′和Q-PCR反向引物5′-TTGTAGAAATCATTGACAAGCTCAGA-3′.
采用PrimeScriptTMRTreagentKit去除基因组和反转录试剂盒(TaKaRa)合成各样品Q-PCR的模板cDNA,操作方法见说明书.
参考TaKaRa公司的SYBRGreenqPCRMasterMix说明书进行Real-timePCR扩增.
以18srRNA(登录号:MG742686)为内参.
利用2–Ct方法计算鲜切荸荠PAL基因在贮藏过程中的相对表达量.
各样品的基因相对表达量均为3次生物重复的平均值.
1.
2.
5数据分析利用SPSS23软件Duncan's法对数据进行差异显著性分析,利用Origin8.
5.
1进行图表制作.
2结果与分析2.
1荸荠PAL基因全长cDNA的克隆在荸荠转录组数据库中筛选得到与其他植物PAL基因相似性较高的荸荠序列片段642bp.
利用NCBI的BLASTn进行比对,结果显示,该序列与其他植物PAL基因序列的相似度较高,其中与芭蕉Musaacuminata(KF594428.
1)的相似度最高,为81%.
因此,初步判断该序列为荸荠PAL基因的片段.
根据上述片段设计3′RACE和5′RACE引物,以荸荠果肉总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR.
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得了3′RACE产物约1400bp(图1A),5′RACE产物约1600bp(图1B).
将片段回收并进行测序分析发现3′端序列长度为1224bp,包含了3′非翻译区(3′UTR)及polyA结构;5′端序列长度为1429bp包含了5′非翻译区(5′UTR).
将3′和5′端序列拼接后得到基因全长序列,在拼接序列的5′端和3′端设计引物扩增PAL的全长序列(图1C),测序结果显示,该序列与拼接结果一致.
利用ORFFinder软件对克隆得到的全长序列进行分析.
该序列长度为2485bp,含有1个2142bpM:DL2000DNAmarker;1:3′-RACE产物;2:5′-RACE产物;3:全长序列M:DL2000DNAmarker;1:3′-RACEproduct;2:5′-RACEproduct;3:full-lengthproduct图1荸荠果肉CwPAL基因序列扩增产物的电泳图Fig.
1ElectrophoresisofamplifiedproductsofCwPALgenesequencefromEleocharistuberosapulp第1期宋慕波,等:荸荠苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和表达79的最大开放阅读框(ORF)、131bp的5′UTR区、184bp的3′UTR区及28bp的polyA结构.
序列的起始密码子ATG位于第132~134位,终止密码子为TAG,其终止密码子之后有保守序列AATAAA,为链的切断和多聚腺苷酸化提供信号.
将该基因编码区全长序列在NCBI上进行比对,发现该序列与海枣Phoenixdactylifera(XM_008787032.
2,XM_008806995.
2)、芭蕉M.
acuminata(EU856393.
1)和菠萝Ananascomosus(XM_020257858.
1)的PAL基因相似度较高,均大于73%.
因此,可证明已经克隆获得荸荠PAL基因,将此基因命名为CwPAL,在GenBank上的登录号为MG719236.
2.
2CwPAL蛋白的生物信息学分析2.
2.
1CwPAL蛋白的理化性质CwPAL基因编码的蛋白由713个氨基酸组成.
利用ProtParam在线软件预测CwPAL蛋白的理论等电点为5.
97,相对分子量为78079,总原子数为10987个,分子式为C3437H5514N944O1058S34.
组成蛋白质所用的氨基酸占比较高的为亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)和谷氨酸(Glu),分别占比为10.
4%、8.
1%、7.
9%和7.
6%.
蛋白的亲水性平均系数为–0.
187,脂溶指数为89.
19.
2.
2.
2CwPAL蛋白的功能结构域CwPAL基因编码氨基酸序列包含PLN02457、PAL-HAL结构域,属于Lyase_I_Like超家族.
CwPAL蛋白含有苯丙氨酸和组氨酸解氨酶的酶活中心,位于195~211aa,序列为GTITASGDLVPLSYIAG.
此外,还含有9个酪蛋白激酶Ⅱ识别位点,位于11~14、18~21、35~38、82~85、140~143、377~380、600~603、417~620和677~680aa,10个蛋白激酶C识别位点位于18~20、51~53、82~84、115~117、140~142、214~216、302~304、494~496、532~534和633~635aa,12个N–豆蔻酰化位点位于106~111、136~141、195~200、211~216、239~244、258~263、310~315、395~400、435~440、454~459、470~475和491~496aa,以及2个糖基化位点位于257~260和439~442aa.
利用TMHMMServer2.
0预测显示CwPAL没有跨膜区域,为非跨膜蛋白.
2.
2.
3CwPAL蛋白的磷酸化位点蛋白质的磷酸化是一种重要的蛋白翻译后修饰方式.
利用NetPhos软件预测CwPAL蛋白的磷酸化位点.
结果显示,CwPAL蛋白以丝氨酸磷酸化占主导地位,共有25个丝氨酸(Ser)、12个苏氨酸(Thr)和7个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点,其中S18预测得分最高,为0.
996.
2.
2.
4CwPAL蛋白导肽、信号肽及亚细胞定位预测结果显示,CwPAL属于非分泌蛋白,其中不含有叶绿体转运肽、线粒体目标肽及分泌途径信号肽.
利用WOLFPSORT和PostPrediction对CwPAL进行亚细胞定位预测,发现CwPAL蛋白定位于内质网和细胞质的可能性最大.
2.
2.
5CwPAL蛋白的二级和三级结构预测CwPAL蛋白的二级结构中最主要的结构是α–螺旋占48.
11%,其分散于整个蛋白质中.
其他结构中无规则卷曲占28.
75%,延伸链占13.
46%,β–折叠占9.
68%.
利用Swiss-model对CwPAL蛋白的三级结构进行预测,CwPAL蛋白三级结构由软件自动匹配以香芹Petroselinumcrispum的PcPAL蛋白(PDBNo.
1W27.
1)为参照进行构建,与参考模版相似性为80.
65%.
CwPAL蛋白的三级结构具有典型的"海马状"结构,包含MIOdomain、Coredomain和Shieldingdomain3个结构域.
2.
2.
6CwPAL蛋白的多重比对和系统进化树的构建通过与其他植物CwPAL蛋白比对发现不同PAL蛋白功能区域的氨基酸序列较为保守,酶活性中心位点序列高度保守,均为GTITASGDLVPL-SYIAG.
可见苯丙氨酸解氨酶作为植物苯丙烷类化合物生物合成途径中的限速酶,在进化的过程中保持了较高的遗传稳定性.
为了了解CwPAL蛋白与其他植物PAL蛋白的进化关系,用ClastalX软件进行氨基酸序列比对,采用MEGA5软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树(图2).
结果表明,CwPAL蛋白与海枣(XP_008805217.
1)和菠萝(OAY76951.
1)的PAL蛋白亲缘关系较近.
2.
3CwPAL基因在荸荠不同组织中的表达采用荧光定量PCR技术分析CwPAL基因在根、叶、荸荠皮和荸荠肉中的表达特征.
结果表明,CwPAL基因在4个组织中均有表达,但表达量有显著差异(Pfferentlowercaselettersonbarsindicatedsignifficantdifference(Pfficantlydifferentfromcontrolatthesamestoragetime(Pffectsofchitosancoatingon[2]shelflifeandqualityoffresh-cutChinesewaterchestnut[J].
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