移植昆明山海棠提取物预防急性移植物抗宿主病的实验研究（医疗卫生论文）

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《昆明山海棠提取物预防急性移植物抗宿主病的实验研究》

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文档信息

昆明山海棠提取物预防急性移植物抗宿主病的实

验研究

目录

1材料和方法

2结果

A组:对照组;B组:CsA组;C组:THH组;D组:CsA+TH. . .

3讨论

参考文献

正文

作者王春晴李振宇*徐开林作者单位 (徐州医学院移植免疫实验室江苏徐州221002)

摘要 目的观察昆明山海棠(THH)提取物在急性移植物抗宿主病(aGV HD)中的作用及其可能的作用机制。方法建立aG VHD模型B ALB/c受鼠清髓性预处理后分别用生理盐水、环孢素A(C s A) 、 THH及C sA+THH混合物灌胃。观察移植后受鼠aGVHD、生存时间、 CD4+/C D8+比率、 CD4+CD25+ T细胞比率及脾细胞Foxp3 mRNA水平。结果生理盐水组出现典型aG VHD 20天内全部死亡。其余3组aGVHD临床、病理表现及生存时间均改善组间无差异;CD4+/CD8+比率、受鼠CD4+CD25+

T细胞比率及脾Foxp3 mRNA表达较生理盐水组升高 以联用组明显。结论THH可减轻小鼠aGV HD延长其生存时间。机制可能与增加CD4+CD25+ T细胞比率上调Foxp3 mRNA表达调节CD4+/CD8+比率有关。 THH和小剂量C sA联合有协同作用

关键字 昆明山海棠;移植物抗宿主病;T细胞亚群;CD4+CD25+T细胞;Foxp3mRNA

An experimental study of Tripterygium hypoglaucum Hutch extract in the prophylaxis of acute graft-veus-host disease in mice

WANG Chunqing LI Zhenyu* XU Kail in

(Lab of Traplant Immunology Xuzhou Medical CollegeXuzhou Jiangsu 221002 China)

Abastract Objective To observe the prophylactic effect of Tripterygium hypoglaucum Hutch (THH) extract on acute graft-veus-host disease (aGVHD) in mice following hematopoietic stem cell traplantation (HSCT) . Methods 1×108bone marrow cells mixed with 1×108 spleen cells from C57BL/6mice were traplanted into the death irradiated BABL/c mice to establish the aGVHD model. Recipient mice were treated with %

sodium chloride (group A)  ciclosporin A (group B)  THH extract (group C) and THH combined with CsA (group D) . The sig of clinical aGVHD histological evidence of aGVHD were assessed by survival CD4+ and CD8+ T cell subsets

CD4+CD25+ subpopulation and the expression of Foxp3 in splenocytes after HSCT. Results The medium survival time for group A was 9 days and within 20 days after HSCT all mice died while that in groups B C and D was over 30 dayswhich was significantly longer than in group A (P<) . Group A mice exhibited significant clinical symptoms and histological sig of aGVHD whereas those of groups B C and D showed only mild clinical and histological sig of aGVHD. The ratio of CD4+ T cells/CD8+ T cells percentage of CD4+CD25+ T cells and the level of Foxp3 in the spleen in groups B C and D were higher than group A and group D showed the maximum THH can prevent aGVHD after allogeneic bone marrow traplantation in mice. The possible mechanism is involved in the upregulation of Foxp3 expression to induce CD4+CD25+regulatory T cells and the regulation of the CD4+ and CD8+ T cells. THH combined with CsA showed synergic effect in the prevention of aGVHD。

Key words: Tripterygium hypoglaucum Hutch; graft-veus-host disease; T cell subsets; CD4+CD25+T cell; Foxp3 mRNA

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell traplantat ion al lo-HSCT)是血液系统恶性疾病的治愈手段之一移植物抗宿主病(graft-veus-host disease GVHD)是影响移植结果的主要障碍之一。预防G VHD常用的环孢素A(C s A) 、他克莫司等免疫抑制剂不良反应大、费用高。昆明山海棠(T HH)是一种中药免疫抑制剂属于卫矛科雷公藤属植物 已应用于结缔组织病及自身免疫性疾病的治疗具有肾上腺皮质激素类疗效但不良反应小停药后无反跳和戒断症状且价格低廉。本研究将其用于小鼠急性移植物抗宿主病(acute graft-veus-host disease aGVHD)模型并测定移植后受鼠体内T细胞亚群、 CD4+CD25+T细胞及Foxp3 mRNA表达的变化 以评价其对G VHD的预防效果及可能的作用机制。

1材料和方法

实验动物受鼠为BALB/c小鼠(H-2Kd) 雌性;供鼠为C57BL/6小鼠(H-2Kb) 雄性均为清洁级;鼠龄68周体重1822 g;购自中国科学院上海实验动物中心合格证号 SC XK(沪) 按二级动物标准运输、饲养。

药物和试剂CsA(新赛斯平软胶囊杭州中美华东制药有限公司生产)溶于无菌生理盐水配制浓度为1 g/L。昆明山海棠片( g广东博罗先锋药业集团有限公司) 溶于无菌生理盐水配制浓度分别为40、

20、 10 g/L。小鼠抗H-2Kb单抗(BD公司) ;异硫氰酸荧光素-CD3(FITC-CD3) 、藻红蛋白-CD4(PE-CD4) 、藻红蛋白-CD8(PE-CD8) 、异硫氰酸荧光素-CD25(FITC-CD25)单抗(eBioscience公司)

a GVHD模型的建立参照文献[1]方法无菌条件下制备骨髓细胞和脾细胞悬液细胞密度均为1×1011/L。受鼠移植前行全身照射(TBI) 照射源为60Co γ射线总剂量Gy剂量率Gy/min。照射后4 h内尾静脉输入含2×107个骨髓细胞和2×107个脾淋巴细胞的混合细胞悬液观察G VHD发生情况。

实验分组BALB/c受鼠随机分4组每组20只每组受鼠均从移植前1天至移植后30天灌胃给药。 A组生理盐水ml/d B组CsA 10mg/(kg ·d)  C组THH 400 mg/(kg ·d)  D组THH 100mg/(kg ·d)+CsA 5 mg/(kg· d)

主要观察和检测指标

植入情况采用流式细胞术检测移植后10 d、 30 d受鼠骨髓细胞上异基因H-2Kb百分率。

观察指标观察各组受鼠一般状况(如弓背、翘毛、腹泻等) 、体重变化和生存时间(观察期30天) 小鼠濒死前取其四肢皮肤、肝和小肠行病理检查。

检测指标移植后5、 10、 15、 20、 30天检测受鼠外周血

CD4+/CD8+比率及CD4+CD25+T细胞比率实时荧光定量PCR方法检测

5、 10、 15、 20、 30天受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA的表达水平。 Foxp3上、下游引物分别为5′ -CACAACATGGACTACTTCAAGTAC CA-3′ 和5′ -GGAATAGGCTACC CGGTAG-3′ 荧光探针为5′ -

AATATGCGACCCCCTTTCACCTATGCC-3′  5′荧光素:FAM 3′淬灭

剂:TAMRA PCR产物75 bp。在7300型实时荧光定量PCR仪进行反应反应条件:93℃2 min然后93℃1 min 55℃1 min共40个循环;采用外标法标准品同前条件反应后制得标准曲线。 由于每个反应管的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数即Ct值与起始模板拷贝数的对数成反比的线性关系 因此可以通过Ct值来计算log( Foxp3 mRNA) 反映受鼠脾细胞内Foxp3 mRNA表达量的变化。

统计学处理数据以±s表示用Stata软件处理组间比较采用单因素方差分析生存时间比较采用Log-rank检验等级资料采用秩和检验并绘制Kap lan-Me i er生存曲线。

2结果

植入结果本实验测得正常BALB/c小鼠白细胞计数为

(±)×109/L。移植后3霜各组白细胞总数降至最低点;移植后5天渐有升高趋势移植后1520天白细胞总数基本恢复到6×109/L以上。 +10天各组受鼠骨髓细胞表面H-2Kb分子百分率均>95% +30天B、 C、 D组受鼠骨髓细胞表面H-2 Kb分子百分率分别为(±)%、 (±)%和(±)

各实验组受鼠移植后生存时间比较A组受鼠移植后中位生存时间为9天 B、 C、 D组移植后中位生存时间均>30天(30天时的存活率分别为80%、 75%和85%) 。与A组相比 B、 C、 D组受鼠移植后生存时间明显延长(P) (图1)

图1实验组受鼠移植后Kaplan-Mei er生存曲线比较

A组:对照组;B组:CsA组;C组:THH组;D组:C sA+THH联合组移植后各实验组受鼠aGV HD临床表现、病理组织学检查及嵌合体检测结果A组受鼠全部在移植后514天出现典型的翘毛、 弓背、腹泻、体重减轻等a GVHD表现 aGV HD病理表现为ⅡⅢ级①皮肤表皮层厚薄不均真皮层有不同程度的血管扩张充血、水肿、炎性细胞浸润;②肝胆小管上皮细胞肿胀、变性、胞核固缩汇管区有充血、大量淋巴细胞和炎症细胞浸润;③小肠小肠黏膜充血、水肿 固有层和肌层有淋巴细胞浸润局部肠黏膜细胞坏死;20天内均死于a GVH D。 B、 C、 D组a GVHD出现时间较A组均延迟 aG VHD发生率分别为30%、 40%、 30%临床及病理表现较轻 以D组最轻。

移植后各组受鼠外周血CD4+/CD8+比率比较表1显示 B、 C、 D组CD4+/CD8+比率均较A组升高(本实验测得正常BALB/c小鼠CD4+/CD8+比率为±)  D组升高最显著(与B组、 C组比较均P<) 。 表1实验组移植后各时间点受鼠外周血CD4+/CD8+比率比较与A组比较 *P<;与B组比较△P<;与C组比较▲P<

移植后各组受鼠外周血CD4+CD25+ T细胞比率比较见图2。移植后第10天时B组、 C组和D组CD4+CD25+ T细胞比率开始增加与A 组比较差异有统计学意义(P) ;第15天时B组、 C组和D组

CD4+CD25+ T细胞比率明显增加与对照组比较差异有统计学意义(P<) 其中D组升高最明显其后依次为C组、 B组;第20天时开始下降 D组下降较慢与B组、 C组比较差异有统计学意义(P<) ;第30天时D组CD4+CD25+ T细胞比率仍维持较高水平高于B组、 C组(P<)