细胞苏丹一村镇遭遇武装分子袭击超60人死亡

7一≯j第l0卷第3期.
1995年9月中国病毒学V1ROLOGICASlNICA07/Vo1.
10,No.
3Scp.
.
1995人单核细胞系U.
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和T细胞系HSBz细胞的HSV一1感染季晓辉姚拽/李焕娣周瑶玺·7——/一V7f(南京医科大学微生物学教研室.
南京210029)2.
厂/,,^厂1提要用HSV一1接种人单棱细胞传代株U",和T淋巴细胞传代株HSBz细胞,通过对病毒漓度、细胞增殖与病变、病毒抗原表达及病毒DNA的动态观察.
研究了HSV一1感染两种细胞的特点结果发现接种病毒后,Ugsz细胞仅允黼毒短时间低漓度复制,培养上清中病毒漓度在l2天内降至测出水平.
细胞经过l~2周后增殖受抑、死亡增多,然后叉逐渐恢复I用LPS持续辋澉则能提高病毒感染漓凄,延长感染时间.
形成短期j持续感染.
HSBz细胞允许病毒复制至较高漓度,呈现急性十分清楚,可能涉及神经途径或血循环途径,而在血循环途径中最可能涉及的是单核细胞和淋巴细胞研究HSV1体外感染单核细胞和淋巴细胞的特点,有助于阐明HSV一1体内播散的途径我们在本室过去B淋巴细胞系HSV感染研究的基础上,通过采用人单核细胞传代株U和人T细胞传代株HSB.
细胞,进一步研究了HSV一1感染单核细胞和T淋巴细胞的特点.
材料与方法1细胞培养Uw和HSBz细胞引自第四军医大学免疫室,用l0新生牛血清的RpMI1640营养蔽(各氪酰胺2mmol/L.
青、链霉素各|00U/m1).
于37℃5%COz传代培养.
2病毒HSV一1SM"株.
在原代乳兔肾(PRK)细胞单层中传代,HSV一1感染爰其检查3·lu删HSB:细胞的感染以HSV—l接种生长良好、形态典型、未经或经含LPS(S~ma)2g/ml/PHA(广州医药工业研究所)20g/m1的营养液培养3天的U.
/HSB细胞,MoI一1TCID~/细胞.
37"C吸附t小时,离心,Hank液洗{条2次,除去辨离病毒.
甩与原先相同的营养液重悬细胞,调整浓度至105午细胞/ml.
每瓶5m1分瓶培养.
每4天换蔽.
定时在换液前取2ml混匀悬液待检,再补人2ml营养蔽恢复原体积.
3·2细胞计数I漓待检样车与l漓2台酚兰染漉混合,显微镜下计数细胞浓度和死细胞(染成蓝色)比倒.
3·3细胞增殖情况的检查取0.
1mi样本.
以MTT比色分析法测定Ⅲ.
3·4病毒漪度将剩余样牟离心,取卜清~--7oc冻存备作病毒滴定滴定采用微量PRK单层细胞病变法,车立于1994年7I6H收到.
10片18日修回维普资讯http://www.
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com210中国病毒学第10卷50螈驵织细胞培养感染量(TC1D~/m1)表示滴度.
计算按Reed—Mucnch方法.
35病毒抗原检测将剩采样本沉淀细胞以PBS洗涤2次、涂片、冷丙酮固定10分钟.
采用f吲妻荧光试验(IFA)检测细胞中病毒抗原一抗为免抗HSV一1lgG,本室自制;二抗为荧光羊抗免IgG(军事医学科学院)按常规操作最后加0.
I伊文思兰复染1分钟.
荧光显赣镜观察.
明亮的黄绿色细胞为阳性,红色细胞为阴性.
每张复片计数200十细胞.
计算平均荧光阳性细胞百分率.
3.
6病毒DNA检}昊j采用多聚酶链匣应(PCR)技术.
弓『物选自HSV一1基区UL42区,由中科院上博生物工程研究中心台成.
上F游序列为—ACGACGACGTCCGACGGCGA一和~-GTGCTGGTGCTGGACGACAC一3,.
其特异性扩增片段为278bpC.
取l十待检样本经PBS洗涤的沉淀细胞以细胞裂解液加蛋白酶K法m制备待检DNA模扳.
DNA扩增采用上海复华公司PCR试荆盒.
按说明操作.
待检DNA模扳加20p.
1.
技术参数:预处理92"C10分钟、55~C5分钟,变性92"C1分钟,退火55"C1分钟,延伸72"C1.
5分钟,循环3O次,末次延伸10分钟.
产物分析采用8聚丙烯酰胺凝胺电泳,紫外检{黉I仪上观察,参照分子量Marker驶阴、阳性对照.
在预定的278bp处出现特异牲扩增条带者为阳性以上每组每项试验均哉双份,取均值.
结果l病毒滴度的动态变化U.
a细胞接种病毒后培养上清中病毒滴度第4天达峰值(10),随即迅速下降,l2天内降至测不出水甲;自接种前3天始以LPS201ug/ml处理的细胞,其病毒滴度增高10倍以上,并在接种后2—4周形成持续感染,然后病毒滴度逐步降至测不出水平HSB细胞接种病毒后在第4天病毒滴度也达峰值(1O-~.
s),然后维持于10-2~10-3水平约2周,此后迅速降至测不出水平;白接种前3天始以PHA2001ug/ml处理的细胞,其病毒滴度反而较低,仍在接种2周后迅速降至测不出水平,不能形成持续感染.
见图1.
釜:二等l譬孑lJL￡#图1HSV—I感染的细胞培养中病毒浦庄变化Changcsoftheviruslitcrmthcculluredcells{m%clcdwithHSV维普资讯http://www.
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com第3期季晓辉等:人单棱细胞系UⅢ和T细胞系HSB:细眶的Hsv一1感染2112细胞表达病毒抗原的变化病毒抗原阳性的U细胞百分率也于接种后第4天达峰值(47.
6),然后迅速下降,2同后降至10以F,3周后消失;经LPS处理的U细胞病毒抗原阳性百分率显著高于未经处理的细胞,自峰值(62)F降缓慢,接种后8~4周仍能维持在1O左右.
HSBz细胞病毒抗原阳性百分率亦于接种后第4天达峰值,无论是否经PHA20s/m1处理,均显著高于U957细胞,并能在超过4O的较高水平维持2周以上,而后逐新降低,至接种3周后基本消失,见图2801《e0Ii爵后天数图2HSV-1妊f染孳田胞中病孽皖原表达的变化Fig2ChangesofvirusantinexpressioninthecellsinfectodwitlaHSV13病毒DNA在细胞内的存留时间U.
细胞仅在接种HSV—l后2周内可用PCR法测出细胞内病毒DNA;但在LPS处理的细胞中病毒DNA一直到接种后28天均可测出,至接种后32天才转阴.
而HSB:细胞无论是否经PHA处理,病毒DNA在接种后I—t8天内均可渊出,以后则不能渊出.
PCR产物电泳图谱见图3.
4病毒感染对细胞的毒性作用在感染全程中U.
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和HSB.
细胞均未出现细胞肿胀、变圆、折光性增强及形成多核巨细胞等HSV一1在皮类成纤维类细胞上所诱生的典型细胞病变形态学改变.
但MTT试验结果(见表)和台酚兰染色后细胞计数结果显示,U细胞在感染后1—2周增殖受抑,出现细胞死亡增多、细胞总数r降现象,但第2周后细胞增殖逐步恢复,死细胞比例下降,细胞总数|:升,感染32天后已逐步恢复到接近来感染的对照细胞水平;LPS处理的u细胞增殖受抑、细胞死亡增多及细胞总教降更显著,但摄终还是能逐步恢复,只是恢复得较慢.
而HSB细胞无论是否用PHA处理,其增殖始终受抑,细胞大量死亡直至接近100,逐步减少至1扩细胞/mI,始终能恢复一:l_2^l!
jRL_】uH:;_¨Jr'静套g蕲医匿d】辑球维普资讯http://www.
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com2l2中国病毒学第l0卷图3PCR法检滴病毒DNA的特异性扩增产物电濂照片3Ell~Ctropbor,misan~ysisofthePCRproductsofv~rLLSDNA【舢e:nhcontrol:PISV1i.
~~tmlPRKccUs—Lane2:m0kcu1arlmarker.
LmBc3.
6and8Ucelt~trP~tedwithLPs20~g/m1.
Lane4and7sHSIB2CeLlstr+atcdwithPHA2O~Jg/m1.
Lanc5UCeLlswithnosDcda1treatm+nt表不同培养时间MTT试验.
值-Tnb0D570札ucofMTTlc蚶md~+crcnttime讨论结果显示,u细胞对HSV一1感染具有一定的抗性,将病毒以1TCID∞t!
lllt的剂量接种于细胞,病毒仅在短时阿内有低滴度复制,并无典型的CPE表现,仅有细胞暂时性增殖受抑,死亡增多,总数r降;在加入新鲜正常细胞的条件r,接种4天后病毒滴度迅速下降,至接种后第12天时已能测出,病毒抗原及DNA水甲也呈现相应的动态变化,随着病毒基因表达维普资讯http://www.
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com第3期丰晓辉等:几单核细胞系u讲和T细胞系HSB细胞的HSV一'感染213的逐步受抑,细胞增殖逐步恢复,死细胞渐步,细胞总数四升.
昂终,病毒DNA被清除,细胞从感染中恢复.
这与国外对HSV1感染单核巨噬细胞特点的研究结果是基本一致的,迄今对多种同来源的单核巨噬细胞的研究表明,单核巨噬细胞大都程度不同地抵抗HSV一1感染.
这种抗性的程麈可围某些因素的作用I增减.
Tenney等报道,PMA、VD和欧瑞香脂可削弱U细胞的抗性,促进HSV一1在其中增殖【.
Domke—Opitz等报道LPS可削弱C57BL/6小鼠脾脏巨噬细胞的抗性,促进HSV一1在其中复制.
本研究证实,LPS也能降低U.
细胞的抗性,促进HSV1的复制.
提高病毒感染滴度,延长病毒感染时问,形成4周左右的持续感染,这一现象在体内胄何实际意义,是否与HSV一1的播散和潜伏活化有关,值得进一步研究.
HSV1接种HSB细胞后,培养卜清中病毒滴废高于U细胞,虽然也在2周后降至测不出水平,但与细胞大量死亡相l甲行,说明病毒感染的终止是因其宿主的不复存在.
这一结果提示,HSB细胞对HSV—l感染无抵抗力,感染呈急性杀细胞性,而且pHA乖Ⅱ激不改变HSB2细胞HSV1感染特点.
过去认为体内静止的淋巴细胞允许HSV增殖,只是在受到刺激而活化、分裂增殖时才允许HSV有低度复制[3,1l:.
后来发现淋巴细胞体外传代株不需要刺激就能允许HSV低度增殖.
我们曾报道HSV2在K细胞卜HSV—I在Raji细胞上无需丝裂原刺激就能持续复制.
此两株细胞为B细胞传代株.
本研究所用HSB细胞则为T细胞株,同样无需丝裂原PHA的刺激就允许HSV一1增殖;且形成Km、Raji细胞上那种稳定的持续感染,而是形成急性杀细胞性感染因此我们认为淋巴细胞是否允许HSV—I感染与其分裂增殖能力胄关.
当淋巴细胞在炎症、免疫反应的体内环境中大量活化、分裂增殖时,就可能允许HSV在其中复制.
根据被感染细胞的类型及所感染病毒的毒力、数量不同或表现急性杀细胞性感染,或表现为持续性感染,这还需要在体内试验中作进一步研究加以证实.
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expressionofvirusantigenandexistingtimeofvirusDNA.
Theresultsshowedthatafterinoculation,Ucellsallowedthevirustoreplicateonlytoaquitelowde—greeandonlyforaquiteshortperiod.
Twelvedaysafterinoculationtheviruswasnotde—tectableinthesupernatans.
Afterproliferationinhibitionanddeathforabout2weeks,thecellsweregraduallyrecovered;stimulationofU7cellswfthLPSincreasedthevirusinfectiv—ity,prolongedtheinfectionperiodandpromotedtheformationoftemporarypersistentinfec—lion·TheresultsalsoshowedthatHSB2cellspermitedthevirustoreplicatetoahighertiter,andpresentedanacuteandcytocidalinfection;stimulationofHSB2cellswithPHAdidnotaIterthecharacteroftheinfectionofthecells.
KeywordsHerpesSimplexVirus,Monocyte,T—lymphocyte维普资讯http://www.
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