病毒基因编辑清除hiv

BSL-2实验室危害评估报告中国科学院神经科学研究所BSL-2实验室危害评估报告基因编辑平台2017年BSL-2实验室危害评估报告目录第一章腺相关病毒危害程度评估报告.
1第二章慢病毒危害程度评估报告.
4第三章重组缺失型狂犬病毒危害程度评估报告.
7第四章腺病毒危害程度评估报告.
11BSL-2实验室危害评估报告1第一章腺相关病毒危害程度评估报告一、生物学特性腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制.
它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因.
ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用.
cap基因编码病毒衣壳蛋白,rep基因参与病毒的复制和整合.
AAV能感染多种细胞.
Rep蛋白存在时,病毒基因组很容易整合到人类第19号染色体的特异位点:AAVS1位点.
这是已知的唯一能够定点整合的哺乳动物DNA病毒.
AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒.
其基因组DNA小于5kb,无包膜,外形为裸露的20面体颗粒.
AAV不能独立复制,只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时,才能进行复制和溶细胞性感染,否则只能建立溶源性潜伏感染.
目前,实验室内主要使用的是无辅助病毒的三质粒包装系统,由于包装复制缺陷重组AAV需要很多腺病毒基因产物,该系统中多数所需的腺病毒基因产物(E2A、E4和VAIRNA)在helper质粒中,而E1腺病毒基因在HEK293细胞中表达,并且将Rep基因和Cap基因放在一个单独质粒中,这样既避免了辅助病毒的污染,无法使有复制能力AAV的产生,使得该包装系统更加安全方便.
二、危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该病毒危害程度为第三类.
三、致病性在多数情况下,AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染,只有在辅助病毒共同感染时,才发生产毒性感染.
在无辅助病毒存在时,AAV病毒颗粒进入细胞,脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达,并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制.
这种负调节作用促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染.
研究AAV潜伏感染的细胞发现,AAV对细胞表型往往有微弱的影响,并影响细胞对刺激的反应能力.
AAV生活周期的另一种细胞内期是产毒性感染,往往在有辅助病毒(腺病毒货孢疹病毒)感染时发生.
辅助病毒的感染可以在AAV感BSL-2实验室危害评估报告2染之前、同时或之后进行.
目前的关于AAV工作模式有以下要点:(1)AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒;(2)通过潜伏感染,,病毒基因组得以同细胞共存;(3)只要宿主细胞正常,AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态;(4)如果细胞受到刺激,细胞内环境发生改变而表达应激基因;(5)导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达,从而使AAV病毒复制;(6)产生子代病毒并释放,又感染新的正常宿主细胞,建立新的潜伏状态.
四、暴露的潜在后果腺相关病毒是一种强烈偏向于潜伏的病毒.
感染可导致基因插入诱变,却几乎不可能发生此种情况.
可能对致癌基因或潜在致癌基因进行整合和表达.
摄入、直接接触皮肤粘膜、注射存在一定的风险性.
五、感染途径暴露的皮肤(如眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜)、注射、直接接触皮肤、气溶胶都是腺相关病毒可能侵入的途径.
六、微生物在环境中的稳定性腺相关病毒对化学品十分敏感,常用的消毒剂如1%的次氯酸钠、2%戊二醛、0.
25%十二烷基硫酸钠等均能灭活病毒.
七、实验操作活动进行腺相关病毒操作的人员,需注意自身防护.
穿着实验服或隔离服,戴上手套、口罩、鞋套等.
暴露的皮肤(如眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜)、注射、直接接触皮肤、气溶胶都是腺相关病毒可能侵入的途径.
如果工作服污染了腺相关病毒应在送洗丢弃前消毒,工作人员不能穿着工作服去实验室以外的地方.
操作病毒时使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅,如果操作时台面有病毒污染,请立即用15%的84溶液擦拭.
接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡过夜后弃去.
如需离心,应使用密封的离心管.
注射腺相关病毒时,使用合格的注射器,操作过程中不要把针头拔离注射器,以免划伤.
实验结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂和水清洗双手.
八、预防和治疗建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
一旦发生意外,BSL-2实验室危害评估报告3按照本实验室《应急预案》进行处理.
九、工作人员素质工作人员及进入BSL-2实验室的人员,须经过生物安全培训并熟知相关注意事项.
十、评估结论在多数情况下,AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染,只有在辅助病毒共同感染时,才发生产毒性感染.
所以我们常用的腺相关病毒具有生物学的安全性,但是并不排除有感染的可能,所以在实验操作中工作人员和实验人员应注意防护,穿戴必要的防护设备,当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套.
如可能发生感染性材料的溢出或溅出,宜戴两副手套.
不得戴着手套离开实验室.
接触感染性材料的物品需经严格消毒后再丢弃.
腺相关病毒的操作实验建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
BSL-2实验室危害评估报告4第二章慢病毒危害程度评估报告一、生物学特性慢病毒(lentivirus)在分类上属于逆转录病毒科,为二倍体RNA病毒.
原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主,导致感染个体发病.
慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前,经历较长的潜伏期,之后缓慢发病,因此被称为慢病毒.
由于慢病毒载体主要来源为HIV病毒,特别是HIV-1应用的较为广泛和深入,因此慢病毒的生物安全性成为使用者担心的主要问题之一.
慢病毒的分子结构被不断改进,主要致力于如何阻止形成有复制能力的HIV病毒,现在应用比较广泛的是三质粒、四质粒表达系统,该系统中的包装信号被删除,包装序列不能整合至病毒基因组中,因此病毒感染宿主细胞后不能复制,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒.
所以我们常用的慢病毒载体中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,具有生物学的安全性.
由慢病毒制备而成的载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果.
二、危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该病毒危害程度为第三类.
三、致病性慢病毒能整合到宿主染色体,从而感染非分裂期细胞,且有较高的突变率.
它所引起的疾病临床表现十分复杂,通过较长的潜伏期、免疫缺陷和持续性感染宿主引起多种器官发生病变.
急性感染人类的慢病毒可能伴有流感样或单核细胞增生样症状,包括肌痛、腹泻、恶心、呕吐、头痛、体重下降和神经性症状.
四、暴露的潜在后果慢病毒感染可导致基因插入诱变,致癌基因或潜在致癌基因的整合和表达.
气溶胶暴露的危险尚未知.
五、感染途径皮肤(尤其是有皮肤抓伤、擦伤等)及眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜都是慢病BSL-2实验室危害评估报告5毒可能侵入的途径.
呼吸道传播是否存在尚不明确.
六、微生物在环境中的稳定性慢病毒对外界抵抗力较弱,病毒在环境中常温下可存活数小时至数天,对热、干燥敏感,不耐酸.
60℃以上就可被灭活.
因此,注射器具、医疗用具通过高温消毒、煮沸或蒸汽消毒完全可以达到消毒目的.
慢病毒对化学品也十分敏感,常用的消毒剂如70%酒精、1%次氯酸钠、2%戊二醛、甲醛等均能灭活病毒.
七、实验操作活动进行慢病毒操作的人员,需注意自身防护.
穿着实验服或隔离服,戴上防护面罩或护目镜、手套、口罩、鞋套等.
皮肤(尤其是有皮肤抓伤、擦伤等)及眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜都是慢病毒可能侵入的途径.
有证据表明实验室工作服有传播反转录病毒的危险,如果工作服污染了慢病毒应在送洗丢弃前消毒.
工作人员不能穿着工作服去实验室以外的地方.
操作病毒时使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅,如果操作时台面有病毒污染,需要立即用84消毒液擦拭.
接触过病毒的吸头,离心管,培养板,需要放入指定的灭菌盒内,经过高温高压灭菌后丢弃.
培养液需用75%酒精加1%的SDS溶液或于84消毒液浸泡过夜后弃去.
如需离心,应使用密封性好的离心套管.
注射慢病毒时,使用合格的注射器,操作过程中不要把针头拔离注射器,以免划伤.
实验结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂洗手.
八、预防和治疗建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
一旦发生意外,按照《全国艾滋病检测技术规范》(2004年版)和本实验室《应急预案》进行处理.
由AIDS引起的机会性疾病的治疗措施均可用于慢病毒感染者的治疗,可使用治疗HIV、抗逆转录病毒、整合酶抑制剂的多种药物立即治疗.
九、工作人员素质工作人员及进入BSL-2实验室的人员,须经过生物安全培训并熟知相关注意事项.
十、评估结论慢病毒的分子结构被不断改进,现在应用比较广泛的是三质粒、四质粒表达系统,该系统中的包装信号被删除,包装序列不能整合至病毒基因组中,因此病BSL-2实验室危害评估报告6毒感染宿主细胞后不能复制,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒.
所以我们常用的慢病毒载体中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,具有生物学的安全性,但是并不排除有感染的可能,所以在实验操作中工作人员和实验人员应注意防护,穿戴必要的防护设备,当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套.
如可能发生感染性材料的溢出或溅出,宜戴两副手套.
不得戴着手套离开实验室.
接触感染性材料的物品需经严格消毒后再丢弃.
慢病毒的操作实验建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
BSL-2实验室危害评估报告7第三章重组缺失型狂犬病毒危害程度评估报告一、生物学特性野生型Rabies病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus).
外形呈弹状,核衣壳呈螺旋对称,表面具有包膜,内含有单链负链RNA.
病毒粒子长约250nm,直径约为70nm.
病毒基因组长约12kb,由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G和L5个基因,其分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白.
感染野生型Rabies病毒后,会引起人畜共患的病毒性致死性中枢神经系统感染疾病,以恐水、畏光、吞咽困难和狂躁等临床表现为特征.
目前神经学研究主要使用的重组缺陷型狂犬病毒为糖蛋白缺失型狂犬病毒载体,常用的是载体是基于狂犬病毒疫苗株SADB-19,通过反向遗传学手段,构建出糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒载体,其目的是更安全有效地用于神经环路的科学研究.
由于糖蛋白是狂犬病毒感染神经末梢和细胞的必需蛋白,因此这种载体具有更低的毒性和很高的生物安全性.
除了可以通过感染ΔG狂犬病毒观察神经细胞的精细形态,也可以通过外源性表达糖蛋白的方法实现对所标记神经元的环路联接进行逆向跨单级突触追踪,所以被广泛应用于神经环路相关的研究,成为解析神经环路结构和功能的重要工具之一.
此外,在该缺陷型病毒基础上,使用禽类的反转录病毒糖蛋白(EnvA)进行包裹.
由于哺乳动物细胞没有EnvA的受体,所以EnvA包裹的重组缺失型狂犬病毒不能感染哺乳动物的细胞.
只有当外源性的禽类受体(TVA)表达在特定神经细胞上的时候,EnVA包裹的Rabies载体就可以特异的识别出这些神经细胞,在且仅在这些细胞当中表达,也更具有安全性.
并且通过外源性表达的糖蛋白,这种重组缺失型狂犬病毒可以进一步对这些神经细胞进行选择性的环路追踪二、生物安全程度分类根据中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》,SADB-19为狂犬病毒(固定毒),故而属于第三类病毒.
基于该疫苗株发展出来的糖蛋白缺失的重组狂犬病毒,其致病性则大大降低.
三、致病性人被野生型狂犬病毒感染后,经过一定潜伏期(通常1-3个月),会表现出病BSL-2实验室危害评估报告8理症状.
最初是发热,伤口部位常有疼痛.
随着病毒在中枢神经系统的扩散,可能会有狂躁性或者早瘫性的症状出现.
最后有可能发展为可致命的进行性脑脊髓炎症.
狂犬病毒减毒疫苗株SADB-19疫苗株,通过研究发现,对除了啮齿类动物以外的包括人和非灵长类动物都不具有致病症状.
虽然该疫苗株对于大小鼠,具有一定的致病性和致死性,但是发生感染的动物的唾液内并无狂犬病毒的存在,所以同笼饲养情况下也未发现有个体间发生传播的现象.
糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒载体是在狂犬病毒SADB-19疫苗株基础上进一步改造而同时这个糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒载体由于自身无法产生糖蛋白,跨突触能力丧失,从而无法在中枢神经系统扩散,更具有一定的生物安全性.
四、暴露的潜在后果狂犬病毒病毒通常是通过有创伤的伤口,经神经肌肉接头进入人和动物体内的神经系统造成感染的.
被野生型狂犬病毒感染后,有可能会引起中枢神经系统疾病.
而被糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒载体感染只会局限在非常有限的神经元细胞当中,因此不会引起疾病.
由EnVA蛋白包裹的Rabies载体即使是在皮肤伤口暴露的情况下也不会感染人和哺乳动物,具有更高的生物安全性.
五、感染途径狂犬病毒的来源有可能来自于唾液、脑脊髓液、大脑组织、血液、尿、皮肤组织等.
病毒有可能通过吸入雾化的液体、粘膜组织的接触还有皮肤伤口如抓伤、擦伤、刺伤等进入体内.
六、微生物在环境中的稳定性野生型狂犬病毒病毒离体后生存能力很差,一般在体外很快就失去活性.
Rabies不耐热,在56℃15~30分钟或100℃2分钟即可灭活;易为日光、紫外线、超声波、甲醛、升汞季胺类化合物(如新洁尔灭)、脂溶剂、0.
01%碘酒、70%酒精等灭活;对酸和碱敏感,1%-2%的肥皂水亦能使其灭活.
七、实验操作活动虽然,较之野生型的病毒,糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒的危害性大大减弱,然而进行该种ΔG狂犬病毒载体包装制作的人员,需注意自身防护.
穿着实验服或隔离服,戴上防护面罩或护目镜、手套、口罩、鞋套等.
注意保护皮肤(尤其BSL-2实验室危害评估报告9是皮肤有抓伤、擦伤等)及眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜等.
工作服需要定期消毒,工作人员不能穿着工作服去实验室以外的地方.
操作时必须使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅.
如果操作时台面有病毒污染,需要立即用70%酒精或84消毒液擦拭.
接触过病毒的枪头、离心管、培养板等,需要放入指定的灭菌盒内,经过高温高压灭菌后丢弃.
培养液需用75%酒精加1%的SDS溶液或于84消毒液浸泡过夜后弃去.
操作结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂洗手.
八、预防和治疗虽然,糖蛋白缺失型的ΔG狂犬病毒未见报道有致病性,为了确保万无一失,直接接触狂犬病毒材料的实验人员和进入该房间的BSL-2实验室管理人员必须提前注射疫苗.
整个方案实施过程中,采取BL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
一旦发生意外,按照BL-2实验室《应急预案》进行处理.
如果在操作过程中,皮肤被扎破或者有创伤口,应马上采取三步紧急应对措施.
第一步:冲洗伤口.
马上用大量流动的水冲洗伤口,把血挤出去.
最好用20%的肥皂水进行冲洗,连续冲上20分钟.
接着用碘酒消毒伤口,再用70%酒精洗掉碘酒,如此反复3次.
第二步:如果没有注射过疫苗,马上到当地防疫部门注射疫苗.
如果有注射过疫苗,则可以联系医生,检查体内狂犬病毒的有效抗体浓度.
根据医生诊断,若有必要,进行进一步的处理.
第三步:如果伤口创面严重,按照狂犬病毒暴露后治疗方案,一定要注射抗病毒血清,与疫苗同时使用.
抗病毒血清必须在医生的指导下先试针.
九、工作人员素质工作人员及进入BSL-2实验室的人员,须经过生物安全培训并熟知相关注意事项.
十、评估结论重组缺陷型的糖蛋白缺失型狂犬病毒安全性大大的高于野生的狂犬病毒,但是在包装扩增过程中仍然需要G蛋白的帮助,所以依然存在对于实验人员的感染可能性.
在实验操作中的工作人员和实验人员仍应特别注意防护,穿戴必要的防护设备,当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套.
如可能发生感染性材料的溢出或溅出,宜戴两副手套.
不得戴着手套离开实验室.
接触感染性BSL-2实验室危害评估报告10材料的物品需经严格消毒后再丢弃.
该类狂犬病毒的操作实验建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
BSL-2实验室危害评估报告11第四章腺病毒危害程度评估报告一、生物学特性腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70~90nm的颗粒,由252个壳粒呈廿面体排列构成.
每个壳粒的直径为7~9nm.
衣壳里是线状双链DNA分子,约含35000bp,两端各有长约100bp的反向重复序列.
由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55X103Da的蛋白质分子共价结合,可以出现双链DNA的环状结构.
腺病毒基因组进入细胞核后,细胞转录因子首先与E1A区上游的增强子结合,表达E1A蛋白,该蛋白的作用是调节细胞代谢,使病毒DNA更易于在细胞中复制.
腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染,人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关,但一种血清型可引起不同的临床疾患;相反,不同血清型也可引起同一种疾患.
腺病毒载体(adenovirus)是以腺病毒为原型进行基因功能改造改造而成的,无外壳的双链DNA病毒,病毒载体转基因效率高,体外实验通常接近100%的转导效率;可转导不同类型的人组织细胞,不受靶细胞是否为分裂细胞所限;进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组,仅瞬间表达,安全性高.
腺病毒包装系统是将辅助质粒和穿梭质粒共转HEK293细胞,在细胞内过Cre/loxP重组酶系统发生重组从而获得目的腺病毒.
常用的腺病毒载体为E1和E3基因缺失的,所以感染细胞后不会在细胞体内进行复制(除了含E1基因的HEK293细胞),因而是较为安全的基因治疗载体.
不过腺病毒作为基因载体还是需要使用适当的防护设备进行实验.
虽然产生可复制的腺病毒可能性很低,但是随着每次持续的扩增,这个概率会增加.
当腺病毒DNA结合到含有E1基因的HEK293细胞的基因组DNA上去时,就会产生可复制的腺病毒.
所以如果需要产生更多数量的腺病毒时,需要使用早期的病毒扩增储液,来降低概率.
由腺病毒引起的呼吸疾病的临床症状表现为感冒、肺炎、咽炎和支气管炎.
患者的免疫系统抵抗力下降,尤其容易引起腺病毒并发症,导致更多的系统性疾病.
二、危害程度分类根据中华人民共和国卫生部制定《人间传染的病原微生物名录》该病毒危害程度为第三类.
BSL-2实验室危害评估报告12三、致病性腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染.
腺病毒引起的急性传染病,易侵犯呼吸道及消化道黏膜、眼结膜、泌尿道和淋巴结.
主要表现为急性上呼吸道感染(急性呼吸道感染由腺病毒引起者占2%~4%),其次为眼部和胃肠道感染.
人群普遍易感,多见于儿童.
约半数患者为隐性感染.
婴幼儿易患腺病毒肺炎,病情重,病死率高,无特效治疗.
四、暴露的潜在后果腺病毒大多数的感染是温和的,不需要治疗或对临床表现的症状进行治疗.
因为没有特定的针对腺病毒的治疗,只有通过治疗感染后表现出的临床症状和并发症来治疗严重的腺病毒疾病.
五、感染途径病毒由呼吸道和眼结膜分泌物、粪便及尿排出体外,经空气飞沫、密切接触及粪、口途径传播.
所以实验过程中产生的气溶胶,暴露的口、鼻、皮肤等都存在潜在的感染危险.
六、微生物在环境中的稳定性腺病毒在化学、物理和不利的pH值条件下是非常稳定的,可以在体外存活.
常用的消毒剂如1%次氯酸钠、2%戊二醛、0.
25%十二烷基硫酸钠等均能灭活病毒.
七、实验操作活动进行腺病毒操作的人员,需注意自身防护.
穿着实验服或隔离服,戴上防护面罩、护目镜、手套、口罩、鞋套等.
暴露的皮肤(如眼部黏膜,鼻腔及口腔黏膜)、注射、直接接触皮肤、气溶胶都是腺病毒可能侵入的途径.
如果工作服污染了腺病毒应在送洗丢弃前消毒,工作人员不能穿着工作服去实验室以外的地方.
操作病毒时使用生物安全柜,小心不要产生气雾或液体飞溅,如果操作时台面有病毒污染,请立即用75%酒精加1%的SDS溶液擦拭.
接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请用75%酒精加1%的SDS溶液或于84消毒液浸泡过夜后弃去.
如需离心,应使用密封的离心管.
注射腺病毒时,使用合格的注射器,操作过程中不要把针头拔离注射器,以免划伤.
实验结束,脱掉手套前先消毒再摘除手套,随后用肥皂和水清洗双手.
八、预防和治疗BSL-2实验室危害评估报告13建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.
一旦发生意外,按照本实验室《应急预案》进行处理.
九、工作人员素质工作人员及进入BSL-2实验室的人员,须经过生物安全培训并熟知相关注意事项.
十、评估结论腺病毒感染途径多,感染后相应的并发症较为严重,没有特效治疗措施.
所以在实验操作中工作人员和实验人员应特别注意防护,穿戴必要的防护设备,所有操作必须在生物安全柜内进行,必要时戴防毒面罩和护目镜.
当手可能接触感染材料、污染的表面或设备时应戴手套.
如可能发生感染性材料的溢出或溅出,宜戴两副手套.
不得戴着手套离开实验室.
接触感染性材料的物品需经严格消毒后再丢弃.
腺病毒的操作实验建议采取BSL-2级标准及特殊操作规程、防扩散设备和设施.