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第32卷第4期植物保护学报V01.
32No42005年12月ACTAPHYTOPHYLAcIcAS1NICADec.
2005油菜花叶病毒Wh株系的鉴定蔡丽.
2许泽永"陈坤荣1晏立英1侯明生2(1中国农业科学院油料作物研究所油料作物遗传改良农业部重点实验室,武汉4300622.
华中农业大学植物科学技术学院植物保护系,武汉430070)摘要:依据病毒的寄主植物反应、血清学性质和RNA3'末端含印和7印基因1554bpeDNA片段序列分析,明确一个侵染油菜的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒分离物是油菜花叶病毒(Oilseedrapemosaicvirus,ORMV)的一个株系,定名为Wh株系.
ORMV—Wh侵染油菜、白菜和大白菜等十字花科的作物,初期产生典型明脉症状,对辣椒、番茄和烟草等茄科植物致病性弱;血清学与烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)有明显差异.
ORMV.
Whmp、cp基因和37uTR区段大小分剐为798、474和235个核苷酸,rap和cP基因有77个核苷酸重叠;与TMV序列同源性在60%以下,与侵染十字花科Tobamovirus属病毒株系序列同源性在80%以上;其中与ORMV的不同株系RMV.
cAB、RMv.
Sh、YoMV、YoMV—Cg和CTMV.
W的同源性在90%以上.
关键词:油菜花叶病毒;鉴定;烟草花叶病毒属IdentificationandcharacterizationofOilseedrapemosaicvirus(ORMV)WhstrainCAILi'2XUZe—yong"CHENKun—rang'YANLi—yin91HUOMing-shen92(I.
KeyLaboratoryofGenetic[mprovenmntforOilCrops,MinistryofAgricolture.
OiICropResearchInstitute.
ChineseAcademyofAs',iculturalSciences,Wuhan430062China;2.
DepartmentofPlantProtection,CollegeofPlantSciencetrodTechnology,HuazhongA痹eul￡u捌University,Wuhan430t)70,China)Abstract:Onthebasisofhostplantreactions,serologyandanalysesofnucleotldesequenceofl554bpcDNAinthevirusRNA37end.
aTobamovirnsisolatefromaninfectedoilseedrapeplantWIt.
SidentifiedandcharacterizedasastrainofOilseedrapemosaicvirus(ORMV),namelyWhstrain.
ORMV—Whinfec—tedoilseedrapeBra.
ssicanapus,ChinesecabbageBrassicapekinensisandothervegetableplantsinfamilyCmeiferae,hadlessinfectivitytotomato,Lycopersicumeaculentum,eggplantSolartummelongenaandotherinfamilySolanaeeae.
ORMV—WhisserologieallydistinguishablefromTMVinELISAtest.
Sizesofmp,cpgenesand3'UTRofORMV—Whwere798nt,474ntand235nt,respectively,withoverlapped77ntbetweenmpand叩genes.
Sequenceidentityofmp,cpgenesand3'UTRofORMV-Whisallless60%tothoseofTMV,higherthan80%tothoseofTobamovimsesinfectingCrueifemeplants,andhigherthan90%tothoseofRMV—CAB,,RMV—Sh,YoMV,YoMV—Cg,CTMV—W,whicharethestrainsofORMV.
Keywords:OiIseedrapemosaicvirus(ORMV);identification;Tobamovirus基金项目:国家"948"引进项目(2003一Q04)和农业部油料作物遗传改良农业部重点实验室资助项目作者简介:蔡丽,女,1980年生,硕士生,从事植物病毒和病害研究,email:e面li603@y8h…o$通讯作者(Authorforcorrespondence),email:删zeyong@publicwhhb.
co收稿口期:2004一11—15http://www.
paper.
edu.
cn中国科技论文在线植物保护学报油菜病毒病是我国油荣生产上的重要病害.
危害油菜的除了芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)两种主要病毒以外,一种烟草花叶病毒属%一bamovirus的杆状病毒是t自菜上常见病毒.
在困内,由于该病毒的形态与TMV(Tobaccomosaicvirus,TMV)相同,血清学上与TMV相关,长期以来被认为是TMV….
本所油莱病毒课题组曾用油菜上类似TMV病毒制备血清,在20世纪80年代末的病害调查中,对lo省市1000多份油菜病毒病样品做『】f【清检测,报道TMV占检测样品的8%".
.
此后也有不少油菜和十字花科蔬菜上TMV的报道.
近10年来,随着烟草花叶病毒属病毒分子生物学研究进展,依据病毒核酸序列同源性来确定病毒遗传亲缘关系,该属病毒已增加到10余种.
其中侵染r字花科植物的有油菜花叶病毒(Oilseedrapemosaic疵rw,ORMV)和芜菁脉明病毒(Turnipveincleaningvirus,TVCV).
4.
为了明确我国油菜上类似TMV病毒的归属,我删列本所油菜病毒课题组保存的杆状病毒分离物的生物学特性、血清学性质进行了研究,对病毒核酸37末端1554核苷酸片段的序列进行分析,与Tobamovirua属病毒侵染十字花科植物株系、TMV和其它病毒相应片段序列同源性作比较,明确该分离物为ORMV的一个株系,由于从武汉分离,称为Wh株系.
1材料与方法1.
1病毒寄主范围测定毒源ORMV·Wh株系来源于本所油菜病毒课题组保存的于燥样品,经摩擦接种在油菜上复活;病叶加0.
05mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.
0)研磨,摩擦接种供试植物,每种植物接种5~10株,置防虫网室内观察症状,约20天后用酶联免疫方法(ELISA)检测,以确定是否有隐症感染.
1.
2病毒提纯和RNA提取0RMV-Wh在大白菜上繁殖,病叶冰冻后加入0.
5moI/L磷酸缓冲液(pH7.
5,含0.
1%巯基乙醇)研磨,氯仿与正丁醇混匀,低速澄清,上清液加4%聚乙二醇(PEG,MW6000)沉淀病毒,一次差速离心后通过蔗糖梯度密度离心获得提纯病毒.
采用SDS和蛋白酶K处理法提取病毒RNA.
经等体积苯酚/氯仿(1:1)和苯酚/异戌醇各抽提一次后,加2,5倍体积100%乙醇、1/10体积3mol/1.
醋酸钠(pH5.
2)沉淀病毒RNA,经70%乙醇洗涤,真空下燥后,溶于10LLL重蒸馏水中.
1.
3与TMV血清学亲缘关系比较ORMV—Wh向清为本实验室制备,TMV病毒和血清由中国农业大学蔡祝南和李重九老师馈赠.
酶标羊抗兔IgG购自北京欣经科生物技术有限公司.
将0.
1rag/mI,浓度的ORMV—Wh和TMV提纯病毒按lO倍递进稀释成不同浓度,以包被缓冲液为阴性对照,用间接ELISA法比较两种病毒血清学亲缘关系.
1.
4RT·PCR扩增病毒壳蛋白(ep)和运动蛋白(mp)基因eDNA根据已报道Tobamcwirus属侵染十字花科植物的病毒株系印和唧基因两端保守区序列设计两对特异性引物:YMl5'GACGATTYCGTCGATrCGGT37(5441—5460nt),YM25'TI'AGGGAGGATrCGAAC—CTCT3'(6266~6286nt).
YM35'CACAa【'rAGAT-GAGGCCGTT3'(4741~4760nt),YM457CGTAT-GTCTCCGGTCj、KI3.
(5544~5561ntl=采用AccessRT.
PCRsystem试剂盒(Promega公司产品)扩增病毒核酸eDNA片段.
按试剂盒提供方法,以2止病毒RNA(20一25ng/灿)为模板,分别加入3.
3¨,上、下游引物(15pmol/txL).
RT-PCR扩增在PE24()oPCR扩增仪中完成.
病毒第一链cDNA合成在48℃下反应60min,随后94℃下2rain变性,40次扩增循环,包括94℃,30s变性;50.
c,1rain退火;68℃,2min延伸.
最后68℃下延伸7mln.
PCR扩增产物序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成.
用于病毒序列同源性分析Tobamoviru.
s属侵染十字花科植物的病毒株系和代表2个亚组的3种病毒在基因库中的登录弓如下:油菜花叶病毒(Youcaimosaicviru_,YoMV),U30944;YoMV.
Cg,D38444;TVcV,U03387;TMV—Cr,$68164;车前草花叶病毒(Ribgrassrtwsaicvirus,RMV),U2967l;RMV.
Sh,AF254924;RMV—CAB,AFl03781;侵染1一字花科植物Tobamovirus辣根株系(wasabistrainofcruciferTo-bamovirus,CTMV—W),AB003936;'fMV,J02415(V01408);黄瓜绿色花叶斑驳病毒(Cucumbergreenmosaicmottlevirus,CGMMV),D12505;菽麻花叶病毒(Sunn-hempmosaicvirus,SHMV),J02413.
病毒序列同源性比较和遗传进化树分析采用DNAstar软件,4期荣丽等:油菜花叶病毒Wh株系的鉴定2结果2.
1寄主范围测定试验接种4利16种植物,ORMV—Wh株系能侵染其中的9种.
ORMV—Wh对十字花科植物有较强致病力,能侵染所有参试的油菜、小白菜、大白菜、甘蓝、菜苔、芥菜和荠莱共12个品种,除甘蓝外,均表现明显症状.
发病初期出现明显的明脉,逐渐发展成花叶,严重的病株矮化.
接种的7种茄科植物·I』,除曼陀罗产生枯斑反应外,只有番茄表现隐症感染,其它均不感染.
不感染豆科的豇豆和葫芦科的黄瓜(表1).
表1防虫温室内ORMV-Wh株系寄主范围测定Table1HostrangeofOilseedrapemosaicvirusWhstrainingreenhousetests洼:LYS:局部黄斑(10calyellowspot);Mo:花叶(mosaic);VC:叫脉(veinclejming);Stu:矮化(stunt);SN:系统坏死(aystemienecrosis)LN:局部坏死斑(10calnecrosis);LCS:局部褪绿斑(1tmalchh)roficspot);shr:皱缩(shrink);La:隐症带毒(1al邮Iinfva.
don);:未感染(noinfection),2.
2ORMV.
Wh与TMV血清学亲缘关系比较结果表明,ORMV与其同源血清阳性反应的滴度为10~m∥mL,比与异源的TMV血清10mg/mL滴度大1000倍;TMV与其同源血清阳性反应的滴度为10mg/mL,比与异源的ORMV—Wh血清10.
m∥mL滴度大lO倍,说明ORMV和TMV在血清学性质上存在明显差异,亲缘关系较远.
2.
3ORMV-Wh3'末端核酸1554bpcDNA片段序列分析2,3,1ORMV—Wh37末端核酸1554bpeDNA片段序列和结构分析通过RT—PCR扩增和扩增片段拼接,获得ORMV—Wh株系RNA3'端1537bp含,砰和cp基因的eDNA序列,加上末端17bp保守序列,共1554bpeDNA片段序列(图1).
181162432植物保护学撮32卷女l女8999￡!
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1、ucleetidesequencedORMV—WhRNA3'ezldcDNA滓:图中下划线序州为编码区,双FYPJ线为,印和cP基崮77个重叠序列,标在框内的是该属侵染十字花科病毒株系3'UTR末端46个保守序列.
起始码ATG、终止码'IGA、T"均用粗体宁标明.
Note:ORFsareir,dicatedbyunderlinedOverlappingsequencesof唧and甲genesa坤doublyundeHined46eonsen,atives"luences扯3'endofRNAs(订allT06㈣nu∞infptlingenJcife㈣plaIlts聊lmxedInifialCOdoATGmLdterrainalcodeTGA.
TAA∽indicatedbyboldletter该cDNA片段含第2个开放阅读框架(ORF2)3'端113个核苷酸序列以及完整的ORF3和ORF4序列,其中ORF3798个核苷酸,为唧基因,编码分子量为29663Da的MP蛋白.
ORF4含474个核苷酸,为印基因,编码分子量为17635Da的CP蛋白.
两个ORF有77个核苷酸序列重叠.
3'终端非编码区域(3'UTR)为235个核苷酸.
ORMV-Wh和TobamovirⅥ属其他侵染十宁花科病毒株系比较,cp基因和3'UTR片段大小一致;mp基因与YoMV、YoMV.
Cg大小一致,而RMV—Sh少3个核苷酸,CTMV—W、TMV—Cr和TVCV多6个核背酸.
侵染十字花科病毒株系jo该属其它病毒相比差别很大,特别是3'UTR区段,TMV、CGMMV和SHMV3种病毒分别为204、176和209nt,均小于十字花科病毒株系.
TMV、CGMMV和SHMVcp基因略大,分别为480、486和495nt;mp基因变异较大,分别为804、795和852nt.
2.
3.
2与同属其它病毒和株系序列同源性比较和遗传进化树分析无论是甲、mp基凶还是37UTR医段,以及编码的cP和MP蛋白,ORMV—Wh与侵染十字花科植物病毒株系之间均有较高序列同源性,而与'FMV、CGMMV和SHMV序列同源性均较低.
ORMV一聊1与RMV—CAB、RMV—Sh、YoMV、YoMV—cg和CTMV—wcp基因序列同源性高达90.
7%~97.
5%;与TMV—Cr、TVCV和RMV同源性为84.
6%~87.
1%,而与TMV、cGMMV和SHMV的同源性均在55%以下.
CP蛋白氨基酸序列同源性比较趋势一致.
ORMV—Whmp基因与同属病毒和株系序列同源性比较结果和印基用比较结果一致,但同源性稍低一些.
Tobamovirus属病毒37UTR区段具有较高保守性,ORMV—Wh与6个侵染十字花科病毒株系相比,同源性高达92.
3%~98.
7%,该区段末端46个核苷酸为特征性的高度保守区,但与TMV、CGMMV和4期索丽等:油菜花叶病毒Wh持系的鉴定SHMV3种病毒同源性均在60%以下(表2).
cP和MP蛋白氨基酸序列同源性遗传进化树分析均表明所有侵染十字花科病毒株系独自构成一个亚组,这一亚组内的遗传亲缘关系比较密切.
其中ORMV—Wh与RMV—CAB、RMV—Sh、YoMV、YoMV—cg和CTMV—W关系密切,构成一组,可以认为是同一个病毒种内的不同株系,而TMV-Cr、TVCV和RMV构成另一组,属另一种病毒的不同株系.
他们与代表2个亚组的3种病毒遗传亲缘关系都很远,分属于不同的亚组(图2).
表2ORMV-Wh与Tobamovirus属其它病毒和株系印和mp基因核苷酸和编码蛋白氨基酸序列同源性Table2Identitiesofgenesnucleotideandencodedproteinaminoacidsequencesof"ORMV—m6withTobanwvimsesinfectingcruciferousplantsandotherthreevirusesrepresentingtwoothersubgroups005I.
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_J图2Tobamoviras属侵染十字花科病毒株系及代表2个亚组的3种病毒CP(左)和MP蛋白(右)氨基酸序列同源-|生遗传进化树分析(罔中标尺相当于5%的差异)Fig2PhylogeneticrelmionshipofCP(1eft)andMP(i出)aminoacidsequencesofORMV—WhtothoseofTobamrnJiruJesinfectingcruciferousplantsandthreevi,'usesrepresentingtwoOthersubgroups(barcorrespondsto5%difference)3讨论依据病毒的寄主反应、血清学性质和RNA37未端1554bpcDNA片段序列分析,明确本所从油菜上分离、保存的Tobamovirw属病毒分离物是ORMV的一个株系,定名为武汉(Wh)株系.
ORMV—Wh和该属其他侵染十字花科植物病毒株系一样,能侵染油菜、甘蓝和大白菜等十字花科作物,初期产生特征性的明脉症状,对烟草和番茄等茄科植物致病性弱;而TMV对茄科植物致病性强,对十字花科植物致病力弱"一.
序列分析和比较表明,ORMV—Whcp、rnp基因和37UTR区段与TMV序列同源性在60%以下,植物保护学报32卷而与该属侵染十字花科植物病毒株系序列同源性在80%以上,其中与RMV—CAB、RMV-Sh、YoMV、Yo—MV—Cg、CTMV—W在90%咀上,遗传进化关系更密切,归属于一个种的不同株系.
而TMV—Cr、TvcV和RMV遗传关系亲近,应属于另一个种的不同株系.
两个种均已为国际病毒分类委员会所承认,但也有人认为,可以考虑将两个种归为一个种"….
国内对Tobamovirus属侵染f一字花科植物病毒研究有着很久的历史,但长期以来归属上存在着混乱.
如1962年周家炽和裴美云分别报道类似TMV的油菜分离物,在寄主反应和血清学性质上行i同于7I、Mv,称为油菜花叶病毒(Youcaimosaicvirus,Yo—MV)[s,6j.
盛方镜和徐来升等依据寄主反应不同将杭州油菜和卜.
海青菜类似TMV分离物,归属于长叶车前花叶病毒(RMV)"91.
而另一些研究仍将其归属于TMV"1.
1981年,Palukaitis等依据cDNA分子杂交试验和cP氨基酸组成证实我国YOMV分离物不同于TMVn11.
1996年,Aguilar等在核酸分子水平上证明了YoMV是完全不同于TMV的新病毒,并建议将病毒名称中的油菜汉语拼音youcai改为英文oilseedrape,即Oilseedrapemosaicvirus"".
这一名称已为国际病毒分类委员会所承认".
4l.
近年来,Zhu等完成上海青菜RMV—Sh分离物核酸全序列分析,I=l本和韩国研究人员完成Tobamovirus属十字花科分离物RMV—CAB、YoMV-Cg、CTMV—W全序列和部分序列分析,证明了至今存弧洲分离的mo·bamovirus属病毒十字花科分离物均属于ORMV㈨13t1….
近lO年来,随着分子生物学研究进展,Tobamo—virus属病毒已增加到10余种.
Gibbs对该属19种病毒和株系复制酶基因、n驴和印基因序列列源性和遗传进化树分析,划分为3个亚组(subgroup),亚组的划分与寄主范围相关,并认为是与寄主植物长期共同进化的结果.
亚组I包含TMV、ToMV等对茄科植物侵染力强的病毒,亚组Ⅱ包含CGGMV和SHMV等对豆科和葫芦科植物侵染力强的病毒,而亚组Ⅲ包含侵染十字花科植物的病毒.
与其它两个亚组相比较,亚组Ⅲ病毒遗传变异较小,亲缘关系近'….
参考文献(References)l李丽丽油菜病毒病中国农作物病虫害北京:中国农业出版社.
19952王圣玉,李丽丽,方小平.
等我国南方油菜病毒病的发生和病原病毒血清学鉴定.
植物保护,1990,16(6):2—43…RegenmortelMHV,FauquetCM,BishopDHL,etalredslVirusTaxonomySeventhReportoftheImemationalCom—mitteeonT"xonomyofVirusesSanDiego:AcademicPress,Lon—don.
20004GibbsAEvolutionandoringinsofTobamovirusezPhilTmns.
RSocImd,1999,354(1383j:593—6025裴美云来源于不同植物的TMV分离物的初步研究微生物学报,1962,8(4):420—4286周家炽关于油菜花叶病毒的炎型微生物学报,1962,8(4):414—4177盛方镜,陆关成,李德葆.
杭州郊区油青菜上一个车前草花叶病毒的分离物浙江农业大学学报,1983,9(1):39—468徐来升,綮同润,陈仲宜,等蔬菜病毒病研究I侵染青菜的烟草花叶病毒(群)上海农业科技,1980,3:28—319土拱辰浙江油菜花叶病毒类型微生物学报,1978,18(4):298—30910Shimamoto1,SonodaS,VazquezP,eta/Nucleotidesequencea—rfMysisofthe37terminalregionofawasabistrainofcruclfertobam—ovimsgenomicRNA:subgroupir/gofcruci拈rtobamovimsesArch.
Viml.
1998.
143(9):1801—18131lPalukMtisP,RmldlesJW,TianY.
t,"alT&xonomyofseveraltobamoviruⅫfromChinaaftdeterminedbymolecularhybfidizationanalysiswithcomplemental7DNAInterdrology,1981,16(3):136—14112Agoilar1,SanchezF,MartinAM,eta/.
NucletidesequenceofChineserapemosaicvirus(OilseedⅢmosaicvirus),acrucifertohamoviluSinfectiousOilArabidopsisthaliatuP/matM01.
Biol,1996,30(1):191—19713ZhuH,HongJ,YeR,eta1.
Sequenceanalysisshowsthairib—grassmosaicvirusShangaaiisolate(RMV-Sh)iscloselyrelatedtoYoMcaimosaicvirusArch.
Viml.
.
2001,146(6):1231—123814YaraanakaT.
KomataniH.
MesMT.
et缸CompletenucleotidesHl㈣ceofthegenomicRNAoftobaccomosaicvirusstrainC8VirusGenes,1998,16(2):173—176