细胞www.hyyan.com

doi:10.
3969/j.
issn.
1000鄄484X.
2016.
04.
009转录因子Foxp3对人肺腺癌细胞A549增殖周期的影响及机制研究刘亚庆摇赵摇博摇罗亚东摇李祎南摇杨摇巍摇(吉林大学基础医学院免疫学系,长春130021)摇摇中图分类号摇R730郾3摇摇文献标志码摇A摇摇文章编号摇1000鄄484X(2016)04鄄0490鄄05作者简介:刘亚庆(1990年-),女,硕士,主要从事肿瘤免疫学研究,E鄄mail:yqliu13@jlu郾edu郾cn.
通讯作者及指导教师:李祎南(1988年-),女,博士,主要从事肿瘤免疫研究,E鄄mail:liyn13@mails郾jlu郾edu郾cn.
杨摇巍(1980年-),女,博士,副教授,主要从事免疫耐受方面的研究,E鄄mail:ywei@jlu郾edu郾cn.
[摘摇要]摇目的:研究Foxp3对肺腺癌细胞A549增殖及细胞周期的影响,并探讨相关调控机制.
方法:采用siRNA沉默A549细胞Foxp3表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期变化;RT鄄PCR筛选细胞周期相关checkpoint基因;免疫荧光及双荧光素酶报告基因分析Foxp3对相关checkpoint基因调控机制.
结果:沉默A549细胞Foxp3后,其增殖明显减慢并发生G0/G1期阻滞,G1/S期checkpoint基因CCND1表达显著降低.
机制研究发现Foxp3能直接调控CCND1表达.
结论:Foxp3通过上调细胞周期G1/S期checkpoint基因CCND1表达,促进肺腺癌细胞A549增殖,从而促进了肺腺癌发展,为肺腺癌的发生发展及治疗靶点提供了新思路.
[关键词]摇Foxp3;CCND1;肺腺癌;增殖;细胞周期EffectandmechanismoftranscriptionfactorFoxp3onproliferationandcellcycleofhumanlungadenocarcinomacellA549LIUYa鄄Qing,ZHAOBo,LUOYa鄄Dong,LIYi鄄Nan,YANGWei郾DepartmentofImmunology,BasicMedicalCollege,JilinUniversity,Changchun130021,China[Abstract]摇Objective:ToinvestigatetheeffectandmechanismoftranscriptionfactorFoxp3ontheproliferationandcellcycleofhumanlungadenocarcinomacelllineA549郾Methods:WeknockeddowntheexpressionofFoxp3usingsiRNA郾Foxp3inhibitionwasdetectedbyRT鄄PCR郾CellproliferationwasdetectedbyMTT郾CellcycleofA549cellsweredetectedbyflowcytometryafterthetransfectionofsiRNA郾Cellcycle鄄relatedcheckpointgeneswerefilteredbyRT鄄PCR郾TheregulationofFoxp3oncellcycle鄄relatedcheckpointgenesweredetectedbyimmunofluorescenceanddual鄄luciferasereporterassaysystem郾Results:TheproliferationofA549cellswereinhibitedaftersilencingFoxp3,andA549cellswerearrestedinG0/G1cycle郾G1/ScyclecheckpointgeneCCND1wasdownregulated郾MechanismresearchshowthatFoxp3canregulatetheexpressionofCCND1directly郾Conclusion:Foxp3canpromotetheproliferationofA549celllinebyupregulatingG1/ScyclecheckpointgeneCCND1郾Thisprovidesanewtargetforthetherapeutictargetsoflungadenocarcinoma郾[Keywords]摇Foxp3;CCND1;Lungadenocarcinoma;Proliferation;Cellcycle摇摇Foxp3(Forkheadboxprotein3)是叉头/翼状螺旋转录因子家族成员之一,最初被发现表达于CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(regulatoryTcells,Tregs),是其特异的标志物,也是维持其免疫抑制功能的关键调节基因.
在某些肿瘤中,如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌等,外周血和肿瘤局部Foxp3+Tregs增多,能抑制多种免疫细胞的作用,促进肿瘤免疫逃逸[1],与肿瘤进展及不良预后关系密切[2].
而近年研究发现Foxp3不仅在Tregs表达,在多种肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达,但是发挥的作用、与预后的关系却不尽相同.
在舌鳞状细胞癌、肝癌、胃癌中,Foxp3表达与不良预后呈正相关,发挥促癌作用[3,4];而在前列腺癌、乳腺癌中,Foxp3高表达者预后较好,Foxp3发挥抑癌作用[5,6].
恶性肿瘤的发生发展是多基因参与的过程,表现为细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为调节异常,这是影响患者预后的重要因素.
因此,肿瘤细胞Foxp3可能改变了肿瘤细胞的生物学行为,进而促进或抑制肿瘤的发生发展,影响患者预后.
增殖是细胞的重要生命特征,在胃癌、黑色素瘤中,Foxp3对肿瘤细胞增殖的影响也不一致[7,8].
肿瘤细胞能够无限增殖究其原因在于细胞周期调控紊乱,细胞周期的调控是一个精细复杂的过程,由多种蛋白共同参与.
在肺腺癌中,Foxp3对其增殖影响尚不明确,其机制研究更是鲜有报道.
因此,本课题拟以人肺腺癌细胞A549为模型,研究Foxp3对肺腺癌细胞增殖周期的影响及相关机制.
·094·中国免疫学杂志2016年第32卷1摇材料与方法1郾1摇实验材料、试剂摇人肺腺癌细胞系A549为本课题组前期冻存.
Foxp3siRNA购于广州锐博公司.
转染试剂Lipofectamine2000购于Invitrogen公司.
MTT购于Sigma公司.
细胞周期试剂盒、anti鄄Foxp3和anti鄄CCND1购于天津三箭公司.
胶回收试剂盒和DNA抽提试剂盒购于Roche公司.
pGL3萤光素酶双报告载体质粒以及双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司.
限制性内切酶Kpn玉、Bg芋及T4DNA连接酶购于北京全式金公司.
1郾2摇方法1郾2郾1摇siRNA沉默肺腺癌细胞Foxp3表达摇取对数生长期的A549细胞,调浓度2伊105ml-1,接种于六孔板(每孔1郾5ml),次日细胞密度达到60%~70%后进行转染.
先分别孵育转染试剂和siRNA,再将两者充分混合,室温孵育20min.
吸弃原六孔板内培养基,换无血清无抗生素DMEM.
将上述混合溶液加入六孔板内(siRNA终浓度50nmol/L),置于细胞培养箱孵育6h后,吸弃培养上清,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养.
48h后收细胞提取总RNA,RT鄄PCR检测Foxp3mRNA表达水平.
1郾2郾2摇MTT比色法检测细胞增殖摇取对数生长期A549细胞,调浓度8伊104ml-1,接种于96孔板(每孔100滋l).
沉默Foxp3表达72h后每孔加入10滋lMTT溶液,继续培养4h,弃掉上清后加入100滋lDMSO,低速震荡10min,使颗粒物充分溶解,于酶标仪波长570nm测OD值.
1郾2郾3摇流式细胞术检测细胞周期摇沉默A549细胞Foxp3表达48h后,胰酶消化收取细胞,调浓度1伊106ml-1,70%乙醇4益固定过夜.
PBS洗涤2次后加入500滋lPI染液,室温避光孵育30min后上机检测.
1郾2郾4摇RT鄄PCR检测细胞周期相关基因的mRNA水平摇沉默A549细胞Foxp3表达48h后,胰酶消化收取细胞,提取总RNA,RT鄄PCR检测CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6mRNA表达水平.
1郾2郾5摇免疫荧光摇在24孔板中做细胞爬片,次日取出玻片用PBS洗3次,4%多聚甲醛固定15min,PBS再清洗3次,0郾5%Triton室温打孔20min,PBS清洗后用1%BSA封闭.
加入稀释的一抗,湿盒内4益过夜.
次日加荧光二抗,PBST浸洗3次,湿盒中37益孵育1h,再用PBST浸洗3次.
滴加DAPI避光孵育1~3min染核,PBST洗去多余DAPI并吸干液体,封片后在荧光显微镜下观察采集图像.
1郾2郾6摇双荧光素酶报告基因摇根据http://www郾geneco鄄poeia郾com网站提供预测的CCND1可能的启动子作用区,设计引物,为了报告载体构建简便,在引物上下游分别插入限制性内切酶KpnI及BglII,引物由上海生工生物公司合成.
上游引物为5忆鄄GCGGTACCTCAGTCCCAGGGCAAATTCT鄄3忆,下游引物为5忆鄄GGCAGATCTAAACTCCCCTGTAGTCCGT鄄GC鄄3忆,序列大小为1143bp.
切胶回收PCR产物,在T4DNA连接酶的作用下行连接反应(16益过夜),将连接产物转化感受态大肠杆菌,筛选培养阳性克隆质粒测序鉴定.
沉默A549细胞Foxp3表达24h后,转染pGL3鄄CCND1鄄promoter质粒.
48h后收集细胞裂解物,用双萤光素酶报告基因检测试剂盒检测pGL3鄄CCND1鄄promoter质粒的萤光素酶活性.
1郾3摇统计学处理摇采用SPSS17郾0统计学软件进行分析,计量资料以x依s表示,采用t检验,P<0郾05为有统计学差异.
2摇结果2郾1摇沉默A549细胞Foxp3表达摇为干预A549细胞Foxp3表达,采用RNAi的方法将siRNANC、Foxp3siRNA1和Foxp3siRNA2分别转染A549细胞48h后,RT鄄PCR法检测各组细胞Foxp3表达.
结果显示:siRNA1、siRNA2两组Foxp3表达水平明显低于siRNANC组,差异具有统计学意义(P<0郾05).
该结果表明:两对siRNA均可特异性干扰Foxp3表达,可以用于后续实验,见图1.
图1摇RT鄄PCRmRNA水平检测Foxp3沉默效果Fig.
1摇mRNAexpressionofsilencingFoxp3wasdetectedbyRT鄄PCRNote:*郾P<0郾05,comparedwithsiRNANCgroup郾·194·刘亚庆等摇转录因子Foxp3对人肺腺癌细胞A549增殖周期的影响及机制研究摇第4期2郾2摇Foxp3对A549细胞增殖的影响摇为研究Foxp3对A549细胞增殖的影响,沉默Foxp3后采用MTT法检测细胞增殖情况.
结果显示:沉默A549细胞Foxp3后,细胞增殖明显减慢,siRNA1、siRNA2两组OD值分别为2郾155依0郾007、1郾786依0郾032,明显低于siRNANC组,差异具有统计学意义(P<0郾05).
该结果表明:Foxp3可以促进A549细胞增殖,见表1、图2.
2郾3摇Foxp3对A549细胞周期的影响摇为研究Foxp3对A549细胞周期的影响,沉默Foxp3后采用流式细胞术检测A549细胞的细胞周期.
结果显示:沉默A549细胞Foxp3后,细胞发生G0/G1期阻滞,siRNA1、siRNA2两组G0/G1期细胞比例分别为65郾6%、64郾6%,明显高于siRNANC组50郾5%,且S期细胞比例明显低于siRNANC组,差异均具有统计学意义(P<0郾05).
该结果表明:Foxp3可以促进A549细胞从G1期向S期转化,见图3.
2郾4摇Foxp3对CCND1表达的调控摇为研究Foxp3调控CCND1表达过程中的作用机制,首先采用细胞免疫荧光检测A549细胞Foxp3和CCND1的定位情况.
结果显示:在A549细胞中,部分区域出现了绿色荧光(代表CCND1表达)及红色荧光(代表Foxp3表达)的重叠区域(黄色区域),即CCND1与Foxp3的表达出现了共定位.
该结果提示Foxp3与CCND1可能直接相互作用,见图4.
表1摇各组细胞的OD570nm(x依s,n=3)Tab.
1摇OD570nmofdifferentgroups(x依s,n=3)GroupsOD570nmsiRNANC2郾484依0郾104siRNA12郾155依0郾007siRNA21郾786依0郾032图2摇MTT检测沉默Foxp3后A549增殖变化Fig.
2摇ProliferationofA549aftersilencingFoxp3wasdetectedbyMTTNote:*郾P<0郾05,comparedwithsiRNANCgroup郾2郾5摇G1/S期checkpoint基因的筛选摇为研究Foxp3对A549细胞G1/S期checkpoint基因的影响,沉默Foxp3后采用RT鄄PCR检测G1/S期checkpoint基因,包括CCND1、CCND2、CCND3、CCNE2、CCDE1、CDK2、CDK4、CDK6.
结果显示:沉默A549细胞Foxp3后,CCND1表达随之降低,明显低于siRNANC组,差异具有统计学意义(P<0郾05).
该结果表明,Foxp3可以促进A549细胞G1/S期checkpoint基因CCND1表达,见图5.
为进一步验证Foxp3是否对CCND1具有直接调控作用,我们构建了含有CCND1启动子荧光素酶报告基因质粒(pGL3鄄CCND1鄄promoter).
重组质粒经双酶切可见大小为1143bp的条带,见图6.
荧光素酶报告基因检测结果显示:沉默A549细胞Foxp3后,CCND1启动子荧光素酶报告基因活性明图3摇流式细胞术检测沉默Foxp3后A549细胞周期变化Fig.
3摇CellcycleofA549aftersilencingFoxp3wasdetectedbyFCMNote:*郾P<0郾05,comparedwithsiRNANCgroup郾图4摇A549细胞Foxp3和CCND1的定位表达Fig.
4摇ExpressionofCCND1andFoxp3onA549cellbyimmunofluorescences·294·中国免疫学杂志2016年第32卷图5摇RT鄄PCR检测G1/S期checkpoint基因变化Fig.
5摇mRNAexpressionofG1/ScyclecheckpointgenewasdetectedbyRT鄄PCRNote:*郾P<0郾05,comparedwithsiRNANCgroup郾图6摇双酶切鉴定pGL3鄄CCND1鄄promoter质粒Fig.
6摇IdentificationofeukaryoticexpressionplasmidsbyrestrictionendonucleaseanalysisNote:M郾Representsmarker;1郾RepresentspGL3鄄CCND1鄄promoter;2郾RepresentspGL3鄄CCND1鄄promoterPCRproductafterdiges鄄tion郾图7摇双荧光素酶报告基因检测Foxp3对CCND1启动子活性的影响Fig.
7摇EffectofFoxp3onactivityofCCND1promoterswasdetectedbydual鄄luciferasereportergeneassayNote:*郾P<0郾05,comparedwithsiRNANCgroup郾显降低(P<0郾05).
该结果明确了Foxp3对CCND1的直接调控作用,见图7.
3摇讨论转录因子Foxp3是Tregs特异的标志物及细胞发育和功能的关键调节基因[9].
一旦Tregs缺失Foxp3,其抑制功能将随之缺失,因此,Foxp3是维持Tregs抑制功能所必需[10].
在肿瘤微环境中,Tregs也发挥着免疫抑制作用,参与了肿瘤免疫逃逸[11,12],去除Tregs可以诱导抗肿瘤免疫,因此,Tregs是介导肿瘤免疫逃逸的关键细胞.
最初人们认为Foxp3仅表达于淋巴细胞,而近年来越来越多的研究发现Foxp3在多种肿瘤组织及细胞中也有表达,高表达Foxp3的肿瘤病人一般预后较差[13,14].
但Foxp3在不同肿瘤中发挥的作用也不尽相同,并且相关机制研究较少.
本课题组前期研究发现Foxp3在人非小细胞肺腺癌中高表达,并与淋巴结转移和TNM分期密切相关[15].
因此,本研究以人肺腺癌细胞A549为模型,研究Foxp3在肺腺癌中的作用及相关机制.
肿瘤发生发展的关键之一在于肿瘤细胞的无限增殖,其本质就是细胞周期调控紊乱.
本研究结果显示,Foxp3通过促进细胞G1期向S转化从而促进细胞增殖.
因此,Foxp3在肺腺癌中发挥促肿瘤细胞生长作用,并与肿瘤细胞周期调控紊乱有密切关系.
细胞周期的调控是一个精细的生物学过程,有一个复杂的分子调控网络.
细胞周期进程主要由细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin鄄dependentkinase,CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(Cyclin鄄dependentkinaseinhibitor,CDKI)驱动[16],在G0/G1、G2/M两个关键性限制点进行调控.
其中,cyclin和CDK为细胞周期正调控蛋白,CDKI为负调控蛋白.
G0/G1期转变标志DNA合成开始,G2/M期转变标志有丝分裂开始,其中G1期向S期转变更为重要.
本研究中我们发现,Foxp3可以促进A549细胞G1/S期checkpoint基因CCND1表达,从而促进细胞从G1期向S期转化.
CCND1是细胞周期调控蛋白家族的重要成员,属于细胞周期素cyclinD家族,正向调控G0/G1期限制点,推动细胞从G1期进入S期,开始合成DNA,实现细胞的增殖过程[17].
CCND1的表达、激活、在核内的聚集全都发生在G1中期[18].
CCND1最初被发现于甲状旁腺癌,是一种原癌基因,在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等多种肿瘤中通过基因扩增、基因重排及突变导致过表达[19鄄21].
肿瘤细胞CCND1过表达可缩短G1期,促进细胞从G1期向S期转化,加速细胞周期进程,促·394·刘亚庆等摇转录因子Foxp3对人肺腺癌细胞A549增殖周期的影响及机制研究摇第4期进细胞分裂,引起细胞周期调控紊乱,导致细胞增殖异常,从而导致肿瘤发生发展[22].
在舌鳞状细胞癌、乳腺癌等肿瘤中,CCND1对于淋巴结转移及预后、提高诊断阳性率均有重要意义[23鄄25].
但在肺腺癌中,CCND1与肿瘤的发生发展及在肺腺癌中的表达情况一直存在争议[26].
本研究中利用双荧光素酶报告基因实验证实了Foxp3可直接与CCND1启动子结合,促进其转录,引起细胞周期调控紊乱,加速细胞周期进程,最终导致肿瘤细胞无限增殖.
这与CCND1在乳腺癌、甲状腺癌、膀胱癌等肿瘤中发挥促癌作用的结果是一致的.
但Foxp3与CCND1具体的结合位点还需要进一步研究证实.
基于上述研究结果,我们证实了在人肺腺癌中,肿瘤细胞Foxp3可直接与CCND1启动子结合,促进其转录,引起细胞周期调控紊乱,促进细胞从G1期向S期转化,加速细胞周期进程,导致肿瘤细胞无限增殖促进其发展.
以细胞周期调控分子为靶点的肿瘤治疗已成为一个研究热点,Foxp3通过CCND1调控细胞周期影响细胞增殖可为肿瘤治疗提供新思路.
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