表达当当

ResearchPaper研究报告微生物学报ActaMicrobiologicaSinica52(2):184-190;4February2012ISSN0001-6209;CN11-1995/Qhttp://journals.
im.
ac.
cn/actamicrocn基金项目:河北省科技攻关项目(06780503)*通信作者.
Tel:+86-311-80789712,Fax:+86-311-80789710,E-mail:zhaobaohua86178@sohu.
com作者简介:张乐祎(1986-),男,河北石家庄人,硕士研究生,主要从事水生动物病原微生物学研究.
收稿日期:2011-10-07;修回日期:2011-12-18嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达张乐祎,孙彩霞,张亚宁,杨俊青,赵宝华*河北师范大学生命科学学院,石家庄050016摘要:【目的】从嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)HBNUAh01中克隆外膜蛋白A(outermembraneproteinA,ompA)基因并在烟草(Nicotianatabacum)叶片细胞中瞬时表达该蛋白.
【方法】以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)基因片段的PCR扩增,并将其克隆到pEASY-BluntSimple载体中以进行测序.
测序正确的AhompA基因序列与含有黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达载体.
将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞.
使用激光扫描共聚焦成像系统(ConfocalLaserScanningMicroscope)检测观察融合表达AhompA基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA基因在烟草叶片中的转录情况.
【结果】从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032bp的AhompA基因序列,并在烟草叶片中成功表达AhompA和YFP的融合蛋白.
【结论】AhompA基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础.
关键词:嗜水气单胞菌,外膜蛋白,黄色荧光蛋白,烟草,瞬时表达,植物疫苗中图分类号:S336文献标识码:A文章编号:0001-6209(2012)02-0184-07气单胞菌属是一类常见于水体环境中的革兰氏阴性菌,是水产养殖中的主要致病菌[1],该属中的嗜水气单胞菌会导致多种水产常见疾病,如多种鱼类的败血病,中华鳖的红脖子病、红底板病、疥疮病等,给水产养殖业造成了严重的经济损失[2].
该致病菌的主要致病因子包括外膜蛋白、S层蛋白、内毒素、外毒素、胞外酶、铁转运蛋白等,其中外膜蛋白可激发机体的细胞免疫和体液免疫应答,具有良好的免疫原性[3].
为防治气单胞菌属引起的水产疾病,目前较有效的办法有疫苗免疫预防、药物治疗和养殖技术改进,其中以疫苗免疫预防最为有效.
但由于传统疫苗在制作流程、生产成本、接种方法及安全性等方面存在很多不足,导致其在防治水产疾病的过程中不能有效的发挥作用[4].
植物基因工程疫苗是利用植物表达病原菌抗原蛋白的一个或几个亚单位,它没有病原体完整的侵染能力,却可以使机体对特异的病毒或细菌产生免疫应答反应.
在可食植物组织张乐祎等:嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达.
/微生物学报(2012)52(2)中表达的疫苗因可以直接食用,又称为口服疫苗或可食疫苗.
当表达疫苗的可食植物的组织被吞咽消化后,抗原被位于小肠黏膜滤泡组织中的膜细胞吞饮后转运到固有层,传递给抗原递呈细胞如巨噬细胞和B细胞,再由巨噬细胞等将抗原传递给辅助性T细胞,后者产生细胞因子从而活化B细胞,产生分泌型抗体IgA、循环抗体IgG和细胞毒性T细胞.
对胃肠道和非胃肠道传染病包括爱滋病等均可产生免疫保护作用[5-6].
植物性可食疫苗因其成本低廉、安全有效、生产及接种方法简单快捷尤其是可以掺入食料中进行饲喂接种等优势,在水产养殖业中具有广阔的前景[7].
为验证嗜水气单胞菌抗原蛋白在植物中表达的可行性,以便为进一步开发嗜水气单胞菌植物性可食疫苗奠定基础,本文利用植物瞬时表达系统进行嗜水气单胞菌外膜蛋白的异源表达,以嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因进行基因克隆并构建了含有YFP标签的重组真核表达载体.
通过重组表达载体转化农杆菌并最终侵染烟草叶片组织后,检测到AhompA基因和YFP基因的融合蛋白在烟草叶片细胞中的瞬时表达.
初步证明了嗜水气单胞菌抗原蛋白在植物中表达的可行性,为进一步研究开发抗嗜水气单胞菌植物基因工程疫苗以及使用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产疾病奠定了基础.
1材料和方法1.
1烟草植株、菌株、载体和试剂嗜水气单胞菌HBNUAh01株由本实验室保存;transstartfastPfu高保真聚合酶、DNA分子量标准Trans2K、1kbDNALadder及pEASY-BluntSimple克隆载体均购自北京全式金生物技术有限公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购自广东东盛生物技术公司;经改造过的含有YFP标签的pCAMBIA1300真核表达载体由本实验室保存;E.
coliDH5α感受态细胞及农杆菌GV3101感受态细胞由本实验室制作保存,烟草植株由本实验室培养.
1.
2引物设计与合成根据GenBank中嗜水气单胞菌Ah41菌株外膜蛋白A前体基因(GU196148),利用PrimerPremier5软件设计一对特异性引物(AhompA-P1、AhompA-P2)用于嗜水气单胞菌外膜蛋白A基因的扩增,上下游引物5'端分别添加XbaI和BamHI酶切位点(下划线部分)和2个保护性碱基.
由于使用的表达载体为经改造过的含YFP标签的pCAMBIA1300,其上的CaMV35S启动子后的第一个ATG起始密码子为YFP标签基因的ATG起始密码子,而构建时所选择的YFP基因上游克隆位点BamHI的序列位置导致应在克隆的外源基因3'末端正确读框后多克隆1个碱基(该碱基加粗标示)以保证克隆位点后YFP基因的读码框正确,因此设计引物如下.
引物由上海生工生物技术有限公司合成.
上游引物AhompA-P1:5'-GCTCTAGAATGATGAAAATGGCTCCTTCC-3'(下划线为酶切位点XbaI);下游引物AhompA-P2:5'-GCGGATCCACTTCTGAACTTCTTGTACGC-3'(下划线为酶切位点BamHI).
根据GenBank中YFP基因(DQ835190),利用PrimerPremier5软件设计一对特异性引物(YFP-P1、YFP-P2)用于验证重组表达载体在转染烟草叶片后YFP基因转录情况的RT-PCR检测.
引物由上海生工生物技术有限公司合成.
上游引物YFP-P1:5'-ATGGTGAGCAAGGGCG-3';下游引物YFP-P2:5'-TTATCTAGATCCGGTGGATCTG-3'.
1.
3PCR扩增以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行菌液PCR扩增目的基因.
模板的制备:将嗜水气单胞菌HBNUAh01用LB培养基扩培,取震荡培养过夜的菌液于12000*g离心1min,用1/10体积无菌水重悬菌体沉淀,沸水浴5min,作为模板.
PCR反应在50.
0μL体系中进行,双蒸水28.
0μL,5*TransStartFastPfuBuffer10.
0μL,dNTP5.
0μL,AhompA-P12.
0μL,AhompA-P22.
0μL,DNA模板2.
0μL,TransStartFastPfuDNAPolymerase1.
0μL,混匀后按下列条件分别进行PCR扩增:95℃2min预变性,95℃20s,50℃20s,72℃20s,共进行30个循环,最后72℃延伸5min.
PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测.
1.
4PCR产物克隆及序列分析PCR产物经回收纯化后与pEASY-BluntSimple载体连接,连接体系为5.
0μL,其中PCR产物4.
0μL,pEASY-BluntSimpleCloningVector1.
0μL,混匀后于25℃水浴10min即完成克隆载体的连接.
连接产物转化E.
coliDH5α感受态细胞,XbaI和581LeyiZhangetal.
/ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(2)BamHI双酶切鉴定提取重组质粒.
经酶切鉴定正确的重组质粒送北京中科希林生物技术有限公司测序,获得的序列应用DNAMAN软件进行序列分析及Blast序列同源性比较.
1.
5AhompA基因真核表达载体构建使用限制性内切酶XbaI和BamHI对重组克隆载体及含有YFP标签的pCAMBIA1300真核表达载体分别进行双酶切,纯化回收AhompA基因片段与双酶切后的含YFP标签的pCAMBIA1300真核表达载体连接后转化E.
coliDH5α感受态细胞.
提取重组表达载体进行PCR鉴定(AhompA-P1、AhompA-P2为引物)及XbaI和BamHI双酶切鉴定.
经PCR及双酶切鉴定正确的重组表达质粒送北京中科希林生物技术有限公司测序,并进行序列分析.
1.
6表达载体转化农杆菌将测序正确的重组表达质粒经液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中,用含100mg/L卡那霉素的LB选择培养基筛选抗性菌落,提取表现卡那霉素抗性的农杆菌质粒DNA,经特异引物PCR及XbaI和BamHI双酶切2种验证无误后,菌液经液氮速冻后于-80℃保存备用,完成农杆菌瞬时转染系统的构建.
并以同样的转化方法用只含YFP标签的表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞,作为对照在后续实验中使用.
1.
7AhompA基因在烟草叶片中的瞬时表达与检测1.
7.
1激光扫描共聚焦成像系统成像检测:分别将含AhompA基因的重组表达载体农杆菌转化子及只含YFP标签的表达载体农杆菌转化子菌株活化,以2%的接种量接入含卡那霉素的LB液体培养基中,30℃160r/min振荡培养过夜,5000*g离心10min收集菌体,用稀释缓冲液(5mg/mLD-葡萄糖,9.
76mg/mLMES,0.
76mg/mLNa3PO4,0.
0196mg/mL乙酰丁香酮)洗涤菌体3次,以稀释缓冲液将菌体浓度调整至OD600=0.
5.
用稀释好的菌悬液注射烟草叶片,并单独以稀释缓冲液注射烟草叶片做阴性对照,光照条件下培养48h后,剪取叶边缘组织在共聚焦成像显微镜下观察拍照.
1.
7.
2RT-PCR检测:收集光照培养48h后含AhompA基因的重组表达载体农杆菌转化子转染的烟草叶片作为实验组,以只含YFP标签的pCAMBIA1300质粒农杆菌转化子转染的叶片为阳性对照组,以只注射稀释缓冲液的烟草叶片为阴性对照组,使用总RNA抽提试剂盒提取实验组及阳性阴性对照组烟草叶片的总RNA,并使用RT-PCR试剂盒通过RT-PCR方法检验AhompA基因的mRNA在烟草叶片中的转录情况.
2结果2.
1PCR结果按照1.
3的方法扩增得到的产物经1%琼脂糖电泳验证,扩增产物在DNA分子量标准的1000bp指示带附近出现预期片段.
2.
2重组克隆载体质粒双酶切鉴定将AhompA基因片段回收,与pEASY-BluntSimple载体连接构建重组克隆载体,重组克隆载体经XbaI和BamHI双酶切处理后经1%琼脂糖凝胶电泳显示,在1kbDNALadderDNA分子量标准1000bp指示带附近出现预期的目的片段以及在4000bp指示带附近出现预期为3830bp左右的载体片段,确定为阳性重组克隆载体.
2.
3AhompA基因序列分析测序结果(GenBank登录号:JN703286)表明,该基因全长1035bp,存在唯一开放阅读框,1-1032位编码344个氨基酸.
经同源性比较得出,与嗜水气单胞菌Ah41菌株外膜蛋白A前体基因(登录号为GU196148)的核苷酸与氨基酸序列的同源性分别为94.
01%、95.
63%.
2.
4重组表达载体质粒双酶切及PCR鉴定将阳性重组克隆载体和只含YFP标签的pCAMBIA1300表达载体分别用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切处理后,回收AhompA基因片段,与双酶切后的表达载体进行连接以构建重组表达载体.
构建的重组表达载体经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切处理后经1%琼脂糖凝胶电泳显示,在1kbDNALadderDNA分子量标准1000bp条带附近出现预期的目的片段以及在大于10000bp条带处出现预期为11000bp左右的载体片段(图1-A).
以重组表达载体为模板,按照1.
3的方法进行PCR鉴定,得到的产物经1%琼脂糖电泳显示,扩增产物的分子量大小约为1000bp(图1-B),与预期值相符,确定为阳性重组表达载体.
681张乐祎等:嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达.
/微生物学报(2012)52(2)图1重组表达载体的双酶切鉴定(A)和PCR鉴定(B)Fig.
1RestrictionenzymedigestionanalysisandPCRanalysisofrecombinantexpressionvector.
A:Restrictionenzymedigestionanalysis,M1.
DNAmoleculemarker1kbDNALadder,1.
recombinantexpressionvector/XbaI+BamHI;B:PCRanalysis,M2.
DNAmoleculemarkerTrans2K,2.
ProductofPCR.
2.
5AhompA基因在烟草叶片中的瞬时表达鉴定2.
5.
1激光扫描共聚焦成像系统成像检测:含AhompA基因的重组表达载体农杆菌转化子转染的烟草叶片作为实验组,以只含YFP标签的pCAMBIA1300质粒农杆菌转化子转染的叶片为阳性对照组,以只注射稀释缓冲液的烟草叶片为阴性对照组.
激光扫描共聚焦成像系统成像检测结果(图2)显示,实验组、阳性对照组及阴性对照组于光照培养48h后观察融合的荧光蛋白表达情况,实验组及阳性对照组均观察到黄色荧光蛋白表达,但阳性对照组的黄色荧光要明显强于实验组,而阴性对照组无黄色荧光.
图2激光共聚焦成像系统观察结果Fig.
2ObservationsbyConfocalLaserScanningMicroscope.
A:theexpressionofYFPinexperimentalgrouptobaccoleafcell.
B:theexpressionofYFPinpositivecontrolgrouptobaccoleafcell.
C:theexpressionofYFPinnegativecontrolgrouptobaccoleafcell.
1.
YFPfluorescence,2.
brightfield,3.
merge.
781LeyiZhangetal.
/ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(2)2.
5.
2RT-PCR检测:以引物YFP-P1和YFP-P2对上述3组不同的烟草叶片进行RT-PCR的结果(图3)显示,实验组转录YFP基因,阳性对照组同样转录YFP基因,而阴性对照组不转录YFP基因,表明构建的含AhompA基因的重组表达载体及只含YFP标签的pCAMBIA1300表达载体在烟草叶片细胞中成功转录YFP基因,该结果同2.
5.
1激光扫描共聚焦成像系统成像检测的结果相符.
以引物AhompA-P1和AhompA-P2对上述3组不同的烟草叶片进行RT-PCR的结果(图4)显示,重组表达载体转染的烟草叶片细胞转录AhompA基因,而只含YFP标签的pCAMBIA1300质粒转染的烟草叶片细胞和只注射图3RT-PCR检测烟草叶片细胞中YFP基因的转录Fig.
3IdentificationofYFPtranscriptionintobaccoleafcellbyRT-PCR.
M.
DNAmoleculemarkerTrans2K,1.
RT-PCRProductofexperimentalgroup,2.
RT-PCRProductofpositivecontrolgroup,3.
RT-PCRProductofnegativecontrolgroup.
图4RT-PCR检测烟草叶片细胞中AhompA基因的转录Fig.
4IdentificationofAhompAtranscriptionintobaccoleafcellbyRT-PCR.
M.
DNAmoleculemarkerTrans2K,1.
RT-PCRProductofexperimentalgroup,2.
RT-PCRProductoftobaccoleafcellwithplasmidpCAMBIA1300carryingYFPgeneonly,3.
RT-PCRProductofnegativecontrolgroupwithdilutionSolution.
稀释缓冲液的阴性对照组不转录AhompA基因,表明构建的含AhompA基因的重组表达载体在烟草叶片细胞中成功转录AhompA基因.
3讨论本研究在烟草叶片中利用植物瞬时表达系统及荧光蛋白融合表达技术,快速可靠的验证了嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A在烟草中的成功表达,这是国内外首次在植物中成功表达嗜水气单胞菌抗原蛋白.
本研究使用的表达载体为经过本实验室改造过的pCAMBIA1300植物表达载体,改造时在原始载体内加入了CaMV35S强启动子和YFP标签,可引入外源基因的多克隆位点位于CaMV35S强启动子下游YFP标签上游,因此在本研究所构建的重组表达载体中,AhompA基因位于CaMV35S强启动子与YFP标签之间,即实现了AhompA基因和YFP基因的融合表达.
植物瞬时表达系统在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛.
并且具有如下优点:1.
简单快速.
转化基因可在转化的一周内进行分析,避免了组织培养等繁杂过程;2.
表达水平高且安全有效,不受植物生长发育过程的影响,不产生可遗传的后代,结果可靠直观,被国内外学者广泛采用进行外源蛋白表达的研究,如:Yutaka等[8]在烟草叶片中成功瞬时表达了多聚γ谷氨酸合成酶复合体,Valentine等[9]利用莴苣瞬时表达外源抗体成功,Jing等[10]在莴苣中瞬时表达出有活性的人干扰素β,吴拥军等[11]同样在生菜中瞬时表达鸡干扰素γ成功,此外丁玉梅[12]等利用自己构建的质粒在马铃薯中成功瞬时表达了绿色荧光蛋白.
荧光蛋白具有检测便捷、无种属特异性、易于和目的基因融合表达及安全可靠等诸多独特的优点,因此被广泛应用于目的基因的转染及表达的检验[13];烟草作为一种常用的模式生物具有生长周期短,培植简单,便于实验操作等优点,有利于分子克隆及分子遗传的研究.
利用植物瞬时表达系统及荧光蛋白融合表达技881张乐祎等:嗜水气单胞菌HBNUAh01外膜蛋白A基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达.
/微生物学报(2012)52(2)术在烟草中表达嗜水气单胞菌外膜蛋白A的成功验证了嗜水气单胞菌外膜蛋白A在植物中进行异源表达的可行性,为进一步开发研究抗嗜水气单胞菌植物性可食疫苗奠定了基础.
在今后的工作中可深入研究嗜水气单胞菌外膜蛋白A在可食植物中的稳定遗传,将获得的稳定遗传可食植物转化子进行组织培养进而获得具有可以稳定表达嗜水气单胞菌外膜蛋白A的整个植株,并对其表达的作为抗原的嗜水气单胞菌外膜蛋白A进行免疫效价检测.
许多相关报道指出水产饲料中使用植物性成分具有多种优点,因此后续试验可继续研究筛选最理想的可食用植物遗传宿主以便用于水产饲料加工,最终达到利用植物性可食疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产疾病的效果.
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/ActaMicrobiologicaSinica(2012)52(2)TransientexpressionofAeromonashydrophilaHBNUAh01outermembraneproteinAgeneintobaccoleafcellsLeyiZhang,CaixiaSun,YaningZhang,JunqingYang,BaohuaZhao*(CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050016,China)Abstract:[Objective]TocloneoutermembraneproteinA(ompA)genefromAeromonashydrophilaHBNUAh01andtransientlyexpressthisproteinintobacco(Nicotianatabacum)leafcells.
[Methods]A.
hydrophilaoutermembraneproteinA(AhompA)genewasamplifiedbyPCRusingA.
hydrophilaHBNUAh01cellsastemplate,andclonedintothepEASY-BluntSimplevectorforsequencing.
Aftersequenceconfirmation,AhompAgenewasinsertedintoexpressionvectorpCAMBIA1300containingayellowfluorescentprotein(YFP)gene,toobtainarecombinantexpressionplasmid.
TherecombinantexpressionplasmidwasintroducedintoAgrobacteriumtumefaciensGV3101competentcells,andthepositiveclonesweretransfectedtotobaccoleafcells.
TheexpressionofyellowfluorescentproteinfusedwithAhompAwasobservedbyConfocalLaserScanningMicroscope,andthemRNAofAhompAwasdetectedbyRT-PCR.
[Results]TheAhompAgeneclonedfromA.
hydrophilaHBNUAh01was1032bp.
ThefusionproteinofAhompAandYFPwassuccessfullyexpressedintobaccoleafcells.
[Conclusion]ThesuccessfulexpressionoftheAhompAgeneintobaccoleafcellshaslaidafoundationforfurtherinvestigationofpreventionoflimnobiosdiseasescausedbyA.
hydrophilawithplantvaccine.
Keywords:Aeromonashydrophila,outermembraneprotein,yellowfluorescentprotein,tobacco,transientexpression,plantvaccine(本文责编:张晓丽)SupportedbytheProvincialProgramsforScientificandTechnologicalResearchofHebei(06780503)*Correspondingauthor.
Tel:+86-311-80789712;Fax:+86-311-80789710;E-mail:zhaobaohua86178@sohu.
comReceived:7October2011/Revised:檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶18December2011科学出版社新书推介(2011年9、10月)田波病毒学文选田波著;978-7-03-032260-9;定价:288;开本:A4内容简介:本书由迄今为止田波院士发表的两百多篇论文中选取一百二十七篇集结出版,收载了田波院士在亚病毒、植物病毒、医学与动物病毒研究方面几十年来最重要、最具代表性的论文,展现了田波院士在病毒学各个分支领域取得的非凡成就,同时也反映了我国在上述研究领域的创新成果.
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