收稿日期:2019-05-09

录用日期:2019-08-09基金项目:国家自然科学基金面上项目(81673455,81673290);国家自然科学基金青年基金(81602953)*通信作者:liubo2400@163.
comdoi:10.
6043/j.
issn.
0438-0479.
201905010自噬启动因子ULK1的生物学功能与靶向治疗研究进展张岚1,欧阳亮2,刘博2*(1.
西南交通大学生命科学与工程学院,四川成都610031;2.
四川大学生物治疗国家重点实验室,四川成都610041)摘要:UNC-51样激酶1(ULK1)作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶同时也是哺乳动物中自噬的启动因子,是酵母中Atg1的同源基因.
近年来,大量研究先后揭示了ULK1的结构特征及其复杂生物学功能,并进一步阐明了其调控自噬的途径及其与多种疾病的关系.
最新的研究还发现了一系列靶向ULK1或ULK1调节自噬的小分子化合物,为开发新的靶向自噬的候选药物提供了一定的线索.
本文综述了ULK1作为自噬启动因子的复杂生物学功能,ULK1与多种疾病的关系及其潜在的靶向治疗应用.
关键词:ULK1;自噬;自噬通路;疾病;小分子化合物;靶向治疗中图分类号:R96文献标志码:A自噬是一种高度保守的溶酶体降解过程,负责消化细胞内的长寿蛋白及受损细胞器.
自噬过程被35个自噬相关(ATG)基因所调控[1],其中Atg1是第一个被发现的酵母自噬蛋白,同时它也是Atg蛋白中唯一一个丝氨酸/苏氨酸激酶[2].
ULK1作为Atg1在哺乳动物中的同源蛋白,具有与Atg1相同的自噬启动功能[3].
已有研究表明,ULK1是自噬初始启动步骤的主要调控子,它与粘着斑激酶家族相互作用蛋白200KD(FIP200),自噬相关蛋白13(mAtg13)和自噬相关蛋白101(Atg101)相互作用形成ULK复合体,ULK复合体的激活可以进一步促进自噬体的形成.
通常情况下,ULK复合体的形成也是自噬过程所必需的.
近年来的研究表明,除了参与ULK复合体的形成,ULK1还可以被多种上游信号通路所调控,如自噬相关蛋白的磷酸化、泛素化和乙酰化等[4,5].
同时ULK1还参与调控了多种自噬信号通路及非经典信号通路,并且ULK1及其调控的信号通路还与肿瘤、神经退行性疾病、感染性疾病等多种疾病的发生发展密切相关[6].
此外,最近的研究发现了大量直接或间接靶向ULK1调节自噬的小分子化合物用于疾病的靶向治疗[7,8].
在本综述中,我们主要讨论了ULK1作为自噬启动因子如何调控ULK复合体及其相关的自噬通路,以及ULK1与各种疾病的关系,并进一步揭示了其作为潜在药物靶标在靶向治疗领域的应用前景.
1ULK1的生物学功能1.
1ULK1的结构ULK1作为一种细胞质激酶,是Atg1基因在哺乳动物中的同源物,它与Atg1的序列相似度为29%.
ULK1由1050(人源)或者1051(鼠源)个氨基酸组成,分子量为112.
6或113kDa[3,9].
ULK1的结构由一个N端激酶结构域(KD)(第16~278位氨基酸残基),一个脯氨酸/丝氨酸(PS)结构域和一个C端结构域(CTD)(第833~1050位氨基酸残基)组成.
ULK1的KD结构域主要负责激酶活性的催化,而CTD结构域包含两个微管作用和转运(MIT)结构域,主要负责ULK1与mAtg13和FIP200的相互作用[9].
另外,PS结构域中约包含500个不保守的氨基酸,该区域由于富含较多的脯氨酸和丝氨酸,因此将其命名为PS结构域,该区域主要负责ULK1与LC3蛋白的相互作用以及上游激酶对ULK1的磷酸化修饰[9](图1A).
目前,ULK1的KD结构域的晶体结构已经被解析,其主要包含一个典型的折叠结构,与蛋白激酶A(PKA)的KD结构域具有相似的特征,而此区域通常在蛋白激酶家族中较为保守.
ULK1的KD结构域主要包含两个环状折叠结构,分别为C端螺旋结构和由五个β折叠链和一条α螺旋组成的N端结构.
此外,ATP通过与两个裂片之间形成的裂口结合,被环状结构(P-loop)或(Gly-richloop)的盖子盖住[8](图1B).
哺乳动物基因组共包含5个Atg1同源物,分别为ULK1,ULK2,ULK3,ULK4和STK36,其中只有ULK1和ULK2在整个蛋白质长度上表现出广泛的序列相似性,而ULK3,ULK4和STK36只在激酶结构域与Atg1基因具有一定的序列相似性[2].
由于ULK2与ULK1具有52%的序列相似性,以前人们认为ULK2也参与细胞自噬的调控,在自噬体形成的最初的步骤中起着必要的作用.
然而,通过基于激酶特异性siRNA表达文库的筛选,发现在氨基酸饥饿诱导的HEK293细胞自噬中敲除ULK1可以抑制细胞自噬,而敲除ULK2则不会抑制细胞自噬,确认了在哺乳动物自噬中起作用的是ULK1,而不是ULK2[10].
随后的研究发现ULK1/2在细胞和动物水平表现为功能冗余,即当ULK1的作用逐渐减弱时,ULK2的作用可能相应增强,两者调控自噬启动的功能可以相互补充[11].
虽然ULK1和ULK2在大部分组织中广泛分布和表达,但是特定的ULK亚型可以在特定的细胞环境中发挥主导作用.
例如,ULK1敲除小鼠在红细胞发育和原代肝细胞线粒体自噬过程中均存在缺陷,说明ULK2与ULK1的功能并不完全相同[4,12].
(A)ULK1的结构组成(B)ULK1激酶域晶体结构图1ULK1的结构组成及激酶域晶体结构Fig.
1ThestructureofULK1andthecrystalstructureofkinasedomain1.
2ULK复合体ULK1可以和mAtg13,FIP200和Atg101形成ULK复合体,并进一步激活下游自噬信号通路,促进自噬体的形成.
2008年,FIP200首次被发现在哺乳细胞中与ULK1存在直接的作用,是参与自噬体形成的关键因素[13].
随后,有研究者发现mAtg13可以参与ULK复合体的形成,与ULK1和FIP200存在直接相互作用,其中mAtg13与ULK1的CTD结构域相结合[14].
进一步的研究又确定了mAtg13通过其C端一个极其短的肽链(Thr478、Leu479和Gln480)与ULK1相互作用[15].
在正常情况下,mAtg13和FIP200都可以单独参与调节ULK1激酶的活性,但在mAtg13和FIP200协同作用下,可以最大程度地激活ULK1的活性.
随后,研究发现在哺乳动物细胞中Atg101作为mAtg13的附属蛋白,可以和ULK1、mAtg13、FIP200形成一个四重复合体[16].
有趣的是,目前还未在酵母中发现Atg101的同源物或功能相似的蛋白[17].
目前为止,Atg101在自噬中的作用还不是十分清楚,但最新研究发现Atg101-Atg13HORMA复合体中的C端结构域是桥接ULK1复合体与PI3K复合体相互作用的关键区域,Atg101的C端结构域的缺失会显著影响与PI3K复合体的相互作用及自噬体的形成[18].
1.
3ULK1与自噬相关通路的关系1.
3.
1ULK1的上游自噬相关通路ULK1是一种在哺乳动物细胞的自噬体膜上广泛表达的蛋白激酶[19],其活性可以被多个上游信号通路所调控.
例如,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)就可以直接参与ULK1活性的调控.
在正常条件下,AMPK处于失活状态,mTORC1可以通过磷酸化ULK1的Ser637/Ser638和Ser757/Ser758位点抑制ULK1的活性,以及通过磷酸化mAtg13的Ser258位点阻止ULK1的激活[20-22].
当营养供给受到限制时,ULK1能够磷酸化TOR1调节相关蛋白(Raptor),阻止mTOR与底物Raptor的结合从而抑制mTORC1信号通路[23].
而AMPK既可以通过磷酸化Raptor解除mTORC1对ULK1的抑制作用,也可以直接磷酸化ULK1的多个位点来激活ULK1[4,21].
此外,在饥饿诱导条件下,蛋白激酶Cα(PKCα)与ULK1相互作用,并磷酸化ULK1的Ser423位点阻断自噬,而PKCα对ULK1的磷酸化并不会影响ULK复合体和ULK1激酶的活性,而是通过降低ULK1与突触融合蛋白17(STX17)的亲和力阻断自噬体-溶酶体的融合从而抑制自噬[24].
在长期的饥饿的条件下,ULK1在Thr180位点的自身磷酸化可以促进KLHL20对ULK1的泛素化以及对ULK1和VPS34复合体成分的降解,而这一过程有助于自噬的中止,防止过度自噬的发生[25].
最近一项研究还发现丝裂原激活的蛋白激酶15(MAPK15)是ULK复合体的一部分,并可以通过调控ULK1的磷酸化增强ULK复合体活性,调节自噬过程的早期阶段[26].
除了上述磷酸化调控,ULK1还会受到泛素化、乙酰化和糖基化等调控.
例如,自噬和Beclin1调节因子1(AMBRA1)可以与一种E3泛素连接酶―肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)形成复合物,对ULK1的Lys63位点进行泛素化调控其稳定性与激酶活性[5].
此外,一种分子伴侣样蛋白p32可以和ULK1形成复合物调控ULK1的稳定性,而p32的缺失会增强ULK1在Lys48位点的泛素化,同时抑制Lys63位点泛素化,导致蛋白酶体将ULK1降解[27].
有趣的是,研究发现神经前体细胞表达发育下调基因4样蛋白(NEDD4L)可以对ULK1的Lys925和Lys933位点进行泛素化,使其被蛋白酶体降解,防止细胞受到过度自噬而死亡[28].
而在某个未知蛋白激酶的作用下,ULK1的Ser929,Ser930和Thr931位点被磷酸化,有助于NEDD4L对ULK1的泛素化和降解[29].
在亚硒酸盐诱导的线粒体自噬中,线粒体E3泛素蛋白连接酶1(MUL1)可以与ULK1相互作用,促进ULK1形成Lys48多聚泛素链,进而通过泛素-蛋白酶体途径将ULK1降解[30].
此外,泛素特异性肽酶24(USP24)可以通过影响ULK1的泛素化和蛋白稳定性来调控自噬,敲减USP24可以显著提高ULK1的表达水平并提高细胞自噬通量[31].
泛素特异性肽酶1(USP1)是调节ULK1的Lys63位点去泛素化的关键分子,抑制USP1可以降低ULK1蛋白的表达并阻断经典的自噬途径,但却可以激活一种非经典自噬途径来降解p62蛋白[32].
而泛素特异蛋白酶20(USP20)被发现可以通过去泛素化结合并稳定ULK1,从而阻止ULK1被溶酶体降解,这一过程对饥饿诱导的自噬启动是不可或缺的[33].
除了对ULK1的泛素化修饰,在生长因子缺乏的条件下,HIV-1Tat相互作用蛋白60kD(TIP60)的Ser86位点会被糖原合成酶激酶3(GSK3)磷酸化后,TIP60能够通过乙酰化ULK1调节其活性,此过程并不是单一模式的调节,而是通过GSK3-TIP60-ULK1通路连接了两种不同的修饰模式--磷酸化和乙酰化[34].
除此之外,最新研究发现ULK1的Thr754位点可以被N-乙酰葡糖胺转移酶OGT糖基化,这对ULK1与Atg14的结合,对Atg14的磷酸化以及VPS34的激活和吞噬泡的形成等过程非常重要[35].
除此之外,还有一些转录因子或蛋白可以直接调控ULK1的表达,进而调控细胞自噬.
例如,ULK1是转录激活因子4(ATF4)的直接转录靶点,在缺氧或内质网应激刺激下,ATF4可以上调ULK1的mRNA和蛋白表达水平,激活细胞自噬[36].
另外,在信号转换器和转录激活器1(STAT1)缺失的细胞中,ULK1的mRNA和蛋白水平以及自噬水平均明显提高,表明STAT1可以负调控ULK1的表达,抑制细胞自噬的发生[37].
1.
3.
2ULK1的下游自噬相关通路ULK1及其复合体作为自噬的启动因子,同时还参与调控大量下游自噬相关通路.
例如,Beclin1作为哺乳动物基因编码Atg6的同源蛋白,是ULK1的下游直接靶点,它可以与III型磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3KC3/VPS34)和磷脂酰肌醇-3-激酶调控亚基4(PI3KR4/VPS15)结合形成复合体调控自噬.
在氨基酸缺失或者mTORC1受到抑制的条件下,激活ULK1可以磷酸化Beclin1的Ser14位点,提高Beclin1-VPS34-Atg14L复合体的活性,诱导自噬的发生[38].
另外,ULK1可以磷酸化Atg14的Ser29位点,导致Atg14-VPS34复合体的活性增加并激活自噬[39].
最近研究表明ULK1还可以磷酸化Beclin1的Ser30位点,激活Atg14-VPS34复合体,这一过程完全独立于ULK1对Beclin1(Ser14)和Atg14(Ser29)的磷酸化[40].
另外,AMBRA1能够与DLC1结合形成复合体保持失活状态,当自噬启动时,ULK1通过对AMBRA1的磷酸化使其从复合体中解离出来,转位到内质网,与Beclin1-VPS34一起参与自噬体的形成[41].
ULK1在饥饿条件下,原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(Src)和ULK1可以分别磷酸化Atg9的Tyr8和Ser14位点,协同促进Atg9与衔接蛋白复合物1/2(AP1/2)之间的相互作用,诱导Atg9膜泡运输和细胞自噬的启动[42].
ULK1能够磷酸化Atg4B的Ser316位点,降低Atg4B的活性,而蛋白磷酸酶2A(PP2A)可以去除这种磷酸化抑制,因此ULK1介导的Atg4磷酸化和PP2A介导的Atg4去磷酸化可以共同调控Atg4的活性以及LC3-Atg4复合物的形成[43].
卵巢滤泡激素(FLCN)与γ-氨基丁酸受体相关蛋白(GABARAP)可以在卵巢滤泡激素互作蛋白1(FNIP1)或FNIP2的存在下形成FLCN-GABARAP复合物,ULK1可以通过磷酸化FLCN的Ser406,Ser537,Ser542位点调控FLCN-GABARAP复合物的活性,从而调控自噬[44].
在饥饿条件下,ULK1可以磷酸化DENN包含蛋白3(DENND3)的Ser554和Ser572位点,DENND3进一步激活Ras相关蛋白Rab12(Rab12),激活的Rab12与LC3相结合可以促进自噬体转运和诱导自噬[45].
饥饿条件下,ULK1还可以磷酸化蛋白转运蛋白SEC23B(SEC23B)的Ser186位点,阻断SEC23B和F-box/WD重复蛋白5(FBXW5)之间的相互作用,进而抑制SEC23B的降解.
被磷酸化稳定后的SEC23B与SEC24A和SEC24B结合,重新定位于内质网和高尔基体之间的间隙,促进自噬流量[46].
1.
4ULK1调控的非经典信号通路除了参与调控经典的自噬相关通路,ULK1还可以参与一些非经典信号通路的调节,例如,ULK1参与调节特殊压力刺激导致的细胞自噬.
蛋白磷酸酶1D(PPM1D)可以与ULK1直接作用,并对其Ser637位点去磷酸化,激活基因毒性诱导的自噬,这一过程依赖于p53的激活[47].
蛋白酶体抑制或蛋白毒性应激可诱导p62泛素关联域(UBA)中的Ser409位点被ULK1磷酸化,增加p62与泛素的结合亲和力.
有趣的是,这种现象在营养缺乏的条件下并不会发生.
自噬蛋白的多聚泛素化降解依赖于p62的Ser409位点磷酸化,Ser409位点的突变会导致p62的积累,自噬蛋白的异常定位和积聚蛋白清除异常[48].
此外,ULK1还可以参与选择性自噬如线粒体自噬等的调控.
应激诱导蛋白Sestrin-2(SESN2)能够与ULK1作用,促进ULK1对p62蛋白Ser403位点的磷酸化,激活p62介导的选择性自噬[49].
此外,SESN2还可以促进ULK1对Beclin1的Ser14位点的磷酸化,进一步增强Beclin1与Parkin的结合,促进Parkin向线粒体膜的易位,激活线粒体自噬[50].
ULK1与Ras相关蛋白Rab9(Rab9),受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Rip1),线粒体分裂蛋白(Drp1)可以形成复合物,ULK1和Rip1可以分别磷酸化Rab9的Ser179位点和Drp1的Ser616位点,使与Rab9相关的跨高尔基膜被募集到受损的线粒体,通过线粒体自噬将其清除[51].
在缺氧或线粒体解耦的条件下,ULK1可以易位到受损线粒体上并磷酸化FUN14结构域包含蛋白1(FUNDC1)的Ser17位点,加强FUNDC1和LC3的结合,促进线粒体自噬从而清除受损线粒体.
而FUNDC1的突变导致其缺失与ULK1的结合能力,可以防止ULK1转位到线粒体并抑制线粒体自噬[52].
核结构域10蛋白52(NDP52)异位到线粒体或过氧化物酶体,可以定位并激活ULK复合物启动选择性自噬.
NDP52通过与FIP200/ULK1复合物的相互作用诱导线粒体自噬,而TANK结合激酶1(TBK1)可以进一步增强NDP52-ULK复合物之间的相互作用促进线粒体自噬[53].
除了调控自噬之外,ULK1还与凋亡蛋白存在相互调控.
例如,研究发现在急性髓系白血病(AML)中,ULK1为Caspase-3的直接作用底物.
Caspase-3可以通过直接剪切ULK1的Asp485位点,抑制细胞自噬的发生,从而调控表达AML1-ETO9a(AE9a)的胎儿肝细胞的自我更新能力和白血病原性,阻止AML的发生和进展[54].
在活性氧压力应激下,ULK1定位于细胞核内,增强聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)的活性,促进细胞发生坏死性凋亡,并且不依赖于ULK1调控的细胞自噬,在此过程中ULK1激酶的活性对于ULK1的入核以及PARP1的激活十分重要[55].
另外,ULK1还参与一些炎症和应激机制的调控.
例如,循环二核苷酸(CDNs)促进干扰素基因蛋白刺激器(STING)的功能,STING可以将TBK1运送到核内体/溶酶体,并激活干扰素调节因子3(IRF3)和核因子κB(NF-κB),随后STING被ULK1在Ser366位磷酸化,STING的磷酸化可以避免炎症细胞因子的持续产生,预防先天免疫基因的持续转录[56].
此外,I型干扰素受体(IFNR)可以磷酸化ULK1的Ser757位点,ULK1可以在IFNR参与后被激活,从而磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38(MAPKp38)[57].
p38α也被发现可以磷酸化ULK1的Ser757位点并降低ULK1激酶活性,阻止其与下游效应蛋白Atg13结合,降低了神经小胶质细胞的自噬水平,促进细胞的炎症反应[58].
含缬酪肽蛋白(VCP/p97)突变是家族性包涵体肌病(IBM)最常见的病因,研究发现ULK1/2可以定位于应激颗粒并磷酸化VCP的Ser13,Ser282,Thr761位点,增加VCP蛋白的活性,增强其分解应激颗粒的能力[59].
另外,ULK1可以对其底物蛋白细胞分裂周期蛋白37(Cdc37)的Ser339位点磷酸化,降低Cdc37与下游靶激酶的相互作用,抑制靶激酶的稳定性,从而提高肿瘤细胞对热休克蛋白90(HSP90)抑制剂的敏感性[60].
此外,ULK1/2还可以在发育中的小鼠前脑中通过非经典途径共同调控轴突导向,而缺乏ULK1/2的小鼠中枢神经系统在轴突寻路方面存在缺陷[61].
研究还发现缺失ULK1/2会导致神经元死亡,这可能是细胞内的未折叠蛋白反应(UPR)导致的.
进一步研究发现,ULK1/2可以磷酸化蛋白转运蛋白Sec16A(SEC16A)的Ser469位点,调控特异性底物从内质网到高尔基体的转运.
而在ULK1/2缺失的细胞中,内质网-高尔基体转运功能的缺陷会激活UPR,诱导神经元的死亡[62].
综上,我们将ULK1调控的自噬信号通路总结详见图2,ULK1及相关底物蛋白的修饰方式总结详见表1.
图2ULK1复合体的翻译后修饰及其调控的信号通路Fig.
2Post-translationalmodicationsoftheULK1complexanditsregulatorysignalingpathways表1ULK1复合体及ULK1调控的自噬通路的翻译后修饰方式Tab.
1Post-translationalmodificationsoftheULK1complexandautophagicpathwaysregulatedbyULK1底物蛋白修饰方式修饰位点修饰酶文献ULK1磷酸化S637,S757/S758mTOR[20,21]磷酸化S317,S467,T575,S637/S638,S555,S777AMPK[4,21]磷酸化S423PKCα[24]去磷酸化S637PPM1D[47]磷酸化S757IFNR[57]磷酸化S757p38α[58]自身磷酸化T180ULK1[25]泛素化K63TRAF6[5]泛素化未知KLHL20[25]泛素化K925,K933NEDD4L[28]泛素化K48MUL1[30]去泛素化未知USP24[31]去泛素化未知USP1[32]去泛素化未知USP20[33]乙酰化K162,K606TIP60[34]糖基化T754OGT[35]mAtg13磷酸化S318ULK1[21]磷酸化S258mTOR[22]磷酸化S224AMPK[22]mTOR磷酸化S2481ULK1[23]Raptor磷酸化S855,S859,S863,S792ULK1[23]Beclin-1磷酸化S14/S15,S30ULK1[38,40]Atg14磷酸化S29ULK1[39]Atg9磷酸化S14ULK1[42]AMBRA1磷酸化S52mTOR[5]Atg4B磷酸化S316ULK1[43]FLCN磷酸化S406,S537,S542ULK1[44]DENND3磷酸化S554,S572ULK1[45]SEC23B磷酸化S186ULK1[46]p62磷酸化S409,S403ULK1[48,49]Rab9磷酸化S179ULK1[51]FUNDC1磷酸化S17ULK1[52]STING磷酸化S366ULK1[56]VCP磷酸化S13,S282,T761ULK1[59]Cdc37磷酸化S339ULK1[60]SEC16A磷酸化S469ULK1[62]2ULK1与疾病的关系ULK1及其调控的细胞自噬信号通路与多种疾病的发生发展密切相关,近期研究表明ULK1可在多种疾病的治疗中作为候选药物靶点.
在这部分,我们总结了ULK1及其调控的细胞自噬和多种疾病的关系,以及ULK1在疾病发生发展过程中调控的复杂机制.
2.
1ULK1与肿瘤的关系细胞自噬通常被视为一种保护细胞存活的途径,但它也具有抑制肿瘤的功能.
有研究认为自噬的作用会根据肿瘤发展的不同阶段变得不同.
例如,自噬在肿瘤发生的初期可以限制肿瘤细胞的增殖,但在肿瘤形成后又可以应对各种压力刺激从而保护肿瘤细胞的存活、侵袭和转移.
此外,还有研究认为自噬可以通过细胞或组织特异性的方式影响肿瘤的发生.