通读明星h合成图

Hereditas(Beijing)2015年4月,37(4):367―373www.
chinagene.
cn研究报告收稿日期:20141124;修回日期:20150119基金项目:国家青年基金项目(编号:81200082),广东省医学科研基金项目(编号:B2012272)和广东医学院博士启动基金项目(编号:B2011019)资助作者简介:欧阳平,博士,助理研究员,研究方向:医学遗传学.
E-mail:ouyang_ping@126.
com通讯作者:吴柱国,博士,教授/主任医师,硕士生导师,研究方向:临床心血管病学.
E-mail:wugdmc@126.
comDOI:10.
16288/j.
yczz.
14-410网络出版时间:2015-3-1210:40:57URL:http://www.
cnki.
net/kcms/detail/11.
1913.
R.
20150312.
1040.
001.
htmltRNA抑制子对转录因子NKX2.
5提前终止密码子的通读欧阳平1,刘远航2,黄志刚3,齐小娟1,倪倩1,刘亚萍1,宋仁生4,李涛1,吴柱国41.
广东医学院广东省医学分子诊断重点实验室,东莞523808;2.
内蒙古呼和浩特市第一医院急诊科,呼和浩特010050;3.
广东医学院公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室,东莞523808;4.
广东医学院第二临床医学院,东莞523808摘要:人类NKX2.
5基因(NK2homeobox5,NKX2.
5)提前终止密码子(Prematureterminationcodon,PTC)突变会引起房间隔缺损、房室传导阻滞等先天性心脏病.
目前,已报道的NKX2.
5PTC突变有8个(E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X).
为了检测tRNA抑制子是否对PTC突变诱导通读产生有功能的全长蛋白,文章将8个NKX2.
5PTC突变克隆到pcDNA3.
1(-)载体,将NKX2.
5全长和E109X、Q149X及C264X克隆到pEGFP-N1载体,形成NKX2.
5-EGFP融合质粒.
将NKX2.
5-EGFP与对应的tRNA抑制子质粒分别或共转染后观察绿色荧光数量定性判断tRNA抑制子是否诱导通读.
Westernblotting检测通读后全长蛋白和截短蛋白表达并计算通读效率.
Real-timePCR检测NKX2.
5下游重要调控基因Cx43mRNA的表达判断通读后蛋白功能.
结果表明,文章成功构建了8个基于pcDNA3.
1(-)的NKX2.
5表达质粒、4个基于pEGFP-N1的质粒;tRNA抑制子tRNAam能有效通读Q149X、Q170X、Q187X和Q198X,且对后三者的通读效率均在50%以上;tRNAop能有效通读C264X,通读效率约50%左右;tRNAoc不能通读NKX2.
5PTC突变;各通读后样本Cx43mRNA相对表达量增加7%~41.
7%;tRNAam和tRNAop能有效通读NKX2.
5PTC突变,产生具有功能的全长蛋白,但tRNA抑制子对细胞的其他影响还不明确,有待于进一步观察.
关键词:tRNA抑制子;NKX2.
5;提前终止密码子;通读;先天性心脏病ReadthroughontranscriptionfactorNKX2.
5prematurestopcodonbytRNAsuppressorsPingOuyang1,YuanhangLiu2,ZhigangHuang3,XiaojuanQi1,QianNi1,YapingLiu1,RenshengSong4,TaoLi1,ZhuguoWu41.
GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnostics,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China;2.
DepartmentofEmergency,InnerMongoliaHohhotNo.
1Hospital,Hohhot010050,China;3.
DepartmentofEpidemiology,SchoolofPublicHealth,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China;4.
TheSecondClinicalCollage,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China368Hereditas(Beijing)2015第37卷Abstract:HumanNKX2.
5(NK2homeobox5)prematurestopcodon(PTC)mutationscausecongenitalheartdis-easessuchasatrialseptaldefectandatrioventricularblock.
Atpresent,eightNKX2.
5PTCmutationswerereportedasE109X,Q149X,Q170X,Q187X,Q198X,Y256X,Y259XandC264X.
ToobservetheabilityoftRNAsuppressorstoreadthroughNKX2.
5PTCmutationsandproducefunctionalfull-lengthproteins,eightNKX2.
5PTCmutationswereclonedintopcDNA3.
1(-)vectorsandfourfragments(wild-typeNKX2.
5,E109X,Q149XandC264X)wereclonedinpEGFP-N1vectorstoacquireNKX2.
5-EGFPfusingplasmids.
AftertransfectionofNKX2.
5-EGFPwithorwithoutcorrespondingtRNAsuppressorintoHeLacells,thequantityofEGFPwasmeasuredtoconfirmthereadthroughabilityofthePTCs.
NKX2.
5full-lengthandtruncatedproteinexpressionlevelswereexaminedbyWest-ernblottingandthereadthroughefficiencyoftRNAsuppressorsonthePTCswascalculatedrespectively.
TheactivityofNKX2.
5full-lengthandtruncatedproteinwasconfirmedonNKX2.
5targetgene-Cx43mRNAlevelmeasuredbyReal-timePCR.
ThreetRNAsuppressorswereused:tRNAam,tRNAocandtRNAop.
tRNAamcouldsuppressUAG-containingPTCsQ149X,Q170X,Q187X,Q198Xandthereadthroughefficiencyforthelatterthreewasabove50%.
tRNAopcouldsuppressUGA-containingPTCC264Xwith~50%readthroughefficiency.
tRNAocfailedtoreadthroughNKX2.
5PTCmutations.
TherelativeCx43mRNAlevelinallreadthroughsampleswasincreasedto7%–41.
7%.
Inconclusion,tRNAamandtRNAopcouldsuppressNKX2.
5PTCsandinducefunctionalproteinexpression.
However,theeffectsoftRNAsuppressorsoncellularfunctionarenotclearyet,warrantingfurtherre-searches.
Keywords:tRNAsuppressors;NKX2.
5;prematurestopcodon(PTC);readthrough;congenitalheartdisease先天性心脏病(Congenitalheartdisease,CHD)是胎儿时期心脏血管发育异常所致的畸形,其发病率约占出生活产婴儿的1%,是新生儿致死致残的主要原因之一.
先天性心脏病形成的原因很复杂,随着遗传学和分子生物学的发展,发现遗传因素在CHD的发生中影响重大,通过连锁分析、候选基因克隆等方法发现了很多与CHD发生相关的基因或位点,如心脏转录因子NKX2.
5(NK2homeobox5,NKX2.
5)就是与CHD相关的基因之一.
NKX2.
5基因位于人类染色体5q34,包含2个外显子,编码324个氨基酸,蛋白大小为35kDa.
NKX2.
5蛋白具有3类结构域:TN、Homeodomain(HD)和NK结构域[1].
NKX2.
5在心脏发育早期以及成熟心脏的功能维护中起重要的作用[2].
在小鼠模型中,E7.
5时期NKX2.
5在心肌发生板的内胚层和中胚层细胞核中均有高表达.
NKX2.
5-/-的小鼠心脏环化受阻,约在E10.
5时期胚胎死亡[3].
人类NKX2.
5突变引起CHD,产生房间隔缺损(Atrialseptaldefect,ASD)、房室传导阻滞(Atrioventricularblock,AVB)等心脏异常[4].
根据人类基因突变数据库(HumanGeneMutationDatabase,HGMD)报道,NKX2.
5提前终止密码子(Prematureterminationcodon,PTC)突变约占已报道NKX2.
5突变总数的14%,分别是E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X[1,5~10].
尽管ASD可以通过外科手术修复,但AVB无法手术修复且随着年龄增加而严重,甚至发生猝死,所以对NKX2.
5PTCs进行基因修复将有可能从根本阻止以上症状发生.
PTC是指编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后,变成不编码任何氨基酸的终止密码UAA、UAG或UGA,使翻译时多肽链在提前终止密码子处终止,形成比全长蛋白短的截短蛋白[11].
截短蛋白不仅影响蛋白功能,而且在细胞内聚集可能对细胞产生毒性[12].
PTC通读是指通过药物或其他方法使核糖体能够通读PTC,继续翻译直至正常的终止密码子,产生全长蛋白质.
目前主要有药物诱导[13,14]和质粒介导的通读[15],与药物诱导通读相比,质粒介导通读具有通读效率较高,且有可能通过基因重组,彻底修正突变.
tRNA抑制子是具有通读能力的质粒之一,包含tRNAam、tRNAoc和tRNAop三类,分别通读UAG、UAA和UGAPTC突变[15].
tRNA抑制子具有很高的通读效率,目前研究发现能够抑制PTC的都是正常细胞的tRNA抑制子,tRNA抑制子是通读与之同源有意义密码子的必要因素,能够通过非传统的密码子-反密码子结合方式进行碱基配对,但是正常细胞中存在的tRNA抑制子较少.
体外研究第4期欧阳平等:tRNA抑制子对转录因子NKX2.
5提前终止密码子的通读369实验发现,人工合成的人类tRNA抑制子能在体外诱导β-珠蛋白含UAG的PTC通读[16].
在体外培养的细胞中同时转染tRNA抑制子和PTC表达质粒后发现有全长蛋白产生[15].
本研究通过检测tRNA抑制子是否对NKX2.
5PTC突变诱导通读产生有功能的全长蛋白,从而为该类突变导致的房室传导阻滞提供可能的治疗方法.
1材料和方法1.
1材料pEGFP-N1、pcDNA3.
1(-)和表达全长NKX2.
5的质粒WT-NKX2.
5(连在pcDNA3.
1(-))为本实验室保存.
3种tRNA抑制子tRNA-am、tRNA-oc和tRNA-op由OlivierJean-Jean教授惠赠,分别通读UAG、UAA和UGAPTCs,且通读后取代氨基酸为人类丝氨酸.
DNA聚合酶、限制性内切酶、Real-timePCR试剂等购自大连宝生物.
Lipofectamine2000脂质体、DMEM高糖培养基、胎牛血清、细胞用青霉素-链霉素双抗和TRizol等均购自Invitrogen公司.
高纯DNA质粒抽提试剂购自Omega公司.
NKX2.
5抗体购自SantaCruz,GAPDH抗体和二抗购自武汉博士德.
1.
2方法1.
2.
1引物设计与合成全长NKX2.
5克隆到pEGFP-N1的引物(F/XhoI和/BamHI)、NKX2.
5PTC各定点突变引物以及Real-timePCR使用的Cx43和GAPDH引物见表1.
引物由Invitrogen公司合成.
1.
2.
2质粒构建NKX2.
5-EGFP质粒用于检测tRNA抑制子通读可行性的定性分析,WT-NKX2.
5-EGFP采用常规酶表1本研究使用的引物序列引物名称引物序列(5′→3′)用途F/XhoⅠagatCTCGAGatgttccccagccctgctctc*构建WT-NKX2.
5-EGFP质粒R/BamHⅠcggtGGATCCccccaggctcggataccatgcag*F-Cx43AGGAGTTCAATCACTTGGCG检测Cx43mRNA表达R-Cx43GAGTTTGCCTAAGGCGCTCF-GAPDHAAGCCCATCACCATCTTCCAG检测GAPDHmRNA表达R-GAPDHAGGGGCCATCCACAGTCTTCTE109X-FCTAGAGCCTAAAAGAAAGAGCTGTGCGCGC构建E109X和E109X-EGFP质粒E109X-RTTTCTTTTAGGCTCTAGGGTCCTTGGCTGGQ149X-FGCAGGCGTAGGTCTATGAGCTGGAGCGGC构建Q149X和Q149X-EGFP质粒Q149X-RCATAGACCTACGCCTGCGAGAAGAGCACGQ170X-FGAACGCGACTAGCTGGCCAGCGTGCTGAAAC构建Q170X质粒Q170X-RGCCAGCTAGTCGCGTTCGGGGGCCGAQ187X-FCTGGTTCTAGAACCGGCGCTACAAGTGCAAG构建Q187X质粒Q187X-RGCCGGTTCTAGAACCAGATCTTGACCTGCGTGQ198X-FGCAGCGGTAGGACCAGACTCTGGAGCTGGTG构建Q198X质粒Q198X-RTCTGGTCCTACCGCTGCCGCTTGCACTTGY256X-FCCCCGCCTAACCGGGTTACGGCGGCGCG构建Y256X质粒Y256X-RAACCCGGTTAGGCGGGGTAGGCGTTATAACCGY259X-FCGGGTTAAGGCGGCGCGGCCTGCAGC构建Y259X质粒Y259X-RCGCGCCGCCTTAACCCGGATAGGCGGGGTAGGCGC264X-FCGGCCTGAAGCCCTGGCTACAGCTGCACTGC构建C264X和C264X-EGFP质粒C264X-RGCCAGGGCTTCAGGCCGCGCCGCCGTAAC注:*大写加粗的为酶切位点;粗体下划线指PTC所在位置.
370Hereditas(Beijing)2015第37卷切连接方法构建,其他质粒采用定点突变的方法构建.
PCR反应体系和程序参照试剂盒说明书进行.
各PTC突变构建质粒以突变位点所在氨基酸位置命名,克隆到pcDNA3.
1(-)的质粒依次命名为E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X,分别表达截短蛋白分子量约为11、16、18、20、22、28、28.
4和29kDa,通读后NKX2.
5全长蛋白约为35kDa.
克隆到pEGFP-N1的质粒命名为E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP,分别表达截短蛋白分子量约为11、16和29kDa,通读后NKX2.
5-EGFP全长蛋白分子量约为62kDa.
所有质粒均经过双向测序验证.
1.
2.
3细胞转染HeLa细胞培养和转染按照常规方法进行.
6孔板转染时每孔转染量如下:NKX2.
5表达质粒或空载体2μg;共转染实验时,E109X、Y256X和Y259X分别与tRNAoc共转染,Q149X、Q170X、Q187X和Q198X分别与tRNAam共转染,C264X与tRNAop共转染,突变表达质粒与tRNA抑制子各2μg.
每组平行做3个复孔.
1.
2.
4通读效率tRNA抑制子的通读效率根据Westernblotting结果进行如下计算来评估:tRNA抑制子的通读效率="全长蛋白/(全长蛋白+截短蛋白)*100%".
1.
2.
5Real-timePCRCx43是一个间隙蛋白,在细胞通讯中发挥重要作用.
Cx43是NKX2.
5的重要下游基因[17,18],拟通过检测Cx43mRNA表达变化判断通读后蛋白活性.
根据Westernblotting结果可知tRNA抑制子能通读5个(Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X)NKX2.
5PTC突变,进一步的通读后蛋白功能实验分成两组:组1,分别转染WT-NKX2.
5、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X;组2,WT-NKX2.
5、Q149X、Q170X、Q187X和Q198X分别与tRNAam共转染,WT-NKX2.
5、C264X分别与tRNAop共转染.
另设计非转染空白对照、pcDNA3.
1(-)空载体对照和单转tRNA抑制子对照,每样本做3个平行复孔.
细胞收集、总RNA提取和RNA反转录按常规方法,分别用Cx43和GAPDH引物扩增进行半定量实验,每样本平行做3个复孔.
1.
2.
6统计学方法通读前后Cx43mRNA的变化采用配对t检验分析,P<0.
05为数据有显著意义.
2结果与分析2.
1tRNA抑制子诱导NKX2.
5-EGFP通读表达全长蛋白单独转染E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C64X-EGFP的细胞未观察到绿色荧光.
在tRNA抑制子共转后,Q149X-EGFP和C64X-EGFP组观察到较强的绿色荧光,E109X-EGFP无荧光产生(图1).
进一步通过Westernblotting检测单转和tRNA抑制子共转染后样本的蛋白表达情况.
WT-NKX2.
5-EGFP、E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP表达蛋白分子量分别在62、11、16和29kDa左右.
Westernblotting结果(图2)显示,E109X-EGFP、Q149X-EGFP和C264X-EGFP均检测不到全长蛋白,C264X可检测到截短蛋白表达.
转染tRNA抑制子后,Q149X-EGFP和C264X-EGFP可检测到全长蛋白表达,且C264X-EGFP可同时检测到截短蛋白,但E109X-EGFP未检测到蛋白.
此外,所有样本均未检测到大于62kDa的蛋白.
这些结果说明tRNAam能有效通读UAGPTC,tRNAop能高效通读UGAPTC,且两者均能在EGFP正常终止密码子处终止,但tRNAoc不能通读UAAPTC.
2.
2tRNA抑制子通读NKX2.
5PTC突变为进一步确定tRNA抑制子对NKX2.
5-EGFP的定性实验结果,本文将8个NKX2.
5表达质粒E109X、Q149X、Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X进行单转染、与对应tRNA抑制子共转染后检测蛋白表达.
结果显示,Q170X、Q187X、Q198X、Y256X、Y259X和C264X表达蛋白大小与预期一致(图3A).
共转tRNA抑制子后,Q170X、Q187X和Q198X检测到了全长蛋白、截短蛋白和比全长更大的非特异性蛋白;Q149X检测到全长蛋白(图3B),表明tRNAam能高效通读UAG类PTC,检测到大于35kDa的蛋白提示可能存在通读过NKX2.
5正常终止密码子的"过通读"现象.
C264X检测到了全长蛋白和截短蛋白(图3B),说明tRNAop能诱导UGA第4期欧阳平等:tRNA抑制子对转录因子NKX2.
5提前终止密码子的通读371图1tRNA抑制子通读NKX2.
5-EGFP融合质粒图2Westernblotting检测NKX2.
5-EGFP蛋白类PTC通读,并且无过通读.
E109X、Y256X和Y259X均未见全长蛋白,这与E109X-EGFP的定性实验结果一致,说明tRNAoc不能诱导UAA类PTC的通读.
tRNAoc的通读效率为0;tRNAam对Q170X、Q187X和Q198X的通读效率均在50%以上,对Q149X的通读效率因为截短蛋白的未能检出而无法正确评估;tRNAop的通读效率约为50%.
2.
3Cx43mRNA表达变化用突变表达质粒与WT-NKX2.
5中Cx43mRNA表达量比值(%)来评估通读后蛋白活性.
单转染Q149X、Q170X、Q187X、Q198X和C264X的比值分别是32%、37.
7%、38.
3%、31%和21.
7%,共转染tRNA抑制子后分别为46%、46.
7%、45.
3%、72.
7%和37.
7%.
Cx43mRNA相对表达量上调了7%~41.
7%,其中Q198X增加41.
7%,其余突变活性增加在7%~16%(图4),且通读前后Cx43mRNA差别具有统计学意义(P<0.
05),表明tRNA抑制子通读后的蛋白均具有活性.
3讨论NKX2.
5-EGFP通读后高效表达绿色荧光蛋白及Westernblotting结果证明,tRNA抑制子tRNAam和tRNAop均能高效通读NKX2.
5对应的PTC突变.
从对正常终止密码子有无影响而言,本研究发现tRNAop优于tRNAam.
tRNAop不能通读EGFP和NKX2.
5的正常终止密码,然而tRNAam在正常终止密码子处终止的能力与基因有关.
tRNAam不影响EGFP正常终止密码子(图2),但对NKX2.
5Q170X、Q187X和Q198X,通读后产生了极少量比NKX2.
5全长更大的蛋白,说明tRNAam存在少量的"过通读"(图3B).
从通读效率来看,tRNAam比tRNAop通读效率略高,前者对NKX2.
5Q170X、Q187X和Q198X的通读效率均大于50%,后者对C264X的通读效率为50%左右.
另外,tRNAoc不能通读E109X、Y256X和Y259X,该结果与前人报道的一致,可能因为UAA是三类终止密码子中最强的终止信号,很难通过[19].
372Hereditas(Beijing)2015第37卷图3tRNA抑制子高效诱导截短突变表达全长蛋白A:8个NKX2.
5提前终止突变表达质粒单转时蛋白表达;B:8个NKX2.
5提前终止突变表达质粒与对应tRNA抑制子共转染后蛋白表达.
图4tRNA抑制子通读前后Cx43mRNA相对表达量变化WT-NKX2.
5的活性定义为100%.
tRNA抑制子通读后能营救部分NKX2.
5蛋白功能.
人类心脏转录因子NKX2.
5具有3个重要的功能域:TN结构域(10~21位氨基酸)、Homeobox结构域(139~197位氨基酸)和NK结构域(210~233位氨基酸)[1],其中Homeobox结构域保守性最强,与转录活性有关.
tRNA抑制子能有效通读NKX2.
5已报道的5个PTCs,其中有3个(Q149X、Q170X和Q187X)位于Homeobox结构域,另外两个突变(Q198X和C264X)不在结构域中.
本研究中tRNA抑制子通读后原PTC位点处氨基酸都将被人类丝氨酸取代,因此,理论上通读后Q198X和C264X的蛋白功能应更接近野生蛋白,而Q149X、Q170X和Q187X蛋白功能可能由于被取代位点十分保守而受到较大影响.
Kasahara等[17]报道NKX2.
5蛋白过表达抑制Cx43基因表达,而本研究结果表明外部转染的野生型NKX2.
5较突变明显促进Cx43的基因表达,究其原因,本研究采用的是非心肌细胞背景的HeLa细胞,而其他研究是在心肌细胞系或转基因鼠中进行[18].
tRNA抑制子通读NKX2.
5突变后可以部分恢复NKX2.
5的活性,促进Cx43的基因表达.
已通读的5个蛋白中Q198XCx43mRNA相对表达量最高,蛋白功能恢复最理想,由通读前的31%增加至72.
7%,增幅为41.
7%;C264X由21.
7%增加至37.
7%,增幅16%,Q149X、Q170X和Q187X增加7%~14%.
相比药物诱导的PTC通读,tRNA抑制子的通读高效性是较高的,如已报道的氨基糖苷类抗生素庆第4期欧阳平等:tRNA抑制子对转录因子NKX2.
5提前终止密码子的通读373大霉素的通读效率为12%左右,明星小分子PTC124孤儿药物的通读效率为20%[20],而tRNAam对NKX2.
5UAG的通读效率大于50%,tRNAop对NKX2.
5UGA的通读效率也达到了50%[15].
tRNA抑制子通读的另一个优点是取代氨基酸明确,药物通读是通过降低核糖复合体的保真性,被取代氨基酸可能是任意的,因此可能产生无活性、甚至有毒性的蛋白.
因此可针对特定的PTC突变设计tRNA抑制子,使之通读后恢复成"原始的"氨基酸序列,通读后蛋白与野生型蛋白一致.
然而tRNA抑制子通读也存在不足,有报道称tRNA抑制子存在过通读问题[21],这点与本研究结果一致,解决办法有待进一步研究.
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[DOI](责任编委:宋旭)