菌丝cf蜗牛外挂

第23卷第6期无锡轻工大学学报V01.
23No.
62004年11月JournalofWuxiUniversityofLightIndustrvNov.
2004222'22222222.
.
2.
22=22=一女=一文章编号:1009—038X(2004)06—0096.
04美味牛肝菌深层发酵条件的优化及成分分析邓百万,陈文强(陕西理工学院陕西省资源生物重点实验室,陕西汉中723001)摘要:对美味牛肝菌(Boletusedulis)深层发酵条件及菌丝体主要营养成分进行了分析研究,结果表明,最适培养基配方为:葡萄糖30.
0g,玉米粉20.
0g,酵母膏7.
0g,KH.
P042.
0g,MgS04·7H201.
0g,VBl0.
01mg,CaC032.
0g;最优发酵条件的初始pH值5.
2~5.
8,振荡速度180r/min,培养温度27℃,100mL三角瓶装液量60mL.
并对美味牛肝菌深层培养茵丝体中蛋白质成分、灰分、脂肪、粗纤维、矿物质及多糖等进行了测定和分析.

关键词:美味牛肝菌;深层发酵;优化;成分分析中圈分类号:TQ920.
6文献标识码:AStudyonSubmergedFermentationandAnalysisofMainComponentsofBoletusedulisDENGBai—wan,CHENWen-qiang(ShaanxiKeyLaboratoryofBio-resours,ShaanxiUniversityofTechnology.
Hanzhong723001,China)Abstract:ThispaperexploresthesuitablefermentationconditionsaffectingthemyceliagrowthofBoletusedulis.
Experimentalresultsindicatedthattheoptimumcompositionofthefermentationmediumisasfollowing:glucose30.
0g,Cornmeal20.
0g,yeastextract7.
0g,KH2P042.
0g,MgS04·7H201.
0g,VBl0.
01mgandCaC032.
0g.
Thehighestyieldofmyceliawasobtainedundertheconditionswhentheshakerrotationspeed,pH,temperatureandmediumloadingamountwerecontrolledat180r/min,5.
2~5.
8,27℃,and60mL/100mL,respectively.
Keywords:Boletusedulis;submergedfermentation;optimum;componentsanalysis美味牛肝菌(BoletusedulisBull.
exFr.
)俗称大脚菇,属层菌纲,伞菌目,牛肝菌科,牛肝菌属,分布于四JIf、云南、福建、陕西等地.
其菌肉厚而细软,味道鲜美,营养丰富,是人们最喜欢的野生食用菌之一[1'2].
长期食用能增强机体免疫能力,具抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等作用.
该菌提取物对小白鼠肉瘤180的抑制率为i00%,对艾氏腹水癌的抑制率为90%[3"].
该菌还产生腺嘌呤、胆碱和腐胺等生物碱,可药用,是"舒筋丸"的成分之一,可治疗腰腿疼痛,手足麻木,筋骨不舒,四肢抽搐,是一种食药兼用的山珍品[5].
由于美味牛肝菌是菌根菌,目前不能人工栽培,野生资源不能满足人们的需要,液体发酵获得营养菌丝取代子实体是解决这一问题的有效办法.
为此,对美味牛肝菌深层发酵条件进行了优化研究,对菌丝体主要营养成分及质量进行了分析测定,为开发利用真菌资源提供参考依据.
收稿日期:2004—02—12;修回日期:2004—03—25.
基金项目:陕西省教育厅专项科研基金项目(99JKl09)资助课题作者简介:邓百万(1963一),男,陕西眉县人,副教授.
万方数据第6期邓百万等:美味牛肝茵深层发酵条件的优化及成分分析971材料与方法1.
1材料1.
1.
1实验材料美味牛肝菌子实体采自陕西省佛坪县三官庙乡.
1.
1.
2菌种美味牛肝菌由陕西省资源生物重点实验室食药用菌菌种保藏中心提供.
1.
1.
3培养基1)母种培养基:葡萄糖20.
0g,马铃薯200.
0g,麸皮i00.
0g,KH2P045.
0g,MgS04·7H2O3.
0g,VBll0mg,琼脂20.
0g,水1000mLc引.
2)单因子基础培养基:碳源基础培养基:酵母粉5.
0g,KH2P043.
0g,MgS04·7H201.
5mg,VB.
0.
01mg,CaC032.
0g;氮源基础培养基:葡萄糖20.
0g,玉米粉20.
0g,KH2P043.
0g,MgS04·7H2O1.
5mg,VBl0.
01mg,CaC032.
0g.
1.
2方法1.
2.
1美味牛肝茵茵丝体液体培养1)菌种活化:配制CPDA培养基,分装试管,121.
3℃30min灭菌,放置斜面,接种美味牛肝菌母种,在28℃培养,待菌丝满管后备用.
2)液体培养:配制液体培养基,i00mL三角瓶装液量60mL,121.
3℃30min灭菌,接活化菌种.
在初始pH值4.
6~5.
8,振荡速度180r/rain,培养温度26℃条件下,进行液体发酵培养.
3)菌丝生物量的测重:发酵后的菌丝体经离心过滤并用纯净水冲洗3次,再用滤纸吸至不滴水,用天平精确称重.
4)成分测定的材料处理:菌丝冲洗干净一烘干(80℃)一粉碎一过40目筛一备用.
1.
2.
2成分测定1)灰分测定:采用重量法[6].
2)粗蛋白含量测定:采用微量凯氏定氮法[6].
3)粗脂肪含量测定:采用索氏提取法[6].
4)粗纤维含量测定:采用重量法[7].
5)多糖含量测定:采用苯酚一硫酸法[8].
6)氨基酸含量测定:采用FDBN柱前衍生高效液相色谱法(HPLC—1100型).
层析柱:ZorbaxC18;流动相:磷酸二氢钾和乙腈水溶液Fv(水):V(乙腈)=45:55].
2结果2.
1发酵培养基的筛选2.
1.
1碳源对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响以酵母粉5.
0g,KH2PO.
3.
0g,MgS04·7H2O1.
50mg,VBl0.
01mg,CaC032.
0g为单因子基础培养基,分别以20.
0g的葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、果糖、麦芽糖并附加玉米粉20.
0g为碳源,以基础培养基为对照,接活化菌种1.
0cm2,振荡培养,测定不同碳源对营养菌丝生长的影响(见表1).
表1不同碳源对营养菌丝生长的影响Tab.
1Effectofdifferentcarbonsourcesonthegrowthofnutrient.
mycelia碳源菌丝生物量/(g/L)葡萄糖蔗糖乳糖甘露醇麦芽糖果糖120968075112107表1表明,以葡萄糖、麦芽糖、果糖等作为碳源时,液体发酵菌丝生物量皆高.
在这些碳源中,以葡萄糖为碳源的培养基中菌丝体生物量最高,为120g/L,菌丝球体积小,均匀,密度高.
以乳糖、甘露醇等为碳源的培养基中美味牛肝菌菌丝生长较差,说明这些碳源为非常用糖物质.
确定葡萄糖为美味牛肝菌发酵最适碳源.
2.
1.
2氮源对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响以葡萄糖20.
0g,玉米粉20.
0g,KH2P043.
0g,MgS04·7H201.
5mg,VBl0.
01mg,CaC032.
0g为单因子基础培养基,分别以5.
0g的NH.
NO.
、KNO.
、米糠、豆饼粉、酵母浸出膏、牛肉膏、蛋白胨和水解乳蛋白为氮源,以基础培养基为对照,接活化菌种1.
0crn2,振荡培养,测定不同氮源对营养菌丝生长的影响,结果见表2.
表2不同氮源对营养菌丝生长的影响Tab.
2Effectofdifferentnitrogensourcesonthegrowthofnutrientmycelia氮源菌丝生物量/(g/L)酵母浸出膏牛肉膏蛋白胨水解乳蛋白豆饼粉米糠NH4N03KN03m妻;佰弱驼船弱驰万方数据98无锡轻工大学学报第23卷表2表明,在附加不同氮源培养基中,有机氮源比无机氮源更有利于菌丝生长,以酵母浸出膏为氮源的培养基中菌丝生物量最高,为140g/L,菌丝球体积大小适中,均匀.
在以米糠、豆饼粉,NH.
NOs、KNOs为氮源的培养基中菌丝生长较差,虽然米糠、豆饼粉为有机氮源,但含氮量要低于其它有机氮源,说明培养基中含氮量较低的有机氮源不是美味牛肝菌菌丝生长的最适氮源.
因此,确定酵母浸出膏为美味牛肝菌发酵最适氮源.
2.
1.
3培养基成分综合实验以葡萄糖和玉米粉为碳源,酵母浸出膏为氮源,添加KH:PO.
,MgS04·7H20和VBl0.
01mg,CaCO.
2.
0g进行k(34)正交试验.
根据极差分析结果,影响菌丝体得率的大小关系分别为A>C>D>B.
各因子的最佳水平组合是A383C2D1,因此确定发酵培养基配方为:葡萄糖30.
0g,玉米粉20.
0g,酵母浸出膏7.
0g,KHzP042.
0g,MgS04·7H201.
0g,VBl0.
01mg.
CaCOa2.
0g.
2.
2发酵条件实验2.
2.
1pH值对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响将培养液分别调pH值为4.
6,4.
8,5.
0,5.
2,5.
4,5.
6,5.
8,6.
0,6.
2,接斜面菌种1.
0cm2,在26℃,200r/rain,100mL三角瓶装液量60mL,振荡培养6d.
测定pH值对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见图1).
d3面霹酬裁l翘123456789pH图1pit值对羹昧牛肝菌丝生长的影响l-ig.
1pHeffectOnthegrowthofl幻letusedulismycella图1表明,在pH值5.
8时,菌丝生物量呈下降趋势.
在pH值为5.
2~5.
8之间,菌丝体生长速度维持在较高水平,菌丝生物量较高.
因此,美味牛肝菌液体发酵最适pH值范围为pH值5.
2~5.
8.
2.
2.
2振荡速度对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响选择90,110,130,150,170,190,210r/rain不同振荡速度,接斜面菌种1.
0am2,在26℃,pH值5.
4,100mL三角瓶装液量60mL,振荡培养6d.
测定振荡速度对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见图2).
图2表明,不同振荡速度对美味牛肝菌丝生物量有明显的影响.
随着转速的升高,菌丝生物量升高,在180r/min达到较高,继续增加振荡速度,菌丝生物量增加不明显.
因此,美味牛肝菌液体发酵最适振荡速度为180r/rain.
3马函霹删裂l{随图2振荡速度对美味牛肝菌丝生长的影响Fig.
2ThestirredspeedeffectoilthegrowthofBoletusedulismycella2.
2.
3培养温度对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响选择16,18,20,22,24,26,28,30,32℃发酵温度,接斜面菌种1.
0cm2,在pH值5.
4,180r/min,100mL三角瓶装液量60mL,振荡培养6d;测定培养温度对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见图3).
3马谪霉划斛I酒图3培养温度对美昧牛肝菌丝生长的影响Fig.
3ThetemperatureoffermentationeffectOllthegrowthofBoletusedulismycelia图3表明,不同温度对菌丝生物量有明显的影响.
菌丝生物量在一定范围内随温度的升高而增高,28℃时菌丝生物量达最高,为102.
8g/L,超过28℃菌丝生物量则下降.
因此,美味牛肝茵液体发酵最适培养温度为28℃.
2.
2.
4装液量对美味牛肝茵营养茵丝生长的影响100mL三角瓶中分别选择30,40,50,60,70,80,90mL装液量,接斜面菌种1.
0cm2,在pH值5.
4,180r/min,28℃条件下,振荡培养6d,测定装液量对美味牛肝菌营养菌丝生长的影响(见图4).
图4表明,随着装液量的增加菌丝生物量随之增加,装液量在60mL以上时,菌丝发酵产生难闻的气体;低于60mL时,菌丝生物量较低.
因此,美味牛肝菌液体发酵最适装液量为60mL.
万方数据第6期邓百万等:美味牛肝茵深层发酵条件的优化及成分分析99d3祠嚣划衬l掘图4装液量对美昧牛肝菌营养菌丝生长的影响Fig.
4ThemediumloadingeffectonthegrowthofBo-letusedulismycelia2.
3美味牛肝菌菌丝体主要营养成分测定分析2.
3.
1美味牛肝茵茵丝体主要营养成分表3结果表明,菌丝体含有丰富的蛋白质、多糖和适量的脂肪、纤维和灰分.
菌丝体中的粗蛋白和粗脂肪质量高于野生子实体[93.
特别是粗多糖质量显著高于担子菌纲8种真菌中的粗多糖[1引.
表3美昧牛肝菌菌丝中主要营养成分及质量Tab.
3ThemineralelementsandcontentsofnutrientmyceliaofBoletuseduf妇营养成分质量分数/%灰分粗蛋白粗脂肪粗纤维粗多糖碳水化合物5.
2626.
466.
488.
2310.
6242.
952.
3.
2美味牛肝茵茵丝体中氨基酸种类及质量表4结果表明,美味牛肝菌菌丝体因方法所限未检出色氨酸,在所测定的17种氨基酸中,必需氨基酸和非必需氨基酸种类齐全.
100g美味牛肝菌丝体中必需氨基酸质量是5732.
25rng,必需氨基酸占氨基酸总量的37.
08%.
美味牛肝菌丝体中必需氨基酸的质量普遍高于子实体中必需氨基酸的质量'11].
3结论美味牛肝菌对供试碳源都有不同程度的利用,说明该菌对单糖、双糖、多糖和糖醇都能利用,但以葡萄糖的利用率较高.
美味牛肝菌的菌丝体对铵态表4100g美昧牛肝菌丝体氨基酸种类及质量Tab·4ThetypesandcontentsofaminoacidinmyceliaofBoletusedulis氮很难利用,而对有机氮的利用率高,其中以使用酵母浸出膏和牛肉膏等时其菌丝生长速度较快.
尤其是酵母浸出膏,可促进菌丝大量生长,且菌丝球均匀,密度高.
培养基中加入CaCO.
对培养基pH值起调节作用,Ca2+对菌丝生物量的转化有促进作用.
无机盐KH2P04和MgSO.
·7H.
O,质量比以2:1的比例添加时其菌丝生物量较高.
正交试验的最适培养基是:葡萄糖30.
0g,玉米粉20.
0g,酵母浸出膏7.
0g,KH2PO;2.
0g,MgS04·7H201.
0g,VBl0.
01mg,CaC032.
0g.
美味牛肝菌深层培养的最适发酵条件的初始pH值5.
2---一5.
8,振荡速度180r/rain,培养温度28℃,100mL三角瓶装液量60mL.
美味牛肝菌深层培养的菌丝体主要营养成分质量普遍高于野生子实体m],其中粗蛋白、粗脂肪和粗多糖质量明显高于子实体.
从对食品高蛋白含量要求的角度分析,美味牛肝菌菌丝体的营养价值优于子实体.
按干重计,菌丝体含有17种氨基酸,100g美味牛肝菌丝体中氨基酸总量是15458.
17mg,必需氨基酸占氨基酸总量的37.
08%,以缬氨酸质量最高.
美味牛肝菌深层培养的菌丝体富含氨基酸这一特性证实,可通过深层发酵解决美味牛肝菌野生资源不足的矛盾来满足人们对蛋白食品和营养保健品日益增长的需求.
(下转第102页)万方数据102无锡轻工大学学报第23卷2.
3渗透稳定剂的影响分别用0.
6mol/L的蔗糖j甘露醇、山梨醇和NaCl来配制高渗缓冲液和高渗再生培养基,以研究不同的渗透稳定剂对原生质体形成和再生的影响.
原始菌液为7.
0*108CFU,缓冲液pH值为5.
8,工具酶为Ceiluclast1.
5L,结果见表3.
表3渗透稳定剂的影响Tab.
3Effectofosmoticstabilizers从表3可见,本实验结果与其他研究者报道的结果"在真菌原生质体形成和再生中有机稳定剂的效果好于无机稳定剂,有机稳定剂中蔗糖的效果最好,甘露醇的效果次之"是一致的.
2.
4pH值的影响为研究不同的pH值对酵母菌原生质体形成和再生的影响,作者用0.
6mol/L的蔗糖配制高渗缓冲液和高渗再生培养基,研究缓冲液pH值分别为5.
8,6.
8,7.
2时酵母菌原生质体的产生率和再生率,原始菌液为5.
6*108CFU.
工具酶用Celluclast1.
5L,酶处理时间为1h,结果见表4.
参考文献:表4pH值的影响Tab.
4EffectofpB以Celluclast1.
5L为工具酶时,在酸性条件下,原生质体的产生率和形成率均比较高,其中pH5.
8和PH6.
8原生质体产生率几乎无差异,但是原生质体的再生率还是有一定差异的,pH值为5.
8时的再生率明显高于pH值为6.
8时的再生率.
在pH值超过7.
0后,无论是原生质体的产生率还是原生质体的再生率均大幅度降低,这种情况与酵母菌喜好在偏酸性的环境中生长是一致的.
3结论纤维素酶Celluelast1.
5L可以作为酵母菌原生质体的形成和再生中使用的工具酶,最佳条件是:以pH5.
8的磷酸缓冲液配制的0.
6mol/L蔗糖液为高渗稳定剂,质量分数8%的酶液处理1h,菌龄6h,酶处理后在加0.
6mol/L蔗糖的完全培养基上再生24h.
在这样的条件下,原生质体产生率与再生率与用蜗牛酶做工具酶类似.
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