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一0j第6卷第4轴I991年12月中国翕毒学VIR0LOGICASINICAVo1.
6N0.
tDec.
I991斑点杂交生物素法检测流行性出血热病毒RNA杨占秋李治洪杨平刘薇茜赵文先——(嵩北医学院病毒研究所.
武汉4300_1)J李德新杭长寿(中国预防医学科学院病毒研究所,北京100052)天、,{提要为寻找一种用于检醴6流行性出血热病毒的分子杂交方法,以生物素一7一dATP标记流行性出血热病毒(EHFV)丑.
±株M片段的cDNA丑s克隆作探针,与人源性的EHFVH一114、H一435株RNA基因蛆进行斑点杂交,得到阳性结果.
可检出5pg的eDNA或RNA.
此探针与瘾密病毒DNA不出现杂交信号.
以上结果说明这种标记探针具有EHFV特异性,守核苷酸序列以及EHF病毒的分子结构分析和EHF的基因诊断都要从分子水平对EH'F病毒(EHFV)进行研究.
而按酸分子杂交技术则是主要的研究手段,经典的方法是用放射性同位素对DNA或RNA进行标记而制备核酸探针用于研究,但是同位素半衰期短,且对人体有害,需要严格的操作技术和条件而使其应用、保存受到一定的限制.
因此,在建立EHF的分子杂交方法过程中,我们根据Leavy[I等的报道,采用非放射性的生物素(biotin)标记系统对EHFV的cDNA进行标记,获得成功,现报道如下.
材料与方法一、试捌biotln-7一dATP、dUTP、dGTP、dCTP、gDNA、DNA聚台酶、s一溴~4一氯一3一吲哚碑胺(BcIP),四氮唑蓝(NBT)、生物素化DNA、链亲和素性碱性礴酸酶(SP—AP)、鲱鱼精子DNA均为BRL公司产品.
RNA酶、蛋白酶K、EcoR[购自北京华美生物工程公司二、曩牡DNAEHFARz2株eDNAR3克隆由中国预防医学科学院病毒学研究所供提,其限制性内切酶图谱见文献【¨.
三、瘸毒EHFVH一114、H一435株系我们以前从EHF患者血浆和尿液中分离【I1,经乳鼠脑内增毒后,感染滴度为10TCIDS0/o.
1ml.
HSV和CMV为本室保存病毒株,均存放于一7S℃备用.
四、瘸毒RNA提取将EHFV接种VeTO—E6细胞单层,37℃吸附4小时后,加入Egle's培养奉文于1991年1_月3H收到,19qI{.
3月1口修回.
课臣负责^维普资讯http://www.
cqvip.
com第4蒴杨占秋等;斑点杂交生物紊法捡铡流行性出血热宿毒RN^32i液置37ac培养,第1O天收获感染细胞(同时取少量细胞涂片,IFA检查为阳性时收获),一75ac冻融3次,超声波破碎3劈钟'4℃8a印/皿离心击沉淀,再在嬲哪,∞离心沉淀l小时.
去上清,用等体积饱和酚/氯访懦最燕取襄M,王璩:乙瞎嚣淀,执千溶于量TE缓冲液中,一7s℃存放备用.
五、质粒DNA提职克隆质靴鞲A大脑耔薛MOIl1,扩增-接壹:棘1.
I提取DNA.
以EcoRl水解后,酎/氯仿提取.
无水乙醇沉诺届厢于橱记.
六、探针标记用生物素一7.
dATP魂口鼹译棒记橇藿取量窖芦l样晶eBNA,5|f'l0.
2mmol/LpH7.
8dNTPs(溶于S00atm~-l/LTris-HCl、兜皿刚r/LMgcIf,10@mmol/L2-巯基乙醇100~g/mlBSA).
2.
s芦l生物謇十dATP,—IB眦橐音薛l秘DtCA囊合酶I/DNA酶I及双蒸水17.
sl,1sac孵育90分钟,加:sl鲁舶啦雎口1,LP珏蠢靠~=EDTA瓤1.
墨l15啦SBS,用冷无水乙醇沉淀,即为标记探讣,浓度为l口伽g,ml,一勰存放备甩.
七、瑗素交和杂交将乙畦变住耀静静幢梧书e包瓣Rr~DNA、PUCI8质粒、EHFVRNA.
VE.
细胞RNA、HSV和CMVDNA)l点于蔼灶理好婚确藏纤壤素膜上,8YC千烤固定2小时后,将膜放/~20mmcl/LTriHCI煮器,直熊玲帮唇,将膜转至橐乙烯杂交袋中,加入预杂交溶液(古5喵甲酰胺.
s*SSC、s*Denhardt8、25mmol/L磷酸钠及0.
Smg/ml酢鱼精子DNA),100.
~l/cm42℃4小时后,弃去预杂交溶液,加入热变性探针和耋I}鱼精子DNA.
同时加入杂交溶液(郾顼杂交溶维+s哂硫酸葡聚锫).
42ac过夜.
用2x、0.
2x、0.
1xsssc/o.
1啦SDS各洗两次.
八显色经杂交后洗涤的硝酸纤维素膜用TNM(100mmol/LpH7sTris-HC1、100mmcl/LNacl、50mmcl/LMgCI2)洗一次,放入含3啦BSA(10Ommol/LpH7.
5Tris-HC1,1S~mmol/LNaCI配制)的杂交袋中.
65acl小时.
取出后80ac干燥撼膜lS分钟,加入1.
0~8/mlSA-AP室温IO分钟(0.
07ml/em),用稀释的TN(100mmol/LpH7.
5Tris—HC1、150mmcl/LNaC1)洗膜3次,再用TNM洗一次,加入NBT溶液(33F1NBT加到7.
5mlTNM中)混合后,加入BCIP液,放暗处30分钟观察结果.
九、IFA、ELISA洼按车室常规法I结果一、探针的特异佳斑点染交结果显示生物素一7-dATP标记的EHFVR:株^f片段R,克隆片段探针可与R克隆cDNA和EHFVH一114、H一435株RNA发生阳性杂交反应,呈现棕黑色斑块,而此标记探针与PUC18质粒、正常Verc—E_细胞RNA和HSV、CMVDNA不发生杂交反应,无颜色出现,见图1.
二、斑点杂交与IFA和ELISA法的比较EHFVH一114、H-435株感染的Verc—E_细胞,经IFA检查,出现强阳性荧光在其感染后第lO天,此时i00%的感染细胞均显示特异性的荧光.
而ELISA法测定病毒释放的高峰期(ELISA法检测碡染细胞上清液中可溶性抗原OD值的最高值)也在病毒感染细胞后的第9~13天,病毒抗啄OD值为1.
27~1.
64.
第7、l0、l3天收获的病毒,杂交信号最强电在病毒感染细胞后第l0天,所提取的RNA在1t16稀释时,仍能出现阳性杂交反照,即病毒RNA含量为100pg.
而就敏感性而言,相当于标准DNA5Pg所出现的维普资讯http://www.
cqvip.
com322中国病毒学第6卷杂交信号,或者说斑点杂交可检出5Pg病毒RNA.
讨论目前,用于EHFV0jf究的基因探针多为放放射性同位素标记探针,这种探针特异性强,敏感性高,但是保存期短,使其应用,特别是临床应用受到了一定的限制.
为了对EHFV患者进行基因诊断,并克服放射挂标记探针的某些缺点,我们应用生物素标记系统,对EHFV的基因片段进行标记获得成功,生物素一7-dATP标记的EHFVR株M片段的基因探针与R株的eDNA手u待测的EHFVRNA发生阳性杂交反应.
这说明生物素标记探针可用于EHFV的研究,这种探针还具有放射性标记探针所不及的优点,如操作简便、安全、不需严格的条件,探针可长期保存,应用广泛等.
本研究结果还指出来自子动物源性的EHFVR株M片段R.
克隆探针可与人源性的EHFVH—ll4、H'435株的基因组发生杂反应,这进一步说明动物源性和人源性的EHFV有共同的保守核苷酸序列,R栋的Ra克隆探针可作为EHF的通J=}j探针广泛用于EHF的研究,如EHF的基因诊断,不同毒株间的毒力比较等.
一一~瑟一黼隆_三,坤篙~鋈鎏维普资讯http://www.
cqvip.
com第4期杨占秋等:斑点杂变生物素涪捡谜流行性出血热病毒RNA323斑点杂交与IFA和ELISA法对EHFV的比较检测表明,斑点杂交检测病毒RNA具有与IFA和ELISA法检测感染细胞内外病毒抗原同样的特异性,病毒感染细胞后第10天杂交信号最强,RNA含量约为100pg,而IFA和ELISA法检钡蝻毒抗原也提示病毒增殖高峰娟是在其感染细胞后第9~l3天.
陈等应用P标记探针检测l1株EHFV,有3株IFA和ELISA均提示弱阳性,而斑点杂交显示强阳性,其余8株病毒两种检测方法结果一致,他认为斑点杂交法较IFA法敏感】.
我们的检测发现病毒RNA在1.
16稀释耐,仍出现阳性杂交信号,相当于5pg标准DNA的杂交信号,证实该法是敏感的.
有关本法对EHF患者临床标本中病毒基因组的检测应用正在进行,将另文报道.
(5](6jL…vJJ抗长寿等,杨占秋等,l21一l.
栩占我等.
陈思毅等,参考文靛eta】.
I983,PTOCN口cIAcadSci|80:045.
1988,病毒学报.
4:2081989,由华医学杂志,B9:621.
J.
et41.
,1989,MolecularC]oniB,2ed.
ColdSp'rl.
gltarborLaboratorypress.
ppi98目·枷北医学院学报,i0:雌.
t989,中华微生物学与茕痤学杂志,9:.
DetectionofEpidemicHemgrrhagicFeverVirus(Hantanvirus)RNAGenomewithBiotin—LabeledProbebyDotHybridizationYangZhan—qiuLiLiuWel—qianZhi—hongYangPingZhanWen—xian【V1r"se5eⅡrchJ¨5itute.
tt"beiMedic口ICo!
legoWⅡ自口430071)Dothybridizationassaywasdevelopedtodetectepidemichemorrhagicfevervirus(EHFV)RNAge~omeusingprobewhichbiotin一7一dATPlabeledR一3eDNAcloneofMfragementofEHFVR一22strai~.
ThisprobewasusedtodetectRNAgenomeofthehumanoriginalEHFVH—l14andH435strainsince11cuhures.
Thepositivehybridizationsigna1WaSobtainedfromcellsinfectedEHFVH一114andH一435strains,5PgeDNAorRNACOUldheobtained.
ThisprobedonotreactwithDNAofcellsinfectedherpessimplexviru日andcytome—galovirus.
ItwasshownthatthisprobeWg.
SspecifictoEHFV,andalsocon—taincommonnucleotidesequenceinbothhumanandavlmaloriginalEHFV.
Keywords:BiotinHantanvirusR.
NAgenomeDothybridiza—tjon维普资讯http://www.
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com
6N0.
tDec.
I991斑点杂交生物素法检测流行性出血热病毒RNA杨占秋李治洪杨平刘薇茜赵文先——(嵩北医学院病毒研究所.
武汉4300_1)J李德新杭长寿(中国预防医学科学院病毒研究所,北京100052)天、,{提要为寻找一种用于检醴6流行性出血热病毒的分子杂交方法,以生物素一7一dATP标记流行性出血热病毒(EHFV)丑.
±株M片段的cDNA丑s克隆作探针,与人源性的EHFVH一114、H一435株RNA基因蛆进行斑点杂交,得到阳性结果.
可检出5pg的eDNA或RNA.
此探针与瘾密病毒DNA不出现杂交信号.
以上结果说明这种标记探针具有EHFV特异性,守核苷酸序列以及EHF病毒的分子结构分析和EHF的基因诊断都要从分子水平对EH'F病毒(EHFV)进行研究.
而按酸分子杂交技术则是主要的研究手段,经典的方法是用放射性同位素对DNA或RNA进行标记而制备核酸探针用于研究,但是同位素半衰期短,且对人体有害,需要严格的操作技术和条件而使其应用、保存受到一定的限制.
因此,在建立EHF的分子杂交方法过程中,我们根据Leavy[I等的报道,采用非放射性的生物素(biotin)标记系统对EHFV的cDNA进行标记,获得成功,现报道如下.
材料与方法一、试捌biotln-7一dATP、dUTP、dGTP、dCTP、gDNA、DNA聚台酶、s一溴~4一氯一3一吲哚碑胺(BcIP),四氮唑蓝(NBT)、生物素化DNA、链亲和素性碱性礴酸酶(SP—AP)、鲱鱼精子DNA均为BRL公司产品.
RNA酶、蛋白酶K、EcoR[购自北京华美生物工程公司二、曩牡DNAEHFARz2株eDNAR3克隆由中国预防医学科学院病毒学研究所供提,其限制性内切酶图谱见文献【¨.
三、瘸毒EHFVH一114、H一435株系我们以前从EHF患者血浆和尿液中分离【I1,经乳鼠脑内增毒后,感染滴度为10TCIDS0/o.
1ml.
HSV和CMV为本室保存病毒株,均存放于一7S℃备用.
四、瘸毒RNA提取将EHFV接种VeTO—E6细胞单层,37℃吸附4小时后,加入Egle's培养奉文于1991年1_月3H收到,19qI{.
3月1口修回.
课臣负责^维普资讯http://www.
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com第4蒴杨占秋等;斑点杂交生物紊法捡铡流行性出血热宿毒RN^32i液置37ac培养,第1O天收获感染细胞(同时取少量细胞涂片,IFA检查为阳性时收获),一75ac冻融3次,超声波破碎3劈钟'4℃8a印/皿离心击沉淀,再在嬲哪,∞离心沉淀l小时.
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五、质粒DNA提职克隆质靴鞲A大脑耔薛MOIl1,扩增-接壹:棘1.
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以EcoRl水解后,酎/氯仿提取.
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六、探针标记用生物素一7.
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七、瑗素交和杂交将乙畦变住耀静静幢梧书e包瓣Rr~DNA、PUCI8质粒、EHFVRNA.
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s*SSC、s*Denhardt8、25mmol/L磷酸钠及0.
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同时加入杂交溶液(郾顼杂交溶维+s哂硫酸葡聚锫).
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5Tris-HC1,1S~mmol/LNaCI配制)的杂交袋中.
65acl小时.
取出后80ac干燥撼膜lS分钟,加入1.
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07ml/em),用稀释的TN(100mmol/LpH7.
5Tris—HC1、150mmcl/LNaC1)洗膜3次,再用TNM洗一次,加入NBT溶液(33F1NBT加到7.
5mlTNM中)混合后,加入BCIP液,放暗处30分钟观察结果.
九、IFA、ELISA洼按车室常规法I结果一、探针的特异佳斑点染交结果显示生物素一7-dATP标记的EHFVR:株^f片段R,克隆片段探针可与R克隆cDNA和EHFVH一114、H一435株RNA发生阳性杂交反应,呈现棕黑色斑块,而此标记探针与PUC18质粒、正常Verc—E_细胞RNA和HSV、CMVDNA不发生杂交反应,无颜色出现,见图1.
二、斑点杂交与IFA和ELISA法的比较EHFVH一114、H-435株感染的Verc—E_细胞,经IFA检查,出现强阳性荧光在其感染后第lO天,此时i00%的感染细胞均显示特异性的荧光.
而ELISA法测定病毒释放的高峰期(ELISA法检测碡染细胞上清液中可溶性抗原OD值的最高值)也在病毒感染细胞后的第9~13天,病毒抗啄OD值为1.
27~1.
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而就敏感性而言,相当于标准DNA5Pg所出现的维普资讯http://www.
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讨论目前,用于EHFV0jf究的基因探针多为放放射性同位素标记探针,这种探针特异性强,敏感性高,但是保存期短,使其应用,特别是临床应用受到了一定的限制.
为了对EHFV患者进行基因诊断,并克服放射挂标记探针的某些缺点,我们应用生物素标记系统,对EHFV的基因片段进行标记获得成功,生物素一7-dATP标记的EHFVR株M片段的基因探针与R株的eDNA手u待测的EHFVRNA发生阳性杂交反应.
这说明生物素标记探针可用于EHFV的研究,这种探针还具有放射性标记探针所不及的优点,如操作简便、安全、不需严格的条件,探针可长期保存,应用广泛等.
本研究结果还指出来自子动物源性的EHFVR株M片段R.
克隆探针可与人源性的EHFVH—ll4、H'435株的基因组发生杂反应,这进一步说明动物源性和人源性的EHFV有共同的保守核苷酸序列,R栋的Ra克隆探针可作为EHF的通J=}j探针广泛用于EHF的研究,如EHF的基因诊断,不同毒株间的毒力比较等.
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陈等应用P标记探针检测l1株EHFV,有3株IFA和ELISA均提示弱阳性,而斑点杂交显示强阳性,其余8株病毒两种检测方法结果一致,他认为斑点杂交法较IFA法敏感】.
我们的检测发现病毒RNA在1.
16稀释耐,仍出现阳性杂交信号,相当于5pg标准DNA的杂交信号,证实该法是敏感的.
有关本法对EHF患者临床标本中病毒基因组的检测应用正在进行,将另文报道.
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栩占我等.
陈思毅等,参考文靛eta】.
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1988,病毒学报.
4:2081989,由华医学杂志,B9:621.
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