标记iyunssr

专论与研究中固米2009年第6期利用SSR标记鉴定杂交水稻种子纯度朱玉君毛一剑李春生庄杰云(中国水稻研究所,浙江杭州310006;'通讯作者,E—mail:jzl803@hzcnc.
tom)摘要:用SSR标记和田间观察鉴定了5份杂交稻材料的纯度,其中1份材料采用6个标记和田间观察鉴定同样的158个单株,4份材料分别选用3个标记鉴定200个单株、采用田间观察鉴定另外800个单株.
标记检测和田间观察鉴定结果高度吻合,但不同标记上存在差异,选用3个标记可以较好地平衡效率和可靠性.
关键词:杂交稻种子;SSR标记;表型观察;纯度鉴定纯度是杂交稻种子质量的一个核心指标,其传统鉴定一般以形态性状为基础【l_3】.
DNA标记为水稻品种鉴别和纯度鉴定提供了一种新的手段,其中,SSR(Sim—pieSequenceRepeat)标记由于具有鉴别能力强、重复性高、检测简便等优点,在杂交稻种子纯度鉴定研究中得到了越来越广泛的应用.
不管是人为掺杂验证,还是与田间鉴定比较Ol,以SSR标记为基础的杂交稻纯度鉴定都显示出极高的可靠性.
针对某个特定的杂交稻,往往挑选1个特异性标记鉴定[4-6,9-11】,个别研究以多个标记的平均值为基础川,但均未分析不同标记的具体检测差异.
本研究应用SSR标记检测和田间观察鉴定了5份杂交稻材料的纯度,比较了两种方法的鉴定结果,并分析了不同标记检测结果的差异性.
1材料和方法1.
1水稻材料本研究包含了2个试验.
试验I所用杂交稻品种为中优161,种子由该品种育成者提供;试验II所用品种为中优161和其它3个杂交稻组合(表1),种子由浙江国稻高科技种业有限公司提供.
多态性标记筛选还应用了中优161的父母本材料和其它杂交稻的母本材料.
1.
2田间试验和DNA提取在试验I中,于2008年夏在中国水稻研究所富阳实验基地种植中9A、中恢161和158株中优161,观察杂交稻表型性状的一致性.
此外,移栽一周后,分别取各单株叶片,采用简易法提取DNAt埘,但磨样改用组织碾磨仪.
在试验II中,4个杂交稻及其母本材料的种子于30~C发芽7d,分单株提取DNA;方法同上,每个杂交稻随机选取200株幼苗.
2008年冬至2009年春每个杂交稻在海南省陵水县种植800株,观察杂交稻内部表·24·表1杂交稻组合及用于各品种检测的SSR标记试验I品种名称组合SSR标记中优161中9Ax中恢161II中优161II中优9号Il中新优T95OII协优T950中9Ax中恢161中9Ax中恢9332中新Ax中恢T950协青早Ax中恢T950RM297、RM273、RM19O、M208、RM219、RM19RM297、RM273、RM190RMl195、RM71、RM19RMl195、RM71、RM190RM7l、RM19O、RM2l9型性状的一致性.
1.
3SSR标记检测选取以前推荐的24个SSR标记及相应的检测方法f131,进行亲本多态性检测.
由于中优9号、中新优T950和协优T950均缺父本材料,其父本带型和多态性标记根据母本和杂种F.
代混样的检测结果推定.
选用6个多态性标记检测试验I的158个中优161单株,分别选用3个多态性标记检测试验II中4个杂交稻的各200个单株(表1o2结果和分析2.
1试验I纯度鉴定结果选取亲本问呈多态的6个SSR标记检测中优161的158个单株,结果表明,有157个单株在所有的6个标记座位上均呈现为双亲的互补带型,可判断为真实的中优161.
余下1单株在其中3个标记座位上(RM297、RM208和RM219)呈现为双亲的互补带型,但在另外3个座位(RM273、RM190和RM19)上表现为中9A纯合型,说明该单株为混杂的其它杂合型材料.
收稿日期:2009—07—06基金项目:本文受水稻生物学国家重点实验室自主研究项目和国家水稻产业技术体系资助朱玉君等:利用SSR标记鉴定杂交水稻种子纯度中圈稻米2009年第6期A.
杂株类型1B.
杂株类型2在RM71座位上呈现为母本纯合型,在其它2个标记RM座位上表现正常,1株在RMl195和RM190座位上呈母本纯合型,在RM71座位上表现正常,说明这3株为RM71混杂的其它杂合型材料.
根据这些结果计算,中新优1、950种子样本的纯度为98.
0%.
RM1q检测的200个协优T950个体中,有198株在3个标记座位上都呈现同一种杂合带型,判断为真实的协优T950.
其余2株中,1株在RMI90和RM219座位上呈母本纯合带型,在RM71座位上表现正常,另l株在RMRM71座位上呈父本纯合型,在另2个座位上表现正常,说明这3株为混杂的其它杂合型材料.
根据这些结RM71果计算,协优T950种子样本的纯度为99.
O%.
根据种植于海南的各杂交稻800单株的田间观察RM19结果,中优161、中优9号、中新优T950和协优T950的种子纯度分别为99.
1%、99.
6%、97.
9%和98-3%,与标记检测结果高度一致(表2).
箭头所示为检测到异常带型的植株;图A第一泳道为母本中9A图1应用ssR标记在中优9号样本中检测到的2种杂株类型3讨论田间表型观察结果表明,在种植的158个单株中,只有在标记座位上呈异型的那个单株与其它个体有明显差异.
2.
2试验Ⅱ纯度鉴定结果试验II各杂交稻的检测分别选用3个SSR标记,其中,检测中优161的从试验I的6个标记中选出,检测其它3个杂交稻的分别从F混样呈杂合且包含对应母本等位基因的标记中选出.
结果表明,200株中优161在所用的3个标记座位上全部呈现为双亲互补带型,未检测到杂株,其它3个杂交稻则分别检测到2~4个杂株.
检测的200株中优9号中,有198株在3个标记座位上都呈现同一种杂合带型,判断为真实的中优9号.
其余2株中,1株在3个座位(RM1195、RM71和RM19)上均呈母本纯合型(图1A),据此推测为混杂的母本保持系种子;另1株在RM1195和RM71座位上呈正常带型,但在RM19座位上呈其它杂合带型(图lB),说明该单株为混杂的其它杂合型材料.
根据这些结果计算,中优9号种子样本的纯度为99.
0%.
检测的200株中新优T950中,有196株在3个标记座位上都呈现同一种杂合带型,判断为真实的中新优T950.
其余4株呈现其它带型,其中,l株在3个座位均呈父本纯合型,据此推测为混杂的父本种子;2株本研究应用SSR标记检测和田间观察鉴定了5份杂交稻样品的纯度,在应用同一套158株中优161的试验I中,两种方法的鉴定结果完全一致;在应用同一来源不同种子的试验II中,以200单株标记检测和800单株田间观察分别计算,其纯度中优161为100.
O%和99.
1%、中优9号为99.
0%和99.
6%、中新优T950为98.
0%和97.
9%、协优T950为99.
O%和98.
3%,两种方法亦高度吻合.
这些结果与前人报道一致n1,表明采用SSR标记进行杂交稻纯度鉴定是切实可行的.
SSR标记检测所用标记数是影响鉴定效率和成本的一个关键因素.
从统计学角度看,试验所用的样本数越多,标记数越多,所测的结果就越可靠,但是在实际操作中考虑到实验所需的成本和花费的时间,都希望利用最少的标记就能准确地鉴定种子纯度.
Yashitola等㈣提出,选用1个特异性SSR标记就可有效检测相应杂交稻的种子纯度,在此基础上,再考虑增加标记进一步验证;已报道研究也普遍采用单个特异性标记,并获得可靠结果.
9-1q.
从原理上讲,如果混入的是所鉴定杂交稻的父本或母本材料,则单个标记与多个标记的检测结果将完全一致,但如果混入的是其它杂交稻或由于串粉、亲本混杂形成的杂合型材料,则不同标记座位的检测结果可能出现差异.
本研究应用标记检测到杂株的4份杂交稻中,不同座位间普遍存在差异:试·25·验I中优161的唯一杂株在3个座位上呈正常杂合,在另3个座位上呈母本纯合;在试验II中,中优9号的2个杂株有1个不同座位间不一致,中新优T950的4个杂株有3个不同座位间不一致,协优T950的2个杂株均呈座位间差异.
因此,应用SSR标记进行杂交稻纯度鉴定,有必要应用多个标记.
具体工作中采用多少标记,需要综合考虑待测杂交稻的类型、特异性和时间要求、成本核算等多个因素;从本研究结果看,选用3个标记可以较好地平衡效率和可靠性.
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