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产前遗传学诊断拷贝数变异(CNV)和纯合状态(AOH)数据解读及报告规范的专家共识(征求意见稿)(本稿完成时间:2020-xx-xx)T/GDPMAAxxxx—2020广东省精准医学应用学会团体标准T/XXXICSXxx备案号:2020-xx-xx发布2020-xx-xx实施广东省精准医学应用学会发布T/GDPMAAxxxx—2010I广东省精准医学应用学会(GDPMAA)是广东省组织开展精准医学学术交流、国际交流、人才培养、出版刊物、科技创新、产学研相结合等活动的省级社会团体.
制定广东省精准医学应用学会标准(以下简称:粤精准医标准),满足企业需要,推动企业标准化工作,是广东省精准医学应用学会的工作内容之一.
中国境内的团体和个人,均可提出制、修订粤精准医标准的建议并参与有关工作.
粤精准医标准按《广东省精准医学应用学会团体标准管理办法(试行)》进行制定和管理.
粤精准医标准草案经向社会公开征求意见,并得到参加审定会议的75%以上的专家、成员的投票赞同,方可作为粤精准医标准予以发布.
考虑到本标准中的某些条款可能涉及专利权,广东省精准医学应用学会不负责对任何该类专利权的鉴别.
在本标准实施过程中,如发现需要修改或补充之处,请将意见和有关资料寄给广东省精准医学应用学会,以便修订时参考.
该标准为广东省精准医学应用学会制定,其版权为广东省精准医学应用学会所有.
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广东省精准医学应用学会地址:广东省广州市越秀区天河路45-21号邮政编码:510075电话:020-87001157传真:020-87001157网址:www.
gdpmaa.
com电子信箱:pm@gdpmaa.
comT/GDPMAAxxxx—2010-1-目次前言3引言41范围52规范性引用文件53术语和定义.
54缩略语65检测前知情同意书及产前诊断申请单要求75.
1知情同意书75.
2CMA/CNV-seq产前诊断申请单76CMA/CNV-seq产前诊断的标本质量评估标准86.
1标本的选择86.
2标本合格性判断86.
3产前羊水标本的处理.
86.
4不合格标本处理方式.
87CMA/CNV-seq实验操作的标准化要求88CMA/CNV-seq的室内质控、室间质评要求.
99CNV/AOH的数据分析规范99.
1CMA/CNV-seq数据的质量控制及分析时cut-off阈值设置.
99.
2CNV分类原则.
99.
2.
1总则99.
2.
2致病99.
2.
3可能致病109.
2.
4良性109.
2.
5可能良性109.
2.
6临床意义不明确109.
3AOH分类原则.
109.
4CNV/AOH数据分析流程.
1110CNV/AOH结果报告建议1910.
1概述1910.
2对染色体数目异常的报告建议19-2-10.
3对嵌合体的报告建议.
1910.
4对"良性"或"可能良性"CNV的报告建议1910.
5对"致病"和"可能致病"CNV的报告建议2010.
6对"临床意义不明确"CNV的报告建议2010.
7对意外发现结果的报告建议.
2010.
8外显不全、表现度差异神经发育障碍性疾病易感CNV报告建议2010.
9涉及胎儿性别的CNV报告建议2110.
10对AOH的报告建议2111CNV/AOH报告撰写.
2112报告发放及发放后的工作建议2213疑难病例的多学科会诊22附录A.
24附录B.
26附录C.
28C.
1致病性模板.
28C.
2不明确模板.
33C.
3阴性模板37附录D.
41参考文献42T/GDPMAAxxxx—20203前言本标准按GB/T1.
1-2009给出的规则起草.
本标准由广东省精准医学应用学会提出并归口.
本标准起草单位:广东省妇幼保健院、广州医科大学附属第三医院、中山大学附属第三医院、广州市妇女儿童医疗中心、中山大学附属第一医院、深圳市人民医院、东莞市妇幼保健院、南方医科大学附属南方医院、珠海市妇幼保健院、江门市中心医院、深圳市妇幼保健院、惠州市妇幼保健计划生育服务中心、江门市妇幼保健院、东莞市儿童医院、深圳市宝安区妇幼保健院、广东省第二人民医院、暨南大学附属第一医院、深圳市龙岗区妇幼保健院、中山市博爱医院、广东省人民医院.
本标准主要起草人:尹爱华、刘维强、章钧、卢建、李茹、林少宾、张彦、郭辉、何怡、刘思平、肖鸽飞、吴欣新、赵强、胡文龙、杨芳、郝颖、谢建生、王游声、陈剑虹、唐佳、陆小梅、王辉林、胡亮杉、魏佳雪、刘彦慧、查庆兵、闫瑞玲、魏凤香、张慧敏,陈敏、王德刚、李萍、周祎,罗艳敏、李东至.
本标准首次制定,将根据国内外行业最新发展陆续完善更新.
T/GDPMAAXXXX-20204引言近年来,染色体微阵列分析(CMA,ChromosomalMicroarrayAnalysis)和基于下一代测序(NGS,nextgenerationsequencing)的基因组拷贝数变异测序技术(CNV-seq,CopyNumberVariationSequencing)在产前诊断、儿科、辅助生殖等多个医学领域广泛应用,为临床提供了更丰富、更精准的遗传检测手段.
虽然国内外针对这些技术的临床应用出台了相关指南及专家共识1-6,但各国对这些技术检测结果的报告建议不尽相同7,8.
在产前诊断领域,由于是对未出生胎儿进行遗传学检测且获取到的胎儿表型信息严重匮乏,针对临床意义不确定的拷贝数变异(CNV,CopyNumberVariation)及与检测指征不相符的意外发现等,有些学者认为从尊重受检者知情权、自主权,无害及公平原则出发,应该将检出的变异全部报告9.
反对意见则认为,基于目前医学知识的局限性,报告这些连专业人士也无法判定其临床意义的CNV并不能给遗传咨询提供更加有用的信息,反而会增加孕妇的焦虑和不安,因此认为选择性报告更有利7,10.
目前国内对CMA/CNV-seq的产前应用已有专家共识4,6,但针对具体操作过程中诸如知情告知的细节、数据分析的流程、结果的解读、报告的撰写及遗传咨询等方面均亟需细化.
鉴于此,国内多家已经开展CMA/CNV-seq检测的产前诊断机构或实验室在以国内外最新指南和专家共识为参考的前提下,针对CMA/CNV-seq在产前诊断中的临床应用细节展开讨论,重点对拷贝数变异(CNV)与基因组区域纯合状态(AOH,AbsenceofHeterozygosity)的数据分析流程、报告标准及报告内容等提供技术层面建议,以期达到规范CMA/CNV-seq等技术在产前诊断中的应用进而让更多人受益的目的.
T/GDPMAAxxxx—20205产前遗传学诊断拷贝数变异(CNV)和纯合状态(AOH)数据解读及报告规范的专家共识1范围本标准规定了产前遗传学诊断中,拷贝数变异(CNV)与基因组区域纯合状态(AOH)的数据分析流程、知情同意书、报告规范应包含的内容以及要求.
本标准适用于具备临床产前遗传学诊断资质的医院、第三方医学检验机构或大学诊断实验室等使用染色体微阵列分析(CMA)或基因组拷贝数变异测序技术(CNV-seq)对拷贝数变异(CNV)与基因组区域纯合状态(AOH)的数据分析、结果判读以及报告出具.
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件.
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
国家卫生健康委员会关于印发开展产前筛查技术医疗机构基本标准和开展产前诊断技术医疗机构基本标准的通知(国卫幼函[第2019]297号).
低深度全基因组测序技术在产前诊断中的应用专家共识.
中华医学遗传学杂志,2019,36(4):293-296.
染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用专家共识.
中华妇产科杂志,2014,49(8):570-572.
Technicalstandardsfortheinterpretationandreportingofconstitutionalcopy-numbervariants:ajointconsensusrecommendationoftheAmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics(ACMG)andtheClinicalGenomeResource(ClinGen).
2019.
3术语和定义下列术语和定义适用于本文件.
3.
1染色体微阵列分析chromosomalmicroarrayanalysis;CMA通过高通量特异性核酸探针对染色体全基因组进行高分辨率检测,对染色体的拷贝数变异包括染色体微缺失、微重复等进行检出的一种染色体分析技术.
3.
2基因组拷贝数变异测序技术copynumbervariationsequencing;CNV-seq基于高通量测序技术的全基因组测序方法来检测基因组拷贝数变异检测的一种染色体分析技术.
T/GDPMAAXXXX-202063.
3拷贝数变异copynumbervariation;CNV由基因组发生重排而导致的、一般指长度为50bp以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少.
主要表现为亚显微水平的缺失和重复,是人类疾病的重要致病因素之一.
3.
4基因组区域纯合状态absenceofheterozygosity;AOH基因组区域中呈现的杂合性缺失的现象.
说明:对于大部分的二倍体细胞如人类体细胞,拥有两份基因组,一份来自于父亲,另一份来自于母亲,在某一个碱基上,如果来自父本和母本的碱基不同时,则该区域为杂合(heterozygous).
如果因为某种机制(如缺失或复制错误)导致在该区域只有一类基因组(来自母本或父本),则该区域为基因组区域纯合状态(AOH).
3.
5单亲二体uniparentaldisomy;UPD指来自父母一方的染色体片段被另一方的同源部分取代,或一个个体的两条同源染色体都来自同一亲体.
3.
6最小划分区间bin基于高通量测序技术的拷贝数变异分析中将基因组划分为连续而不重叠的区间的最小单位.
一般分析中会对最小划分区间进行测序序列读数的统计,然后根据分析需要,对这些最小划分区间进行合并计算.
4缩略语以下缩略语适用于本文件.
NT——颈后透明层(NuchalTranslucency)DNA——脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)PCR——聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)chr——染色体(Chromosome)STR——短串联重复序列(ShortTandemRepeat)SNP——单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism)SOP——标准操作流程(StandardOperationProcedure,SOP)DECIPHER——人类染色体不平衡和表型数据库(DatabaseofChromosomalImbalanceandPhenotypeinHumansusingEnsemblResources)OMIM——在线人类孟德尔遗传数据库(0nlineMendelianInheritanceinMan)DGV——人类基因组结构变异数据库(DatabaseofGenomicVariants)ACMG——美国医学遗传学与基因组学学会(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics)T/GDPMAAxxxx—20207ISCN——人类细胞遗传学术语国际命名体制(InternationalSystemforHumanCytogenomicNomenclature)HGVS——人类基因组变异协会(HumanGenomeVariationSociety)FISH——荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization)CCMG——加拿大医学遗传学家学会(CanadianCollegeofMedicalGeneticists)SOGC——加拿大妇产科医生协会(SocietyofObstetriciansandGynaecologistsofCanada)CHPO——中文人类表型标准用语联盟(ChineseHumanPhenotypeOntologyConsortium)5检测前知情同意书及产前诊断申请单要求5.
1知情同意书开展CMA/CNV-seq产前应用知情同意书应至少涵盖以下内容:a)染色体基本知识及染色体疾病、基因组疾病简介;b)技术原理11;c)检测的目的和内容;d)技术优势和局限性12;e)临床适应证4;f)本机构使用的检测平台类型及检测分辨率;g)告知可能获得临床意义不明确的结果,可能需要进行家系验证,可能存在遗传/表型异质性、外显率和表现度的差异等特殊情况而导致对预后及表型预测的困难,以及可能存在检测失败退费情况;h)可能检测到肿瘤易感性变异、迟发性疾病相关的CNV10及临床意义不明确的AOH,告知是否书面报告此类结果;i)在不涉及病人隐私及利益的前提下,标本和数据有可能用于非商业目的的医学科研用途及论著发表;j)临床医生、孕妇及家属签字(知情同意书模板请见附录A).
5.
2CMA/CNV-seq产前诊断申请单申请单应涵盖但不限于以下内容:a)受检者基本信息:姓名、年龄、民族、唯一识别号、联系电话、申请科室、申请医生、申请日期、样本类型、临床初步诊断等;b)病史信息:妊娠史、孕产史(有无畸胎、流产、死胎及死产等)、既往史、家族史及既往检测结果等;c)胎儿超声或磁共振信息:NT或超声软指标情况、胎儿超声结构情况(按组织系统进行结构分类,最好以中文人类表型标准用语联盟CHPO标准术语描述表型信息)以及是否存在宫内生长受限和羊水量异常等;d)标本信息:注明标本类型是羊水、绒毛、脐血、外周血、流产组织等;e)检测内容:所使用的检测平台、主要试剂和分析软件;f)标本的接收情况:实验室核对申请单及标本,判断标本采集是否合格,核查取样医生、取样时间、接收人和接收时间(申请单模板请见附录B)T/GDPMAAXXXX-20208注:由于胎儿表型信息主要以超声等影像学检查结果作为参考依据,因此超声表现及检测原因等信息收集极为重要.
根据指南及专家共识推荐,有一个或多个器官结构异常或颈后透明层(NuchalTranslucency,NT)厚度≥3.
0毫米的胎儿建议行CMA/CNV-seq产前诊断;对于胎儿结构未见异常,但因其它因素选择介入性产前诊断的孕妇,CMA/CNV-seq或核型分析均可选择2,3,6.
常见的胎儿超声结构异常包括但不限于以下内容:心血管异常、中枢神经系统异常、囊状水瘤/积液、先天性颅面部/颈部畸形、腹壁缺损、胃肠异常、泌尿生殖系统异常、肢体/指趾异常、羊水过多/过少、肺/胸/胸廓/膈异常、内脏反转等.
对于高龄妊娠、血清学筛查异常、夫妻双方之一有相关疾病家族史、超声软指标异常(包括鼻骨缺如或发育不良、脉络丛囊肿、肠管回声增强、心脏强光点、宫内生长受限、轻度肾盂分离、轻度侧脑室增宽及单脐动脉)等情况,CMA/CNV-seq较核型分析技术能提供更高的异常检出率8,13.
6CMA/CNV-seq产前诊断的标本质量评估标准6.
1标本的选择为避免细胞培养过程可能对细胞产生偏好性选择的影响14,15,应用原始标本提取DNA后直接检测.
6.
2标本合格性判断判断产前标本是否合格的一个重要指标是提取后的DNA质量和浓度及有无母源DNA污染,同时需参考以下经验进行判断:a)产前羊水标本:清亮,离心后细胞沉淀足量且无肉眼可见的血污染;b)产前绒毛标本:显微镜下可见绒毛,短串联重复序列(ShortTandemRepeat,STR)实验证实标本为胎源性;c)产前脐血标本:STR或脐血血红蛋白电泳证实标本为胎源性;d)流产或死胎组织标本:建议尽早取材,对死胎或流产时间未知的标本以提取的DNA是否严重降解及DNA质量来判断.
e)所有行CMA/CNV-seq的产前诊断标本均建议进行STR或SNP分型等检测方法以排除母源性DNA污染.
6.
3产前羊水标本的处理产前羊水标本经常可见咖啡色样或肉眼血色,此类标本需培养后提取DNA进行后续检测.
6.
4不合格标本处理方式不合格的标本须退回或拒收,包括但不局限于以下情形:a)严重腐败的流产组织标本、已无法提取DNA或使用福尔马林浸泡的标本;b)绒毛、脐血标本:经验证存在严重的母源污染且无法去除、非胎源性标本或提取的DNA质量不合格;c)使用肝素抗凝等可能导致PCR扩增失败的标本(实验如果包含PCR步骤).
7CMA/CNV-seq实验操作的标准化要求T/GDPMAAxxxx—20209不同的CMA/CNV-seq实验平台均应当建立相应的实验室标准操作流程(StandardOperationProcedure,SOP),技术人员应当严格遵照SOP执行.
8CMA/CNV-seq的室内质控、室间质评要求开展CMA/CNV-seq产前遗传学检测的单位在项目开展前需对CMA/CNV-seq平台进行性能验证,严格执行室间、室内质控要求.
室内质控要点包括严格按照SOP对每批次实验关键环节进行质控,对仪器进行定期维护及校准,对人员定期培训及考核等.
要求参加每年度国家卫健委临检中心组织的室间质评能力验证,建议组织和参加CNV/AOH数据解读能力的室间比对,不同实验室针对相同的表型和基因型信息进行结果的解读和报告撰写,以评估实验室对数据的分析和解读能力.
9CNV/AOH的数据分析规范9.
1CMA/CNV-seq数据的质量控制及分析时cut-off阈值设置首先对得到的数据进行质控判断.
不同实验室应根据自己选用的平台建立经内部验证过的数据质控标准及SOP文件.
对进入分析流程的数据,建议根据不同平台预设的探针数目和/或片段大小阈值进行数据初步分析.
国内大多数已开展CMA/CNV-seq产前诊断的实验室在数据分析时多以100Kb(CNV-seq平台)及25-50条探针、100Kb(SNParray平台)或连续3个探针信号(ArrayCGH平台)为阈值进行CNV结果的初步过滤,阈值设定过小可能带来更多不确定或假阳性结果16-18.
这里的cutoff阈值指的是数据分析所得到的存在统计学显著性的DNA片段大小,b指代base,即一个碱基,Kb是1000个碱基的单位,Mb是100万个碱基的单位.
对于AOH,建议以5Mb设置数据过滤条件19.
考虑到不同的平台探针密度和检测原理不同,对阈值的设定需在报告中明确说明.
另外,非SNP探针的CMA平台及CNV-seq技术不能检出AOH,需在知情同意书及报告中说明.
9.
2CNV分类原则9.
2.
1总则CNV原则上按国际标准进行五分类(致病、可能致病、临床意义不明确、可能良性、良性)20,21.
对CNV分类的判断主要依据包括CNV是否涵盖蛋白编码基因或重要调控元件,蛋白编码基因的数量及所含基因或区域的剂量敏感性、文献报道、ClinVar、ClinGen、DECIPHER、OMIM等数据库报道情况、实验室内部数据库收录情况、人群频率(DGV/DGV-gold/gnomAD数据库)、病例-对照研究的统计学差异情况、疾病遗传方式(显性或隐性遗传)和亲源性(新发或遗传自父母)等20-23.
9.
2.
2致病多篇文献明确了致病性,即使该CNV外显不全、表现度有差异也应判断为致病,以及以下情况:a)一段缺失或重复与一个已报道的微缺失/微重复综合征致病区域在位置和大小上匹配;b)或缺失中包含因单倍剂量不足敏感基因、重复中包含三倍剂量敏感基因(ClinGen剂量T/GDPMAAXXXX-202010敏感分数3分);c)或按ClinGenCNV综合评分网站(http://cnvcalc.
clinicalgenome.
org/cnvcalc/)21得分大于0.
99分.
9.
2.
3可能致病有强有力的证据表明它们致病的可能性非常大,但目前的证据尚不足以完全确定其致病性,包括以下情况a)涉及已知单倍剂量不足敏感基因5'端(及其他编码序列)的缺失(在已知不存在其他转录起始位点的情况下);b)涉及已知单倍剂量不足敏感基因多个外显子(包括基因3'端)的缺失;c)涉及多篇病例报道的基因缺失或重复,其表型一致且高度特异或者按ClinGenCNV综合评分网站得分介于0.
90~0.
98分21.
9.
2.
4良性多篇文献已证实或权威数据库报道为良性变异,特别是良性特性已经非常明确或是常见的多态性片段,包括:a)涉及的CNV在DGVgold数据库的频率>1%;b)按ClinGenCNV综合评分网站得分小于-0.
99分21.
注:需要强调的是,对良性CNV的剂量效应要仔细分析,例如,某些片段的重复可能是良性的,而相同区段的缺失则可能具有临床意义.
9.
2.
5可能良性有较强证据表明该CNV很可能与孟德尔疾病不相关,但目前还没有达到足够"良性"的证据.
这类变异包括:a)普通人群中多次被观察到,但频率未达1%;b)在病例组和对照组中无显著统计学差异;c)按ClinGenCNV综合评分网站得分介于-0.
90~-0.
98分21.
9.
2.
6临床意义不明确不符合以上任何一类的CNV,是一个范围广泛的分类,其中一些可能在以后通过额外的证据将被证实为致病性或良性的CNV.
主要包含以下情况:a)CNV片段大小超过实验室制定的报告阈值,但该CNV内不包含基因;b)CNV在普通人群中有出现,但频率不高,不足以被认为是多态性;c)CNV包含少量基因,但尚不清楚基因是否对剂量敏感;d)文献或数据库对此CNV的分类存在争议;e)单个基因内的CNV,其是否对转录阅读框有影响尚不清楚;f)按ClinGenCNV综合评分网站得分介于-0.
89~0.
89分21.
9.
3AOH分类原则如果仅在一条染色体发现≥10Mb的AOH,应优先考虑单亲二体(uniparentaldisomy,UPD)T/GDPMAAxxxx—202011可能3,19.
UPD从产生机制分析主要包含第一次减数分裂同源染色体不分离产生的单亲异二体(heterodisomy)和第二次减数分裂姐妹染色体不分离产生的单亲同二体(isodisomy)两种情况.
SNParray平台只能检测出isodisomy,因此,在chr6、chr7、chr11、chr14、chr15、chr20染色体检出大片段AOH时,即使印记基因不在AOH区域内,也应进行UPD验证(可使用Methylation-SpecificMultiplexLigation-dependentProbeAmplification,MS-MLPA或家系CMA/STR分型等方法)24.
若AOH已被验证为UPD,并且该UPD涉及可导致明确表型的相关疾病,则报告为致病UPD.
若排除了UPD可能,则归类为临床意义不明确AOH24.
此外,AOH区域需考虑潜在的孟德尔隐性遗传疾病,尤其是16号染色体短臂1区3带(16p13.
3)区域的AOH,由于南方人群alpha地中海贫血疾病基因变异携带率高,其潜在的患病风险应给予重视.
9.
4CNV/AOH数据分析流程综合国内外指南、共识1,10,20及各单位临床经验尤其是美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和临床基因组资源机构(ClinGen)2019年联合发布的共识建议21,对产前CNV/AOH数据分析参考流程建议如下:a)染色体数目判断:首先对染色体数目进行判断,是否三倍体、非整倍体等;b)判断是否存在嵌合体情况;c)判断CNV是否属于良性:可检索ClinGen-curatedbenign、DGV-gold及gnomAD数据库25等分析检测到的CNV是否与已知的良性CNV区域完全重叠或被其完全覆盖,数据库见附录D;d)判断是否为明确的致病CNV:查询DECIPHER、ClinGen、ClinVar、GeneReviews等数据库及PubMed已发表文献,分析检测到的CNV是否与已知明确的致病性CNV区域完全重叠或完全覆盖;e)对非明确良性、非明确致病性CNV或经以上步骤未能确定类别的CNV,建议进行综合得分评估21:分析CNV区域内包含的基因组内容,是否包含蛋白编码基因或调控元件、是否包含剂量敏感基因或区域、蛋白编码基因的数量等,检索已发表的文献,公共数据库和/或内部实验室数据库分析是否新发CNV、有无家系共分离证据、有无病例-对照研究数据以及分析CNV的遗传模式或亲本来源等;f)对AOH进行分析.
具体流程及判断标准请参见图一及表一.
T/GDPMAAXXXX-202012图一CNV/AOH数据分析流程图T/GDPMAAxxxx—202013表1CNV/AOH数据分析步骤及判断参考标准步骤分析流程判断标准结论报告内容可选报告内容备注及ClinGenCNV综合评分标准0.
99致病(P)1染色体异常评价三倍体、非整倍体等染色体疾病片段大小、具体位置,疾病或综合征名称简要描述主要症状对发现的非整倍体、三倍体等直接报告为**综合征或三倍体或单体嵌合体判断信号明显或/和Allelepeak分离直接描述嵌合情况大于30%以上嵌合必须报告,文献报道情况,可能引起的疾病及相关表型描述10%-30%之间的嵌合,依据实验室经验自行决定是否报告10%以下的嵌合体检测可能不准确,不建议报告;不同比例的嵌合及不同胚层的嵌合导致的表型不一,遗传咨询较困难2判断是否明确的良性CNV多篇文献报道明确良性;片段≤DGVgold或ClinGenCuratedbenign或gnomAD片段(必须符合人群频率>1%);或其他符合ACMG指南的CNV,或CNV评分小于-0.
99分良性Benign(B)不推荐报告检索DGV-gold/或PubMed/ClinGen/gnomAD等数据库3判断是否明确的致病性CNV待检片段长度≥DecipherCNVSyndrome片段或ClinGenPathogenicCNVregions相关区域,含剂量敏感基因或区域,剂量敏感分数3分或其他符合ACMG指南的致病CNV;或CNV评分大于0.
99分.
致病Pathogenic(P)片段大小、具体位置,包含多少基因,主要致病基因,疾病或综合征名称和症状,剂量敏感分数,文献及数据库收录情况等①检索DecipherSyndrome数据库,ClinGen数据库PathogenicCNVregions及ClinGenDosageSensitivityCurationPage、GeneReviews等数据库.
②神经发育障碍类疾病易感CNV或其它外显不全CNV在人群携带率相对较高,但其本身仍是致病性/可能致病性CNV.
T/GDPMAAXXXX-202014步骤分析流程判断标准结论报告内容可选报告内容备注及ClinGenCNV综合评分标准0.
99致病(P)③gnomADpLI指数≥0.
9且DECIPHER数据库HaploinsufficiencyScore(HIindex)0.
99致病(P)0.
45分大于35/50个蛋白编码基因,得分0.
90分4.
3数据库及文献检索有相关报道多篇文献报道致病,检出片段断点相同,或断点虽然不同,但是包含相同的疾病关键区域或关键基因;缺失引起的基因剂量不足或重复引起的剂量过表达导致显性遗传病或CNV评分大于0.
99分.
致病Pathogenic(P)片段大小、具体位置,包含多少基因,主要致病基因,疾病名称和症状,剂量敏感分数,文献及数据库情况结合重复、缺失与获得功能(Gainoffunction)、丧失功能(Lossoffunction)致病机制进行致病性判断;是否新发CNV,与所报道的表型是否一致:分析是否有病例对照研究数据,数据是否有统计学意义;评分标准参考ClinGen网站CNV评分规则T/GDPMAAXXXX-202016步骤分析流程判断标准结论报告内容可选报告内容备注及ClinGenCNV综合评分标准0.
99致病(P)涉及已知单倍剂量不足敏感基因5'端(及其编码序列)的缺失(在已知不存在其他转录起始位点的情况下);涉及已知单倍剂量不足敏感基因多个外显子(包括基因3'端)的缺失;涉及多篇病案报道的基因缺失或重复,其表型一致且高度特异;或CNV评分介于0.
90_0.
99分.
可能致病LikelyPathogenic(LP)片段大小、具体位置,包含多少基因,主要致病基因,剂量敏感分数,疾病名称和症状,文献及数据库情况CNV超过实验室报告的片段大小阈值,但该不包含任何基因;CNV在普通人群中有描述,但频率不高,不是多态性;CNV区域包含少量基因,但尚不清楚基因是否剂量敏感;多篇文献或多个数据库对此CNV分类存在争议,尚无明临床意义不明确VOUS片段大小、具体位置,涉及基因或疾病名称,文献报道情况,本次发现与已报道CNV的差异情况,剂量敏感情况,数据库收录情况缺失0.
99致病(P)确结论;单个基因内的CNV,其是否对转录阅读框有影响尚不清楚;单篇文献报道,断点为明确位点,表型与疾病不相符;CNV评分介于-0.
89_0.
89分.
意义不明确CNV的报告阈值,但必须在报告中注明含有基因的变异在正常人群中多次观察到,但发生率未达1%;变异在病例组和对照组无显著统计学差异或CNV评分介于-0.
90_-0.
98分.
可能良性LikelyBenign(LB)不报告4.
4本次检测观察到的CNV的遗传模式或来源分析胎儿是否存在表型,表型是否特异,是新发还是遗传,是否遗传自相似表型或无表型的父母等明确有无家族史,CNV是否遗传自父母一方或CNV有无家系共分离并具有一致的表型,综合评分参见ClinGen评分系统父母先证者表型和基因型信息齐全时,用ClinGen评分第5部分ABCD中的证据.
如果表型和基因型信息不是所有人都齐全而无法家系共分离时,用5E证据;如果无法检测父母时则用5F-5H的证据.
5AOH判断以5Mb为阈值进行AOH的分析,观察AOH是同时分布在多条染色体还是仅在一条染色体上存在T/GDPMAAXXXX-202018步骤分析流程判断标准结论报告内容可选报告内容备注及ClinGenCNV综合评分标准0.
99致病(P)5.
1UPD验证chr6、chr7、chr11、chr14、chr15、chr20仅其中某一条染色体上存在≥5Mb(位于染色体末端)或≥10Mb(非染色体末端)的AOH而其他染色体上未见AOH时建议报告AOH并提示进行UPD检测AOH大小、具体位置,涉及印记基因相关疾病名称及主要基因和表型,文献及数据库收录情况建议对chr6、chr7、chr11、chr14、chr15、chr20上AOH进行UPD验证,验证为UPD时报告致病,未验证情况建议报告为"可能涉及UPD疾病的AOH",并提示UPD验证;16p13.
3区域的AOH南方人群需关注alpha地中海贫血疾病纯合变异5.
2临床意义不明确不建议报告临床意义不明确的AOH.
如果AOH区域包含可导致严重后果的孟德尔隐性遗传病相关基因且超声提示的表型与该疾病相符或有相关疾病家族史时,建议报告AOH且提示行额外检测AOH片段总长大于等于常染色体片段总长的6.
25%,建议在报告中告知"纯合状态的片段较多,隐性遗传病的发病风险增高"对AOH区域内的AR疾病及基因可查询https://www.
gena.
tech/网站T/GDPMAAxxxx—20201910CNV/AOH结果报告建议10.
1概述CNV/AOH结果的描述方式应符合人类细胞遗传学术语国际命名体制(ISCN)或人类基因组变异协会(HGVS)规范.
通过CMA/CNV-seq技术检测到的CNV片段大小与探针分布(CMA)和计算方法(CNV-seq)有关.
CMA检出的CNV真实断点可能位于拷贝数异常信号的最边缘探针位置和与其相邻的正常拷贝数信号的探针位置之间,因此真实CNV大小存在最小片段范围(以检测到CNV的探针位置来定义)和最大片段范围(以与检出的CNV探针以外相邻的另一个探针位置来定义).
报告中的CNV片段范围建议按照最小和最大片段分别描述.
如检出的CNV的边缘位置恰好位于致病基因上且有可能因片段大小定义而影响报告解读时,建议在报告中说明,并注明推荐采用更高分辨率的方法予以确认真实断点.
CNV-seq在计算CNV范围时受到最小划分区间(bin)的算法影响,真实断点可位于CNV末端前后两个bin内任意位置,建议在报告中标注最大及最小CNV范围;如仅报告单一CNV范围时需在附注内说明真实断点的偏移区间.
当CNV-seq测到的CNV边缘位置恰好涉及关键基因时,说明方式同CMA结果.
应用过程中经常能检出与检测指征或表型不相符但具有临床意义的CNV,特别是一些外显率低的神经发育障碍类疾病易感的CNV.
由于这类CNV外显率低、表现度差异大,且相关的绝大多数表型无法通过产前超声或影像学检查发现,对此类CNV表型与基因型的关联解释及胎儿预后的判断都存在挑战,因此国外有文献不建议报告7或根据受检者自主选择进行选择性报告9.
本着有利于疾病早发现、早干预,有利于出生缺陷防控,有利于医患双方开展遗传咨询的原则,综合国内外指南、共识及各单位经验的基础上提出以下报告建议.
10.
2对染色体数目异常的报告建议对检出的染色体数目异常,直接报告,如三倍体、21三体等.
10.
3对嵌合体的报告建议不同平台所能检测的嵌合体的种类、片段大小及嵌合比例并不相同,建议在报告中说明所用平台的检测范围.
检测结果提示≥30%的嵌合体时需要报告;对于10%-30%之间的嵌合,依据实验室所用平台和既往经验自行决定是否报告.
10%以下的低比例嵌合因技术局限性,可能存在较多不确定性,不建议报告.
如临床表型支持低比例嵌合,建议报告并提示结合荧光原位杂交(FISH)或核型分析等进行验证.
10.
4对"良性"或"可能良性"CNV的报告建议建议不报告此类CNV,但需在知情同意书中注明并告知.
T/GDPMAAXXXX-20202010.
5对"致病"和"可能致病"CNV的报告建议检出"致病性"或"可能致病性"CNV时,在确保数据可靠的情况下,不论片段大小均应报告,并注明分类依据、片段大小(根据边界探针间隔确定的最小区域和最大区域)、涉及的关键基因、相关临床表型及外显率(针对外显不全的基因).
建议描述该CNV与临床表型的关系(若胎儿尚无明确表型或该CNV相关表型在胎儿期无法检测,可不描述).
示例1:检测到可以解释受检者临床指征的致病性或可能致病性CNV;示例2:检测到与受检者临床指征不相符的致病性或可能致病性CNV,需进一步描述并提示该CNV为意外发现、携带者状态或其它情况;示例3:检测到具有低外显率和表现度差异的致病性或可能致病性CNV时应提示该CNV不一定导致受检者出现临床症状,但不能否定CNV的致病性或可能致病性分类.
10.
6对"临床意义不明确"CNV的报告建议对临床意义不明确的CNV,建议报告大于1Mb的重复和大于500Kb缺失.
报告内容建议包括CNV涉及的OMIM基因(如有)及片段的ClinGen剂量敏感评分情况(如有).
小于1Mb的重复和小于500Kb缺失的临床意义不明确CNV参考2018年CCMG-SOGC指南可以不报告3,建议有能力的实验室根据经验、专业判断能力、对数据的解读能力及遗传咨询能力,自行谨慎报告此类CNV.
10.
7对意外发现结果的报告建议实验室及临床应根据知情同意内容及遵循相关国内外指南3,7,20,决定是否报告意外发现的结果.
a)参照ACMG推荐的外显子组测序中的59个意外发现基因,对于累及其中明确存在缺失/重复致病模式的CNV进行报告(剂量敏感分数3分)27,但对涉及成人期发病、肿瘤易感类基因的CNV不建议报告;b)可导致严重疾病的意外发现必须报告(如15q11.
2q13.
1区域的微缺失导致的Prader-Willi或Angelman综合征);c)可进行医疗干预的高外显率的意外发现,建议报告28;d)建议对非常明确的CNV为致病原因的隐性遗传疾病或群体携带率高(1/50)的隐性杂合状态CNV(如16p13.
3区域HBA1/HBA2基因杂合缺失,SMN1基因杂合缺失等),报告为致病变异携带状态;其他常染色体隐性杂合CNV不推荐报告,除非胎儿超声或影像学证据提示其表型与区段内某个基因导致的疾病表型相符或夫妇一方有相关疾病家族史.
10.
8外显不全、表现度差异神经发育障碍性疾病易感CNV报告建议神经发育障碍性疾病易感CNV存在外显不全和表现度差异,此类CNV是产前遗传咨询的难点.
国外有文献建议对某些低外显率CNV在产前不予报告7,也有文献建议不管外显率高低均应报告9.
在遵循患者知情同意和自主选择及报告致病性CNV原则的指导下,建议报告此类CNV,但必须在报告中对CNV进行详细分析,评估可能发病的风险和概率,对可能导致的疾病的最好和最坏结局T/GDPMAAxxxx—202021进行分析.
进行亲代验证CNV来源虽然尚不足以完全、可靠地评估胎儿预后,但有助于再发风险的评估.
部分神经发育障碍性疾病易感CNV可参见参考文献7,10,29,30.
10.
9涉及胎儿性别的CNV报告建议除非有家族史且涉及严重后果(如无精等)或多发缺失/重复等涉及重排的情况,否则Y染色体的大片段CNV不建议报告(如不报告单纯AZFc区域缺失).
对于女胎中发现的X隐性杂合缺失CNV,除非有相关严重疾病家族史或涉及可导致严重疾病的基因报告致病携带状态外,其他不建议报告.
10.
10对AOH的报告建议a)涉及chr6、chr7、chr11、chr14、chr15、chr20其中某一条染色体上存在≥5Mb(位于染色体末端)或≥10Mb(非染色体末端)的AOH而其他染色体上未见AOH时,建议报告并提示进行UPD检测.
b)原则上,对临床意义不明确的AOH不建议报告.
如果AOH区域包含可以导致严重后果的孟德尔隐性遗传病相关基因且超声提示的表型与该疾病相符或有相关疾病家族史时,建议报告且提示行额外检测(如外显子测序)以排除潜在的隐性遗传致病基因纯合(或半合)变异事件.
c)如检出多条染色体上均存在大片段AOH时需考虑父母亲缘关系(consanguinity).
常染色体上AOH片段长度总和在基因组中所占比例可以反映胎儿父母亲缘关系:25%左右的比例提示一级亲缘关系,12.
5%左右的比例提示二级亲缘关系,6.
25%左右的比例提示三级亲缘关系26.
计算方法:常染色体上≥5Mb的AOH总和除以2875Mb(所有常染色体大小总和,GRCh37/h19).
若该比例大于或接近6.
25%,建议在报告中注明"基因组大片段纯合状态较多,常染色体隐性遗传病的发病风险增高";小于三级亲缘关系不建议报告.
d)采用ArrayCGH或CNV-seq技术通常无法检测到AOH,应在报告检测范围中告知,并说明"如胎儿存在UPD风险或父母有较近亲缘关系风险时,建议采用相应方法检测"等.
AOH的分析及报告标准请参见表一.
11CNV/AOH报告撰写CNV/AOH报告的规范撰写对临床医生和病人解读报告及后续的遗传咨询起着非常关键的作用.
建议CNV/AOH报告至少应该涵盖以下几个要点:a)完整的报告抬头;b)基本信息部分:样本或芯片编号;受检者姓名(不能直接使用孕妇姓名,可标为某某胎儿或用姓名加标本类型,如某某羊水);孕妇年龄;ID号;送检科室;申请医生;送检标本类型;送检时间;c)临床诊断:超声或磁共振信息,临床诊断的疾病名称;d)检测内容部分:应包括检测方法、仪器平台、CNV大小(建议根据边界探针间隔报告最小区域和最大区域)、拷贝数状态(拷贝数增加或缺失)和基于特定参考基因组的具体线性坐标(第几号染色体,ISCN或HGVS标准全名系统报告).
建议将检测到的致病性T/GDPMAAXXXX-202022CNV、AOH截图并报告;e)对检测到CNV的解释:应写明检测到的CNV涉及的主要致病OMIM基因、基因或区域的剂量敏感分数、可能引起的疾病及相关的表型,各主要数据库的收录情况,列出密切相关的PubMed文献PMID号;对于不完全外显、表现度差异CNV,应提供相关证据;f)报告结论:对检出的非整倍体、三倍体等直接报告综合征名称,如21三体;对检测到的CNV/AOH/嵌合需明确其是致病性、临床意义不确定还是其他等.
需要强调的是,致病性CNV可能由于遗传异质性、外显不全或表现度差异并不一定会在个体上表现出疾病表型,需在报告中明确注明这一点;g)遗传咨询建议:对CNV、AOH结果给出后续建议,如治疗方案、疾病管理、再发风险或进一步检测手段等;h)报告注释部分:在报告最后,应该列出实验室报告CNV、AOH和嵌合比例等的阈值下限,使用的平台、芯片类型等,检测技术的局限,使用的主要数据库信息及时效性、分析用的软件、使用的基因组参考序列(e.
g.
GRCh37),实验室或医生联系方式等.
报告模板请见附录C.
注:建议将报告分为几个部分,与就诊原因(临床指征)相关的主要变异需与携带者状况及意外发现等分开描述.
12报告发放及发放后的工作建议12.
1报告经实验室双人核对,其中一人进行第一轮分析结果及报告,一人进行再次结果审核,建立报告记录表,双人审核签字后再将报告交由临床医生.
报告发放前建议与临床医生一起进行讨论,结合超声/磁共振等表型与CNV/AOH结果,将当批次所有报告逐一审核,重点针对临床意义不明确、涉及外显不全、表现度差异神经发育障碍性疾病易感CNV、嵌合体等情况进行讨论.
实验室、临床均无异议后由临床医生签字发放.
12.
2建议建立完善的随访体系,追踪携带致病、可能致病CNV的胎儿结局,重点对携带临床意义不确定、外显不全和表现度差异类CNV的胎儿安排相关人员进行后期随访(包括但不限于妊娠结局、出生后的情况,智力发育生长发育等情况).
建议在孕24周左右(三维彩超情况)、生后3-6个月及生后3岁进行三次随访.
如果孕妇终止妊娠或流产,尽量追踪到尸解报告等形态学资料.
12.
3建议实验室定期更新内部和外部数据库,对于可能致病和临床意义不确定CNV进行定期回顾分析.
13疑难病例的多学科会诊建议有条件的单位建立由遗传学、产前诊断分子实验室、产前诊断临床医生、其他相关临床科室及影像学等多学科、多专业副高级职称以上专家团队的多学科合作诊断模式,对疑难病例的数据、资料和报告进行合作分析,并与家属进行良好的沟通和遗传咨询.
总之,CMA/CNV-seq技术在产前诊断领域有良好的应用价值,但技术本身存在局限性,目前T/GDPMAAxxxx—202023医学知识关于CNV/AOH的认知存在盲区,对CNV/AOH数据分析及报告撰写的标准化和规范化有利于临床医生和孕妇及家属更好地解读结果.
应在遵循知情同意、自主选择的原则下结合临床遗传咨询有序、规范开展CMA/CNV-seq技术的产前临床应用.
T/GDPMAAXXXX-202024附录A(规范性附录)知情同意书模版XXXX医院产前遗传学诊断拷贝数变异和纯合状态检测知情同意书(以CMA为例参考)1、基本知识:染色体是细胞核中载有遗传信息的物质,正常人体细胞具有23对染色体,包括22对常染色体和1对性染色体.
染色体携带众多基因,决定着细胞功能及个体的发育.
染色体数目增多、减少或局部发生微缺失微重复,是导致胎儿流产、胎儿组织器官畸形、出生后智力低下、生长发育迟缓、先天畸形等问题的重要原因之一.
染色体微阵列分析(CMA)产前遗传学检测是通过将胎儿遗传物质信息与正常样本或正常人群遗传物质参考序列进行比较,利用遗传学方法检测染色体数目异常及微缺失/微重复的技术.
2、检测目的和内容:通过对23对染色体的数目、微缺失/微重复及纯合状态(AOH)等进行检测,以发现可能影响临床表型症状的遗传物质变异.
3、CMA技术优势:(1)CMA可检出三倍体、整条染色体数目增多或减少的非整倍体、大片段缺失/重复及全基因组范围内100Kb甚至更小的拷贝数变异,而传统的细胞染色体核型分析方法只能分辨5-10Mb以上的变异;(2)相对核型技术,CMA能提高7%-15%的异常检出率;(3)含有SNP探针的CMA还可检测出纯合状态AOH、单亲同二体UPD这些与疾病相关或可能相关的变异.
4、CMA技术局限性:(1)不能检测染色体平衡易位、倒位及复杂重排和低比率的异常嵌合(30%5.
7CNV30%5.
7CNV30%5.
7CNV<500kb<1MbCNVAOHAOH5.
8CNVCNV5.
9****GRCh37T/GDPMAAXXXX-2020405.
10漏诊情况5.
11DB44/Txxxx—201x41附录D(资料性附录)CMA数据分析常用数据库CNVInterpretationScoringRubric:(http://cnvcalc.
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